成像蛋白质 - 蛋白质相互作用在体内
October 10th, 2010
本协议描述了如何形象蛋白质相互作用使用基于FRET的接近检测。
以下实验的总体目标是评估细胞表面是否存在蛋白质蛋白质相互作用。这是通过将两个感兴趣的受体（一个 myo 末端克隆到两个荧光团）来实现的，第二步是两个发射和光谱重叠的荧光团。将两种载体同时转染到内皮细胞中以进行受体表达。
此时，荧光团有助于评估表达的总体程度以及受体定位。接下来，使用单次转染作为共聚焦显微镜上的对照来建立成像参数。单独地，根据受体表达和定位的相对水平选择转染细胞。
然后对这些细胞内的区域进行成像，以评估 fret 结果的程度。这显示了基于 fre 和共聚焦显微镜的内皮细胞表面的 tie 1 和 tie 2 相互作用。大家好，我是来自弗吉尼亚联邦大学生物化学和分子生物学系 William Barton 博士实验室的 Tom Seger。
今天，我们将向您展示一种通过基于 Fret的共聚焦显微镜评估内皮细胞中蛋白质蛋白质相互作用的程序。在我们的实验室中，我们使用它来研究血管生成过程中的受体相互作用。那么让我们开始吧。
要使用基于 fret 的邻位测定对蛋白质相互作用进行成像，首先将感兴趣的受体克隆到 pcd 的 NHE one eco R one 位点，pcd 是一种含有单体 CFP 或 YFP 的 3.1 hydro 或 neo 载体。fret 的测定是经验性的，并且严重取决于跨膜跨越区域和 Fluor 起始之间的接头长度。因此，必须为每个新的受体对探索接头的几个不同环节 根据随附的方案，根据随附的方案转化和扩增载体。
然后制备转染级 DNA，根据随附的方案转化和扩增载体。然后制备转染级 DNA，并将其稀释至每微升 1 微克的工作浓度，以制备用于转染的细胞，在组织培养罩下，将 EAHY 92 6 细胞在完全 DMEM 中生长，分流到盖玻片线 35 毫米培养皿中，加入 2 毫升培养基。准备一个培养皿来评估每个受体的表达，以及每个受体对的一个培养皿。
第二天让细胞在 37 摄氏度下孵育超过 95% 的二氧化碳气氛。转染当天，培养物的汇合度应约为 70% 至 90%。将 2 μg 嵌合受体载体 DNA 与 8 μL Fuji N HD 混合在 200 μL 预热最佳受体对中，制备核脂质复合物，转染每种受体 1 μg，共 2 μg，倒置轻轻混合，并在室温下孵育 30 分钟。
在孵育期间，准备用于转染的细胞，吸出新鲜培养基，并用温热的 PBS 轻轻短暂地洗涤每个板，然后加入两毫升不含抗生素的战前完全 DMEM。避免青霉素和链霉素的存在很重要，因为它们在治疗过程中对细胞的毒性要大得多 FU 基因 HD 在复合物中滴入细胞 并再孵育 20 至 24 小时。24 小时后，小心地从细胞中吸出培养基，并在转染后用抗生素吸取新鲜的完全 DMEM。
细胞活力应保持相对较高。应观察到很少或没有浮动单元格。为了进行活细胞成像，我们使用一个类似 A-T-C-S-P 两个 A OBS 共聚焦激光扫描显微镜，配备蓝色二极管氩气和绿色、橙色和红色氦氖激光器、H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA 甘油浸没、电动 XY 载物台和温度、湿度和二氧化碳控制载物台培养箱。
实验对照对于消除发射通道之间的 Fluor 串扰以及评估表达问题和非特异性 Fluor 四化至关重要。因此，单氟 4 转染用于设置每个图像会话，以消除 CFP 和 YFP 发射通道之间的串扰。使用白光将 CFP 表达对照放入载物台培养箱中。
调整 Z 板以专注于细胞。将 CFP 发射检测的 SP 窗口设置设置为 465 至 505，将 YFP 设置为 525 至 600 纳米，同时监控两个发射通道在 458 纳米处激发 CFP。使用 A OTF 设置激光功率以消除 CFP 到 YFP 发射通道中的明显泄漏。
保存此设置。通过调整 514 纳米的激发功率，对 CFP 通道中的 YFP 串扰执行相同的控制。仅表达 YFP 的细胞保存此设置。
接下来，下一个地方，将表达 CFP 和 YFP 的细胞共挤进入载物台培养箱。使用 LICO 共聚焦软件的序列设置。使用 LICO 软件（软件接受者照片漂白程序除外）定位表达相似水平 CFP 和 YFP 的细胞，并进行适当的膜定位。
将 donor （供体） 和 accepter （接受体） 设置分别设置为您保存的 CFP 和 YFP 设置。放大到细胞上，突出显示 YFP 的光破坏发生在细胞膜上的感兴趣区域或 ROI，然后开始程序 For photo destruction of the acceptor。将 A OTF 调整为 514 纳米的 100%，并允许激光漂白继续，直到 70% 的 YFP 发射耗尽。
为了加速漂白，通常在光漂白过程中在激光器的光栅轴中选择 ROI。监测细胞运动并拒绝在 XY 平面中通过明显运动获得的测量值。由于这些测量可以报告错误的品丝效率，因此记录了供体和受体的漂白前和漂白后图像，并且品格效率的计算方式为品格效率等于开放母柱减去 DLO 括号除以 depost 对于所有大于 D pre 的 depost，其中 D、pre 和 D post 分别是光漂白前后的供体强度。
JMP 用于确定试验变异性的程度。单个受体应与 CFP 和 YFP 融合，具有不同长度的并置膜序列。为了确定最佳的受体 FRET 伴侣对，转染效率通常在 30% 到 40% 之间，尽管其他人之前有发现。
我们还没有看到一种载体的转染和表达有利于另一种载体的转染和表达。事实上，我们经常观察到一个植物群、四个 KY 镜子或另一个植物群的独家表达。这些代表性图像显示了 EAHY 9 26 细胞中 CFP 和 YFP 之间发生的 FRET 的受体光漂白分析。
在光漂白、光漂白之前和之后分别监测 CFP 和 YFP 发射通道，并且计算仅限于该区域。在红色框中，品格效率显示为从 1.0 的高色红色到零的低色紫色的绝对范围，在 A-C-F-P-Y-F-P 合并图像的放大叠加上，仅用于 T 受体系统的方向目的。上皮细胞的典型 Fret 效率值为 20% 至 28%，内皮细胞为 19% 至 23%，如图所示。
因此，一旦掌握，如果执行得当，这项技术通常需要三到四天。在尝试此程序时，重要的是要记住，靶蛋白和融合荧光蛋白之间的接头长度，以及它们的表达水平和细胞运动直接影响其程序后的品格测量。此外，可以进行有关信号激活的生化分析，以深入了解信号发育后的信号转导途径。
该技术提供了一种检测方法，可以在其中研究微弱或瞬时的蛋白质相互作用。观看此视频后，您应该对如何执行自己的基于 Fret 的邻位检测和活细胞有很好的了解。不要忘记，在组织培养中处理细胞时，应始终遵循适当的安全预防措施。
因此，感谢您的观看，祝您未来的品格实验好运。
概述
本协议描述了一种使用基于FRET的邻近测定法在内皮细胞中成像蛋白-蛋白相互作用的方法。该实验通过利用附着在克隆受体上的荧光团评估血管生成过程中的受体相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 蛋白-蛋白相互作用对各种细胞过程至关重要。
- FRET（荧光共振能量转移）是一种研究这些相互作用的强大技术。
- 内皮细胞在血管生成中扮演重要角色。
- 了解受体相互作用可以提供细胞信号传导途径的见解。
研究目的
- 评估细胞表面蛋白-蛋白相互作用的存在。
- 利用基于FRET的显微镜技术可视化这些相互作用。
- 探索不同连接器长度对FRET效率的影响。
所用方法
- 将感兴趣的受体克隆到含有荧光团的特定载体中。
- 用受体载体转染内皮细胞。
- 使用共聚焦显微镜成像细胞并评估FRET结果。
- 进行控制以消除成像过程中荧光团串扰。
主要结果
- 成功成像内皮细胞表面的蛋白-蛋白相互作用。
- 确定FRET效率的最佳连接器长度。
- 确定血管生成过程中的特定受体相互作用。
- 为未来研究建立可靠的成像参数。
结论
- 基于FRET的测定法对于研究活细胞中的蛋白相互作用是有效的。
- 连接器长度显著影响FRET效率，应针对每对受体进行优化。
- 该方法可以推进对细胞过程中受体动态的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Studying transient or weak protein-protein interactions on the cell surface is critical for target validation in early drug discovery, particularly for receptor-mediated signaling pathways. This FRET-based proximity assay enables direct visualization of such interactions in live endothelial cells, providing mechanistic insights that support de-risking of angiogenic targets. The method delivers quantitative, spatially resolved data that can inform lead identification and preclinical model selection by confirming target engagement in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by detecting receptor-receptor interactions that are transient or energetically weak and missed by biochemical methods.
- Operational Value: Enables functional validation of targets in a native membrane environment, reducing false negatives from lysis-based assays.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating interaction strength with cellular context, aiding in portfolio triage of angiogenic candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, fluorescence-tagged receptor pairs suitable for high-content screening of modulators affecting protein-protein interactions.
- Quantitative Output: Produces FRET efficiency measurements that serve as a robust, ratiometric readout for compound-induced changes in receptor proximity.
- Reproducibility: Includes crosstalk controls and standardized imaging parameters to ensure assay consistency across runs and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models receptor interactions in endothelial cells, a key system for angiogenesis-related pathways in oncology and cardiovascular disease.
- Translational Continuity: Bridges molecular interaction data to cellular phenotypes, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from direct receptor engagement, reducing ambiguity in mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where confirmation of target engagement in a live-cell context informs go/no-go decisions before significant investment in medicinal chemistry.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about receptor dimerization or oligomerization in angiogenic signaling, providing direct evidence of target behavior in situ.
- Screening: Delivers quantitative FRET efficiency data that can be used to rank compounds by their ability to disrupt or stabilize receptor interactions.
- Analytics: Employs acceptor photobleaching and intensity ratio calculations to generate normalized FRET values, enabling comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Links molecular interaction data to endothelial function, supporting relevance in preclinical angiogenesis models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where receptor-fluorophore fusions can be swapped to study different target pairs, increasing long-term utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation by detecting weak/transient interactions invisible to co-immunoprecipitation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows with built-in controls for spectral bleed-through and expression variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic evidence of target modulation, reducing late-stage failure due to incorrect mechanism assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed interaction dynamics in disease-relevant cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to generate receptor-fluorophore fusions with variable linker lengths.
- Dependent on access to a confocal laser scanning microscope with photobleaching capability and spectral detection controls.
- Necessitates standardization of transfection protocols and expression validation to ensure comparable receptor levels across conditions.
- Involves optimization of linker length for each receptor pair, as FRET efficiency is highly sensitive to fluorophore distance.
- Limited by cellular movement during imaging, which can confound FRET measurements and requires motion correction or ROI stabilization.
