Name: Electroeluting的DNA碎片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学习电洗脱技术纯化DNA片段，该方法利用DNA负电荷特性，通过高盐屏障截留目标片段，回收效率可达75%至80%，适用于多种来源和不同大小的DNA样品纯化，成本低廉且效果可媲美商业试剂盒。

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Bermudez 博士实验室的工作由 Conacyt（资助号 #82622）提供资金支持。我们感谢 Gabriela Gutierrez-Sosa、Eliuth Reyes-Martinez 和 Ximena Rodriguez-Torres 为电洗脱步骤的视频录制工作。

<ol>
	<li>为了选择需要纯化的目标DNA片段，应将样品在含有溴化乙锭的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离，电泳条件为使用0.5×TBE缓冲液（Tris硼酸盐，EDTA），120伏电压，运行1小时。实验中使用约700 ng经NdeI和HindIII酶切后的pProEx-GdMre11S质粒（6000 bp），以释放一个900 bp的片段（质粒部分为560 ng，片段部分为84 ng）。</li>
	<li>电泳洗脱槽（图1）应加入0.5×TBE缓冲液，使两侧中段平台的液体量相等，注意避免将缓冲液溅至中段平台。</li>
	<li>将选定的条带（或条带）从凝胶中切下，放入加样孔中，尽可能靠近V通道（每孔放置一片）。每个样品室中应加入电泳缓冲液，用量以刚好覆盖凝胶条带为宜。</li>
	<li>每次使用的V通道必须用巴斯德移液管冲洗，以清除任何滞留的气泡。</li>
	<li>然后加入100 μl 10 M NH₄OH4 乙酸盐（为便于观察，加入少量溴酚蓝，仅需足以染色即可）被轻轻加入V形通道内。</li>
	<li>应轻柔地关闭盖子，以防止高盐缓冲层重新悬浮。</li>
	<li>电洗脱以100伏电压开始，持续25分钟。</li>
	<li>电洗脱完成后，从V型槽中取出400 μl，转移至微量离心管中，加入两倍体积的冷乙醇和糖原（建议添加以提高DNA回收率）进行沉淀。 4 ° C 1小时或过夜。</li>
	<li>离心20分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤。</li>
	<li>干燥管并用OD 260 nm定量DNA。</li>
	<li>回收率为75%（在V型通道上加入84 ng时回收到63 ng）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="电泳图解，凝胶切片位于V型槽中，阳极到阴极的装置，DNA分离过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 电洗脱装置示意图。电泳槽两侧分别标示出阳极和阴极，含有DNA的凝胶切片（图中以黑色方块表示）因其带负电荷而向阴极迁移，随后被截留在位于V型槽中的盐垫层（图中以倒置的黑色三角形表示）内。

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

运行时间在很大程度上取决于片段的大小，通常对于不超过 20 kb 的片段，50 分钟至 1 小时已足够；而对于较小的片段，则需每 10 分钟用紫外光监测一次，以防止片段穿过盐垫层进而进入阳极缓冲室，导致回收率降低。必须确保当电源设置为 100 伏时，电流至少达到 10 mA。可通过使用紫外手持灯观察 DNA 条带，检测其何时离开凝胶切片。盐垫层也可使用 3 M 醋酸钠配制。
该方法可纯化不同大小的 DNA 或 RNA 片段，回收率较高（约 80%），所得片段可用于放射性标记、限制性内切酶消化、修饰酶处理等后续操作。

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 乙酸盐</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>电泳&amp;#8211;luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

电泳洗脱dna片段

Electroeluting DNA Fragments

纯化的DNA片段在分子生物学中有多种用途，可通过多种方法制备。大多数方法需要先对DNA片段进行电泳，以分离出目标条带。随后，将该条带从琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中切下，并通过以下方法之一进行纯化：玻璃或二氧化硅颗粒的结合与洗脱、二乙氨基乙基（DEAE）-纤维素膜、"压碎浸泡法"、电洗脱，或通常较为昂贵的商业纯化试剂盒。因此，方法的选择主要取决于实验室现有的条件。电洗脱法能够获得非常纯净的DNA，适用于多种下游应用（如测序、放射性标记、酶切、酶学修饰、克隆等）。该方法的原理是将含有DNA条带的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶切片放入电洗脱装置的样品孔中，施加电流后，DNA片段会从凝胶中迁移出来，并被捕获于缓冲盐层中，随后可通过乙醇沉淀回收DNA。

该实验步骤可实现高得率的DNA片段纯化。

电泳洗脱DNA片段

纯化的DNA片段在分子生物学中有多种用途，可通过多种方法制备。大多数方法需要一个……

您好。今天我们将向您展示如何通过电洗脱法纯化DNA片段，例如限制性酶切产物和PCR产物。对于克隆、测序等后续实验操作，电洗脱法可作为优选方法之一。该方法基于DNA所带的负电荷，在电场中设置高密度凝胶屏障，使DNA片段滞留在其中，从而阻止其进一步迁移。该方法能够从不同来源高效纯化多种大小的DNA片段，回收率最高可达80%。与柱纯化、树脂试剂盒等其他纯化方法相比，其成本较低，是另一优势。首先通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行可视化，以观察并确定需要纯化的目标片段，随后应继续进行电泳。当片段充分分离后，可准确判断过小的片段。电泳结束后，使用全新的剃须刀片从凝胶中精确切下目标片段，并注意尽量靠近目的条带切割，确保切下的凝胶块尽可能接近目标区域。此操作应在避光并佩戴手套的条件下进行。将适量的电泳缓冲液加入电泳槽中，并小心将其覆盖中间平台表面后，将凝胶切片置于其中一个轮槽内，尽可能靠近 V 型通道。V 型通道内不得有气泡。可通过用缓冲液冲洗通道以去除任何滞留的空气来避免此问题。然后从靠近孔的位置小心地向V通道加入100微升高盐屏障溶液。封闭样品室，并将电极连接至电源，以100至120伏电压开始电泳。时间间隔将取决于片段大小，对于长达 20 kbs 的大片段，50 分钟至 1 小时应已足够；而对于小片段，应每 10 分钟在紫外光下监测一次，以避免片段进一步从盐溶液中洗脱并进入末端成人缓冲链。本实验中，我们使用 ND one 和 entry 酶消化了 560 纳克质粒，以释放一个 900 个碱基对的片段，相当于 84 纳克样品量。将凝胶切片放入加样孔后，在100伏电压下进行电洗脱25分钟。电洗脱完成后，DNA片段将被捕获于V型通道内的琼脂糖垫中，从接收器远端一侧自通道中回收400微升溶液，并使用连接于微量移液器上的细尖吸头将其转移至1.5微升微量离心管中。随后加入两倍体积的预冷无水乙醇，通过涡旋振荡混匀，进行乙醇沉淀。此外，可加入2至3微升糖原以提高DNA回收率。将样品于-20摄氏度孵育1小时，或 alternatively 在该温度下过夜。随后在4摄氏度下以最大转速离心25分钟。将此心肌上清液用1毫升冰冷的70%乙醇洗涤，在4°C下以最高速度离心5至10分钟，弃去上清液，将离心管倒置置于室温下晾干，然后加入10至15微升无核水重悬沉淀，并进行样品浓度测定。本例中，纯化后的样品溶于10微升水中，在260纳米波长下用分光光度计测定，浓度为6.3纳克/微升，代表纯化效率为75%。您可能会认为，与其如此，不如仅花费宝贵的10分钟使用试剂盒更为高效。然而，尽管此过程耗时较长，您将能够控制诸多变量，从而纯化更多种类的样本，这些样本在天然状态下的大小和来源各不相同。正如您在本案例中所见，其纯化效率达到75%，等于或优于大多数DNA纯化试剂盒。感谢您今天的参与。我们希望本实验方案对您的科研项目有所帮助。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Electroeluting的DNA碎片

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。...

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

本文介绍了一种利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的基本实验方案。...

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

在本视频中，我们采用自动化毛细管电泳技术分析游离DNA（cfDNA）片段的大小分布。该技术有助于深入了解癌细胞在凋亡过程中释放的DNA片段特征。...

基于自动毛细管电泳的游离DNA片段大小分布分析：一种基于DNA微芯片的方法，用于研究从生物液体中分离的DNA片段的大小分布

本视频介绍了基于片段大小分离PCR扩增子的微流控毛细管电泳技术。该技术利用荧光染料和标准分子量标记物进行片段长度分析。...

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增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

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邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M...

从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

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电泳洗脱DNA片段

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