蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

以下实验的总体目标是评估细胞表面是否存在蛋白质-蛋白质相互作用。首先将两种目的受体分别克隆到两种具有重叠发射光谱的荧光蛋白的末端；随后，将这两个载体同时转染入内皮细胞，以实现受体的表达。

此时，荧光染料有助于评估整体表达程度以及受体的定位情况。接下来，在共聚焦显微镜上使用单转染样本作为对照来设定成像参数。根据受体表达水平和定位情况的相对差异，分别选择单个转染细胞进行分析。

随后对这些细胞内的特定区域进行成像，以评估FRET结果的程度，这些结果基于FRET和共聚焦显微镜显示了内皮细胞表面Tie1与Tie2之间的相互作用。大家好，我是来自弗吉尼亚联邦大学生物化学与分子生物学系William Barton博士实验室的Tom Seger。

今天，我们将向您展示一种利用基于FRET的共聚焦显微镜技术在内皮细胞中评估蛋白质-蛋白质相互作用的方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究血管生成过程中的受体相互作用。现在，让我们开始吧。

使用基于FRET的邻近检测技术成像蛋白质-蛋白质相互作用时，首先将目标受体克隆至含有单体CFP或YFP的pcDNA3.1/hygro或neo载体的NHE I和EcoR I位点。FRET的测定具有经验性，且高度依赖于跨膜区与荧光蛋白起始端之间连接序列的长度。因此，对于每一对新研究的受体，必须尝试多种不同的连接序列。随后，根据配套方案进行载体的转化与扩增。

然后制备转染级DNA，根据随附的说明书转化并扩增载体。接着制备转染级DNA，并将其稀释至工作浓度为每微升1微克，以在组织培养罩内进行细胞转染准备。将生长于完全DMEM培养基中的EAHY 926细胞以2毫升培养基接种至含盖玻片的35毫米培养皿中。为每种单独受体的表达检测各准备一个培养皿，同时为每对受体组合也各准备一个培养皿。

次日，在37摄氏度、含95%二氧化碳的培养箱中孵育细胞。转染当天，细胞融合度应达到约70%至90%。通过将两微克嵌合受体载体DNA与八微升Fuji N HD加入200微升预温的Opti-MEM中，配制核酸-脂质复合物；若为受体对转染，则每种受体各取一微克，总量为两微克，轻轻颠倒混匀，并于室温孵育30分钟。

孵育期间，准备用于转染的细胞：吸除新鲜培养基，用预热的PBS轻轻且快速地洗涤每孔细胞，然后加入2毫升预热的不含抗生素的完全DMEM。需要注意避免使用青霉素和链霉素，因为它们在FU基因HD复合物处理细胞期间对细胞的毒性显著增强。将FU基因HD复合物逐滴加入细胞中，并继续孵育20至24小时。24小时后，小心吸除细胞中的培养基，转染完成后，用移液器加入含抗生素的新鲜完全DMEM。

细胞活力应保持在较高水平，几乎无悬浮细胞或仅有极少量悬浮细胞可见。为进行活细胞成像，我们使用配备蓝色二极管氩激光器以及绿色、橙色和红色氦氖激光器的Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描显微镜，搭配HCX PL APO 63倍1.3数值孔径甘油浸没物镜、电动XY载物台，以及可控制温度、湿度和二氧化碳浓度的载物台培养箱。

实验对照对于消除发射通道间的荧光串扰以及评估表达问题和非特异性荧光标记至关重要。因此，每次成像前均需使用单一荧光转染样本，以消除CFP与YFP发射通道之间的串扰。将CFP表达对照样本放入载物台培养箱中，并使用白光照明。

调整Z平面以聚焦细胞。设置SP窗口的发射检测范围，CFP为465至505纳米，YFP为525至600纳米，同时监测两个发射通道，并在458纳米处激发CFP。使用A OTF将激光功率调节至消除CFP在YFP发射通道中明显的串色信号。

保存此设置。通过调节514纳米处的激发光功率，对CFP通道中YFP的串扰进行相同的对照。仅表达YFP的细胞，保存此设置。

接下来，将共表达 CFP 和 YFP 的细胞放入载物台培养箱中。使用 LICO 共聚焦软件的序列设置，利用 LICO 软件找到具有相似 CFP 和 YFP 表达水平且膜定位正确的细胞，但不使用软件中的受体光漂白程序。

将供体和受体设置分别调整为已保存的 CFP 和 YFP 设置。放大细胞，选择细胞膜上将发生 YFP 光破坏的感兴趣区域（ROI），并启动受体光破坏程序。将 A OTF 调整为 514 纳米的 100%，并持续进行激光漂白，直至 YFP 发射信号减少 70%。

为加速漂白，光漂白过程中通常选择激光扫描轴方向的感兴趣区域（ROI）。监测细胞运动，排除在XY平面内有明显移动的测量数据。由于此类数据可能导致错误的FRET效率结果，需分别记录供体和受体在漂白前与漂白后的图像，FRET效率计算公式为：FRET效率 = (Dpre - Dpost) / Dpre，适用于所有Dpost大于Dpre的情况，其中Dpre和Dpost分别为光漂白前后供体的荧光强度。

JMP 用于确定实验变异性的程度。应将单个受体与不同长度的膜旁序列分别与 CFP 和 YFP 融合。为了鉴定出最佳的受体 FRET 配对组合，转染效率通常为 30% 至 40%，尽管此前已有其他研究报道过相关结果。

我们未观察到一种载体的转染和表达会促进另一种载体的转染或表达。事实上，我们经常观察到仅有一种菌群或四种KY镜像中的一种被特异性表达。这些代表性图像显示了在EAHY 926细胞中CFP与YFP之间发生FRET的受体光漂白分析结果。

在光漂白前后分别监测CFP和YFP的发射通道，计算仅限于该区域。在红色框内，FRET效率以绝对范围显示，仅用于T受体系统的A-C-F-P-Y-F-P融合图像放大叠加图的定位参考：高值（1.0）以红色表示，低值（0）以紫色表示。上图所示典型的FRET效率值在上皮细胞中为20%至28%，在内皮细胞中为19%至23%。

因此，一旦掌握，该技术若正确操作，通常需要三到四天。在进行该实验时，需牢记目标蛋白与融合荧光蛋白之间的连接肽长度，以及它们的表达水平和细胞内运动，会直接影响后续的FRET测量结果。此外，还可开展与信号激活相关的生化检测，以深入了解该技术建立后的信号转导通路。

该技术提供了一种可用于研究弱相互作用或瞬时相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用的检测方法。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活细胞中开展基于FRET的邻近检测实验。此外，请务必注意，在进行细胞培养操作时，应始终遵循适当的安全防护措施。

因此，感谢您的观看，祝您今后的 fret 实验顺利成功。