Name: 成像蛋白质 - 蛋白质相互作用在体内 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学习使用FRET荧光共振能量转移技术在内皮细胞中进行蛋白质-蛋白质相互作用的活细胞成像。该方法通过受体克隆和共聚焦显微镜评估血管生成过程中的受体相互作用，为研究细胞信号通路提供可靠工具。

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我们感谢 Scott Henderson 博士在共聚焦显微镜方面的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（1RO1CA127501，授予 W.A.B.）以及弗吉尼亚联邦大学马西癌症中心和医学院（VCU）试点项目基金（授予 W.A.B.）的支持。显微成像工作在弗吉尼亚联邦大学神经生物学与解剖学系显微成像中心完成，该中心部分获得了美国国立神经疾病与卒中研究所（NIHNINDS）中心核心资助（5P30NS047463）的支持。

该方案包含三个主要步骤。第一步是将目的基因克隆至哺乳动物表达载体中，使其位于CFP和/或YFP单体版本的氨基端，此部分仅作简要讨论。第二步和第三步分别为将载体DNA转染至EA.hy926内皮细胞，以及利用FRET进行共聚焦成像，下文将对此进行更详细的阐述。
1. CFP 和 YFP 嵌合受体的构建
目的受体应克隆至CFP和YFP的单体增强型版本的氨基末端。FRET的测定具有经验性，且在很大程度上依赖于跨膜区与荧光团起始位点之间连接序列的长度1。因此，对于每一对新研究的受体，都必须尝试多种不同长度的连接序列。
<ol>
<li> 将目的受体克隆至含有单体 C- 或 YFP 的 pcDNA3.1 hygroR 或 neoR 载体的 NheI/EcoRI 位点中（该载体可从本实验室获得）。*注意：如有需要，NheI 与其他多种酶兼容，包括 SpeI 和 XbaI。</li>
<li> 将连接反应产物转化至合适的 endA1 recA 感受态细胞系（我们常规使用 Mach1），筛选含有插入片段的菌落，并通过 DNA 测序验证无突变。</li>
<li> 在确认分子克隆成功后，使用 Qiagen 或同类 DNA 试剂盒在无菌水或 TE 中制备转染级质粒 DNA。通过紫外分光光度法评估其浓度和纯度。DNA 产量通常在 100–200 μg 范围内，常规稀释为 1 μg/μL 的工作储备液。</li>
</ol>
2. EA.hy 926 细胞的转染
<ol>
<li> 将在完全DMEM培养基（DMEM + 10% 胎牛血清 + 青霉素/链霉素）中培养的EA.hy 926细胞4传代至MatTek盖玻片（No. 0）35 mm培养皿中，每皿加入2 mL培养基。从一个15 cm的完全汇合培养皿中可保守获得约15个培养皿（次日汇合度约90%）。每个单独受体的表达检测准备一个培养皿，每种受体组合也各准备一个培养皿。</li>
<li> 将细胞在37°C、5% CO2环境中孵育过夜。次日，细胞汇合度应达到约70–90%。</li>
<li> 转染当天，通过将2 μg嵌合受体载体DNA（2 μL）与8 μL Fugene6在200 μL预温的OptiMEM中混合，制备核酸脂质复合物。对于受体组合，每种受体各转染1 μg，总计2 μg（参见下文讨论）。</li>
<li> 轻柔颠倒混匀。</li>
<li> 室温继续孵育30分钟。</li>
<li> 在孵育期间，准备细胞进行转染。吸除新鲜培养基，用预温的PBS轻柔快速洗涤每个培养皿一次，然后加入2 mL不含抗生素的预温完全DMEM（DMEM + FBS）。注意避免使用青霉素和链霉素，因为在Fugene6处理期间，这些抗生素对细胞具有显著毒性。</li>
<li> 将复合物逐滴加入细胞中，在37°C、5% CO2环境中继续孵育额外20–24小时。</li>
<li> 24小时后，小心吸除培养基，并用移液器加入含抗生素的新鲜完全DMEM。转染后，细胞活力应保持相对较高，即几乎无漂浮细胞可见。</li>
<li> 基因表达通常在转染后额外48–60小时达到峰值。然而，成像通常在24小时后即可进行。应开展时间进程实验以确定最佳基因表达时间。</li>
</ol>
3. 共聚焦成像与FRET分析
活细胞成像在配备蓝色二极管（405 nm）、氩离子（458、476、488、514 nm）、绿色 HeNe（543 nm）、橙色 HeNe（594 nm）和红色 HeNe（633 nm）激光器的 Leica TCS-SP2 AOBS 共聚焦激光扫描显微镜上进行，使用 HCX PI Apo 63x/1.3 n.a. 甘油浸润物镜、电动 XY 载物台（Märzhäuser）以及环境可控（温度、湿度和 CO2）的载物台培养箱（PeCon）。实验对照至关重要，用于消除发射通道之间的荧光探针串扰，并评估表达问题及非特异性荧光探针多聚化现象。因此，每次成像实验均需使用单一荧光探针转染样本进行设置。还需进行负性 FRET 对照实验（使用已知不相互作用的受体），以确定因过表达引起的背景 FRET 水平。
<ol>
<li> 为消除CFP与YFP发射通道之间的串扰，将CFP表达对照样本放入载物台培养箱中。使用白光调节Z轴平面，使细胞处于聚焦状态。</li>
<li> 设置CFP发射检测的光谱窗口为465–505 nm，YFP为525–600 nm。</li>
<li> 在同时监测两个发射通道的情况下，以458 nm激发CFP。通过声光可调滤光器（AOTF）调节激光功率，以消除CFP在YFP发射通道中明显的信号渗漏。保存此设置。</li>
<li> 对仅表达YFP的细胞，使用YFP表达对照样本，在CFP通道中进行相同的对照实验：在514 nm下调节激发光功率，以控制YFP对CFP通道的串扰。保存此设置。</li>
<li> 随后将共表达CFP和YFP的细胞放入载物台培养箱中。利用Leica共聚焦软件的序列设置功能，寻找CFP和YFP表达水平相近且在细胞膜上正确分布的细胞。</li>
<li> 使用Leica软件的受体光漂白程序，将供体和受体参数分别设置为先前保存的CFP和YFP设置。</li>
<li> 放大目标细胞，在细胞膜上选择一个感兴趣区域（ROI），作为YFP光破坏的发生位置，并启动程序。</li>
<li> 为实现受体的光破坏，将AOTF在514 nm处调节至100%功率，并持续激光漂白，直至YFP发射信号减少70%。为加快漂白过程，通常将ROI选在激光扫描的光栅方向（X轴方向）。</li>
<li> 在光漂白过程中，监测细胞的移动情况，若在XY平面上出现明显移动，则应舍弃该次测量结果，因为此类数据可能导致错误的FRET效率计算。</li>
<li> 分别记录光漂白前后供体（CFP）和受体（YFP）的图像，FRET效率按以下公式计算：FRETEff = (Dpost - Dpre) / Dpost，适用于所有Dpost &gt; Dpre的情况，其中Dpre和Dpost分别为光漂白前后供体的荧光强度。</li>
<li> 使用JMP软件（SAS）分析实验数据的变异性程度。</li>
</ol>
4. 典型结果
转染效率通常在30%至40%之间。尽管先前有其他研究报道过一种载体的转染和表达会促进另一种载体的情况，但我们并未观察到类似现象。事实上，我们经常看到仅有一种荧光蛋白融合体表达，而另一种则不表达。典型的FRET效率因受体系统不同而有所差异。对于Tie受体系统，上皮细胞中的典型值为20–28%，内皮细胞中为19–23%。阴性对照的典型效率低于2–3%。随着操作经验的积累，实验结果的变异性将显著降低。
<img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="细胞荧光显微镜图像；A-C 显示细胞结构和荧光标记，实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 转染的 EA.hy 926 细胞代表性图像。 A) EA.hy 926 细胞单层的微分干涉差（DIC）图像。B) (A) 中所示细胞的荧光图像。C) (A) 与 (B) 的叠加图像，显示转染效率约为 20–30%。
<img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="光漂白后荧光恢复（FRAP）示意图，包含CFP和YFP分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. EA.hy926细胞中CFP与YFP之间发生FRET的典型受体光漂白分析。 在受体光漂白前后，分别监测CFP发射通道（上图）和YFP发射通道（下两图）。光漂白实验仅限于绿色框内区域，并基于该区域计算FRET值。FRET效率以绝对范围显示，从高（红色-1.0）到低（紫色-0.0），叠加在放大后的CFP/YFP合并图像上，仅用于定位参考。

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

有多个步骤对实验成功至关重要。其中最突出的是两种嵌合受体之间的相对表达水平。为解决这一问题，可构建稳定共表达两种目标蛋白的细胞系，或确定载体DNA的最佳比例以实现相当的表达水平。同样，由于培养皿中转染效率不均，细胞间的蛋白表达水平通常并不一致。因此，必须注意区分“高”表达细胞与“低”表达细胞。通常，蛋白表达处于“中等”水平的细胞可产生可靠且可重复的FRET效率。本实验室为缓解该问题所采用的一种方法是使用腺病毒和慢病毒来实现更均一的基因表达。此外，除受体光漂白法外，另一种测定FRET效率的方法是敏化发射法。尽管敏化发射法具有实时监测单个细胞的潜力，但我们发现受体光漂白法更为灵敏且更可靠。
最后，利用FRET监测蛋白质相互作用具有挑战性，需要为膜结合受体仔细选择连接子长度。此外，添加C/YFP通常会显著影响蛋白质表达水平，并导致内质网和高尔基体中出现聚集。然而，对于瞬时或不稳定的相互作用，FRET是理想的研究方法。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片培养皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

蛋白质-蛋白质相互作用是所有重要细胞过程的显著特征。然而，许多此类相互作用具有瞬时性或能量较弱的特点，难以通过传统的生物化学方法（如共免疫沉淀）进行鉴定与分析。在这一领域，可遗传编码的荧光蛋白（GFP、RFP等）及其重叠的荧光光谱的发现，极大地提升了我们对弱相互作用的监测能力 体内 使用荧光共振能量转移（FRET）1-3在此，我们详细描述了使用基于FRET的邻近检测法来监测内皮细胞表面受体-受体相互作用的方法。

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。

蛋白质-蛋白质相互作用是所有重要细胞过程的特征。然而，其中许多相互作用是瞬时的或能量上较弱的，……

以下实验的总体目标是评估细胞表面是否存在蛋白质-蛋白质相互作用。首先将两种目的受体分别克隆到两种具有重叠发射光谱的荧光蛋白的末端；随后，将这两个载体同时转染入内皮细胞，以实现受体的表达。此时，荧光染料有助于评估整体表达程度以及受体的定位情况。接下来，在共聚焦显微镜上使用单转染样本作为对照来设定成像参数。根据受体表达水平和定位情况的相对差异，分别选择单个转染细胞进行分析。随后对这些细胞内的特定区域进行成像，以评估FRET结果的程度，这些结果基于FRET和共聚焦显微镜显示了内皮细胞表面Tie1与Tie2之间的相互作用。大家好，我是来自弗吉尼亚联邦大学生物化学与分子生物学系William Barton博士实验室的Tom Seger。今天，我们将向您展示一种利用基于FRET的共聚焦显微镜技术在内皮细胞中评估蛋白质-蛋白质相互作用的方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究血管生成过程中的受体相互作用。现在，让我们开始吧。使用基于FRET的邻近检测技术成像蛋白质-蛋白质相互作用时，首先将目标受体克隆至含有单体CFP或YFP的pcDNA3.1/hygro或neo载体的NHE I和EcoR I位点。FRET的测定具有经验性，且高度依赖于跨膜区与荧光蛋白起始端之间连接序列的长度。因此，对于每一对新研究的受体，必须尝试多种不同的连接序列。随后，根据配套方案进行载体的转化与扩增。然后制备转染级DNA，根据随附的说明书转化并扩增载体。接着制备转染级DNA，并将其稀释至工作浓度为每微升1微克，以在组织培养罩内进行细胞转染准备。将生长于完全DMEM培养基中的EAHY 926细胞以2毫升培养基接种至含盖玻片的35毫米培养皿中。为每种单独受体的表达检测各准备一个培养皿，同时为每对受体组合也各准备一个培养皿。次日，在37摄氏度、含95%二氧化碳的培养箱中孵育细胞。转染当天，细胞融合度应达到约70%至90%。通过将两微克嵌合受体载体DNA与八微升Fuji N HD加入200微升预温的Opti-MEM中，配制核酸-脂质复合物；若为受体对转染，则每种受体各取一微克，总量为两微克，轻轻颠倒混匀，并于室温孵育30分钟。孵育期间，准备用于转染的细胞：吸除新鲜培养基，用预热的PBS轻轻且快速地洗涤每孔细胞，然后加入2毫升预热的不含抗生素的完全DMEM。需要注意避免使用青霉素和链霉素，因为它们在FU基因HD复合物处理细胞期间对细胞的毒性显著增强。将FU基因HD复合物逐滴加入细胞中，并继续孵育20至24小时。24小时后，小心吸除细胞中的培养基，转染完成后，用移液器加入含抗生素的新鲜完全DMEM。细胞活力应保持在较高水平，几乎无悬浮细胞或仅有极少量悬浮细胞可见。为进行活细胞成像，我们使用配备蓝色二极管氩激光器以及绿色、橙色和红色氦氖激光器的Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描显微镜，搭配HCX PL APO 63倍1.3数值孔径甘油浸没物镜、电动XY载物台，以及可控制温度、湿度和二氧化碳浓度的载物台培养箱。实验对照对于消除发射通道间的荧光串扰以及评估表达问题和非特异性荧光标记至关重要。因此，每次成像前均需使用单一荧光转染样本，以消除CFP与YFP发射通道之间的串扰。将CFP表达对照样本放入载物台培养箱中，并使用白光照明。调整Z平面以聚焦细胞。设置SP窗口的发射检测范围，CFP为465至505纳米，YFP为525至600纳米，同时监测两个发射通道，并在458纳米处激发CFP。使用A OTF将激光功率调节至消除CFP在YFP发射通道中明显的串色信号。保存此设置。通过调节514纳米处的激发光功率，对CFP通道中YFP的串扰进行相同的对照。仅表达YFP的细胞，保存此设置。接下来，将共表达 CFP 和 YFP 的细胞放入载物台培养箱中。使用 LICO 共聚焦软件的序列设置，利用 LICO 软件找到具有相似 CFP 和 YFP 表达水平且膜定位正确的细胞，但不使用软件中的受体光漂白程序。将供体和受体设置分别调整为已保存的 CFP 和 YFP 设置。放大细胞，选择细胞膜上将发生 YFP 光破坏的感兴趣区域（ROI），并启动受体光破坏程序。将 A OTF 调整为 514 纳米的 100%，并持续进行激光漂白，直至 YFP 发射信号减少 70%。为加速漂白，光漂白过程中通常选择激光扫描轴方向的感兴趣区域（ROI）。监测细胞运动，排除在XY平面内有明显移动的测量数据。由于此类数据可能导致错误的FRET效率结果，需分别记录供体和受体在漂白前与漂白后的图像，FRET效率计算公式为：FRET效率 = (Dpre - Dpost) / Dpre，适用于所有Dpost大于Dpre的情况，其中Dpre和Dpost分别为光漂白前后供体的荧光强度。JMP 用于确定实验变异性的程度。应将单个受体与不同长度的膜旁序列分别与 CFP 和 YFP 融合。为了鉴定出最佳的受体 FRET 配对组合，转染效率通常为 30% 至 40%，尽管此前已有其他研究报道过相关结果。我们未观察到一种载体的转染和表达会促进另一种载体的转染或表达。事实上，我们经常观察到仅有一种菌群或四种KY镜像中的一种被特异性表达。这些代表性图像显示了在EAHY 926细胞中CFP与YFP之间发生FRET的受体光漂白分析结果。在光漂白前后分别监测CFP和YFP的发射通道，计算仅限于该区域。在红色框内，FRET效率以绝对范围显示，仅用于T受体系统的A-C-F-P-Y-F-P融合图像放大叠加图的定位参考：高值（1.0）以红色表示，低值（0）以紫色表示。上图所示典型的FRET效率值在上皮细胞中为20%至28%，在内皮细胞中为19%至23%。因此，一旦掌握，该技术若正确操作，通常需要三到四天。在进行该实验时，需牢记目标蛋白与融合荧光蛋白之间的连接肽长度，以及它们的表达水平和细胞内运动，会直接影响后续的FRET测量结果。此外，还可开展与信号激活相关的生化检测，以深入了解该技术建立后的信号转导通路。该技术提供了一种可用于研究弱相互作用或瞬时相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用的检测方法。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活细胞中开展基于FRET的邻近检测实验。此外，请务必注意，在进行细胞培养操作时，应始终遵循适当的安全防护措施。因此，感谢您的观看，祝您今后的 fret 实验顺利成功。

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