常压下通过质谱法对单个细胞进行直接分析

以下实验的总体目标是喷射单个活细胞的内容物，并在常压下将释放的生物分子离子化，以便通过质谱仪进行分析。该过程通过远距离显微镜选择单个细胞，然后利用波长为2.94微米的激光脉冲，经由尖端处理的光纤传递，对选定细胞进行消融。单个细胞的消融将产生微小的中性颗粒物羽流，进而使消融羽流中的物质离子化。

它被电喷雾拦截。喷雾产生的带电液滴与来自细胞的烧蚀羽流中的颗粒物合并。形成的液滴中包含了来自细胞的分子，并由此产生相应的离子。

获得的结果展示了来自单个细胞的质谱图。该谱图包含大量与细胞代谢物和脂质相关的峰。大家好，我是来自乔治·华盛顿大学化学系维瑞斯实验室的Dr. Bin Drester。

今天我们将向您展示在常压下通过质谱法对单个活细胞进行直接分析的操作步骤。我们在实验室中采用该方法研究单个植物和动物细胞中的代谢物与脂质。现在让我们开始吧。

激光消融用于激光消融、电喷雾电离、质谱或惰性MS，由波长为2.94微米、持续时间为五纳秒的激光脉冲产生。本研究中采用由掺钕YAG激光器驱动的可调谐光学参量振荡器进行消融。

首先，将光学纤维的蚀刻端安装在微操纵器上，并将其移至细胞表面附近。为了实现高效的能量沉积，使用裸纤维夹具夹持光学纤维的非蚀刻端以进行光学校准。该光纤夹具安装在五轴平移台上。

通过使用平凸氟化钙、氟化物或镀有抗反射膜的硒化锌透镜，将激光能量聚焦到光纤未刻蚀的一端，从而实现激光与光纤的耦合；使用镀金保护镜来引导中红外激光束至聚焦透镜。为保持光纤尖端与细胞表面之间的距离，可在距表面15至30度角的位置安装长工作距离视频显微镜。该系统还包含一个5倍无限远校正的物镜镜头，并配备CCD相机，用于实时监测和图像采集。

第二个视频显微镜以直角安装在样品表面，用于从顶部观察细胞并选择目标细胞进行分析。该系统提供视觉反馈，以将光纤尖端对准选定的细胞，用于消融和分析。系统包含一个七倍精密变焦光学适配器、一个10倍无限远校正的长工作距离物镜以及一个CCD相机。

电喷雾系统采用金属接头、导电全氟弹性体、压紧式接头、管路、套管针接口以及FU石英管构建。推荐使用不锈钢材质的喷雾头，其尖端为锥形，直径为50微米。配制含有0.1%乙酸的50%甲醇溶液用于电喷雾。通过注射泵以每分钟200至300纳升的流速泵入该溶液。

使用500微升注射器，通过稳压电源将2,803,000伏之间的高电压施加到金属接头上。为产生稳定的电喷雾，请确保所有电气连接牢固，并使用屏蔽装置进行屏蔽，且正确接地，因为直接接触暴露的高压可能导致电击。从合适的来源获取活体组织或细胞样本，并在分析前按照推荐条件保存。

本实验所用的葱属鳞茎样本购自当地商店。取葱属鳞茎，用外科手术刀沿纵轴切开鳞茎，切取约2平方厘米大小的鳞叶组织片段。然后剥下一层完整且连续的内表皮组织。利用表皮组织的湿润面，将其置于预先清洁过的玻璃载玻片上。

使用安装在三轴平移台上的通用载物片夹持器夹住载玻片，以进行定位。样品安装后应立即采集质谱，以防止细胞降解。首先打开激光器、电喷雾和质谱仪。

通过调整烧蚀点与电喷雾发射器相对于彼此以及质谱仪孔口的位置，优化惰性离子源的几何构型。为获得最大离子强度，使用顶部视图可视化系统选择目标细胞进行分析。选定后，移动样品台，使所选细胞位于光纤尖端正下方。

使用侧向显微镜，重新调整尖端与细胞表面的距离至约 20 微米。通过刻蚀光纤尖端向选定细胞发射激光脉冲，使细胞壁穿孔，并以颗粒物质形式喷出细胞质。

电喷雾电离后，所产生的离子由质谱仪收集并记录质谱图。数据采集完成后，将激光器、电喷雾装置和质谱仪置于待机模式或关闭。保留已进行激光烧蚀的葱属植物（allium cper）组织样品，以便选择性地通过光学显微镜观察；成功烧蚀单个细胞会导致细胞壁破裂，并获得一条微弱的质谱图。

以下是单个嵌入式洋葱鳞茎表皮细胞经懒惰模式质谱（lazy MS）分析得到的结果，图中显示了代表性的光学显微镜图像。在完成细胞取样后，细胞壁被穿孔，且穿孔范围受限于与邻近细胞的边界。相邻细胞似乎保持完整。

此处展示了一个由单个细胞产生的典型惰性质谱图。从单个葱属细胞中检测到多种离子，根据其精确质量、同位素分布模式以及串联质谱图，这些离子被仔细指认为内源性代谢物。从单个细胞检测到的离子与通过传统惰性质谱对多个细胞进行相同组织分析时所观察到的离子相似。

我们刚刚向您展示了如何在常压下通过质谱技术分析单个活细胞。进行此操作时，重要的是要记住佩戴防护眼镜，以避免受到四级红外激光的意外照射。就这些。

感谢观看，祝您的实验顺利。