电泳洗脱DNA片段

您好。今天我们将向您展示如何通过电洗脱法纯化DNA片段，例如限制性酶切产物和PCR产物。对于克隆、测序等后续实验操作，电洗脱法可作为优选方法之一。该方法基于DNA所带的负电荷，在电场中设置高密度凝胶屏障，使DNA片段滞留在其中，从而阻止其进一步迁移。

该方法能够从不同来源高效纯化多种大小的DNA片段，回收率最高可达80%。与柱纯化、树脂试剂盒等其他纯化方法相比，其成本较低，是另一优势。首先通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行可视化，以观察并确定需要纯化的目标片段，随后应继续进行电泳。

当片段充分分离后，可准确判断过小的片段。电泳结束后，使用全新的剃须刀片从凝胶中精确切下目标片段，并注意尽量靠近目的条带切割，确保切下的凝胶块尽可能接近目标区域。

此操作应在避光并佩戴手套的条件下进行。将适量的电泳缓冲液加入电泳槽中，并小心将其覆盖中间平台表面后，将凝胶切片置于其中一个轮槽内，尽可能靠近 V 型通道。V 型通道内不得有气泡。

可通过用缓冲液冲洗通道以去除任何滞留的空气来避免此问题。然后从靠近孔的位置小心地向V通道加入100微升高盐屏障溶液。封闭样品室，并将电极连接至电源，以100至120伏电压开始电泳。

时间间隔将取决于片段大小，对于长达 20 kbs 的大片段，50 分钟至 1 小时应已足够；而对于小片段，应每 10 分钟在紫外光下监测一次，以避免片段进一步从盐溶液中洗脱并进入末端成人缓冲链。本实验中，我们使用 ND one 和 entry 酶消化了 560 纳克质粒，以释放一个 900 个碱基对的片段，相当于 84 纳克样品量。

将凝胶切片放入加样孔后，在100伏电压下进行电洗脱25分钟。电洗脱完成后，DNA片段将被捕获于V型通道内的琼脂糖垫中，从接收器远端一侧自通道中回收400微升溶液，并使用连接于微量移液器上的细尖吸头将其转移至1.5微升微量离心管中。随后加入两倍体积的预冷无水乙醇，通过涡旋振荡混匀，进行乙醇沉淀。此外，可加入2至3微升糖原以提高DNA回收率。将样品于-20摄氏度孵育1小时，或 alternatively 在该温度下过夜。随后在4摄氏度下以最大转速离心25分钟。

将此心肌上清液用1毫升冰冷的70%乙醇洗涤，在4°C下以最高速度离心5至10分钟，弃去上清液，将离心管倒置置于室温下晾干，然后加入10至15微升无核水重悬沉淀，并进行样品浓度测定。本例中，纯化后的样品溶于10微升水中，在260纳米波长下用分光光度计测定，浓度为6.3纳克/微升，代表纯化效率为75%。您可能会认为，与其如此，不如仅花费宝贵的10分钟使用试剂盒更为高效。

然而，尽管此过程耗时较长，您将能够控制诸多变量，从而纯化更多种类的样本，这些样本在天然状态下的大小和来源各不相同。正如您在本案例中所见，其纯化效率达到75%，等于或优于大多数DNA纯化试剂盒。感谢您今天的参与。

我们希望本实验方案对您的科研项目有所帮助。