Name: 一个 EX - OVO鸡胚胎培养系统适用于成像和显微外科的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习离体鸡胚胎培养技术，用于发育生物学研究中的显微注射和显微外科操作。该方法提供完整光学通路，支持长期观察胚胎发育过程。

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1. 体外培养 培养方案：
<ol>
	<li>孵育受精鸡卵
	<ol class="lroman">
		<li>受精鸡卵可在13°C下储存最多5天而不启动发育。红酒冷却器可维持此温度。</li>
		<li>将鸡卵钝端朝上置于37.5°C、60%恒定湿度的培养箱中，持续摇动培养72小时。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>制备吊床（图1a）
	<ol class="lroman">
		<li>用温热的无菌水填充9盎司塑料杯的3/4。标准9盎司杯的顶部直径为8 cm。我们发现此尺寸最适合本文所述的长期培养应用。</li>
		<li>剪取约20 cm保鲜膜，用橡皮筋将其沿杯口周向固定。塑料膜应平铺于水面上。剪去橡皮筋周围多余的塑料膜。我们发现保鲜膜最适合此用途，因其可防止卵黄粘连，避免在运输过程中卵黄破裂。</li>
		<li>用浸有70%乙醇的无尘纸（Kimberly-Clark, Inc.）擦拭塑料膜表面。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>在孵育72小时后将鸡卵从培养箱中取出。</li>
	<li>用浸有70%乙醇的无尘纸擦拭卵壳表面，对鸡卵进行消毒。</li>
	<li>将鸡卵水平放置1–2分钟，使胚胎正确定位（图1b）。可使用鸡蛋托盘水平放置鸡卵。1–2分钟后，胚胎将旋转至上方位置。</li>
	<li>在超净工作台内无菌操作将胚胎转移至吊床上。
	<ol class="lroman">
 	<li>使用锋利边缘（如金属桶边缘或玻璃烧杯边缘）轻轻敲击鸡卵，直至卵壳底部出现小凹痕（图1c）。请注意，胚胎位于上方位置。</li>
		<li>将两个拇指置于凹痕两侧，水平拉开卵壳（图1d）。</li>
		<li>将带有胚胎的卵黄及蛋清一同置于吊床上（图1e）。蛋清可在卵黄周围提供缓冲环境，吸收系统移动时产生的震动，同时为长期培养中的胚胎提供营养。吊床下方的水可确保胚胎在运输过程中保持与地面平行，并在使用水循环加热器成像时作为热传导介质。</li>
		<li>若操作正确，胚胎应已位于上方位置。若未到位，可使用无锐角的无菌物体（例如闭合的弯头剪刀的钝端）轻柔地定向抚触卵黄，使胚胎旋转至顶部。</li>
		<li>将一个直径为10 cm的培养皿盖在杯口，以密封胚胎。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>将杯式培养物放入设定为37.5°C的培养箱中。若使用便携式培养箱，可在其中放置1–2个装有蒸馏水的9盎司杯，以维持约60%的湿度（图1f）。</li>
	<li>若需将胚胎培养至孵化第7天以后，应在胚胎周围散布碎蛋壳碎片，作为骨骼发育和成熟所需的钙源。</li>
</ol>
体外培养箱成像/操作的辅助设备：
自制了一个循环水浴装置，用于在成像或操作过程中维持孵育温度（图3）。一个可容纳样品杯的水浴槽通过适当尺寸的管路连接至储水容器。储水容器中的水由电阻加热器加热，并通过监测水温进行手动调节。水泵用于循环水流。图示展示了通过超声成像/荧光显微镜进行成像的便捷性（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="卵的渗透实验，步骤A-F；装置包括水、卵、烧杯及产生的渗透效应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 吊床的制备及鸡胚向吊床的转移。
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="胚胎发育，HH 20-38 期鸡胚，比较生长分析，实验设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 代表性结果——通过体外（ex ovo）培养技术培育的不同发育阶段的鸡胚。 HH 17 期及以后的胚胎可通过该技术进行培养。
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="生理温度下胚胎发育分析的光学成像系统示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 与之联用的水循环系统的示意图及代表性图片 体外培养 用于将胚胎维持在理想发育温度的培养系统。
2. 选定的应用：
 一、显微注射
该胚胎培养方法适用于需要将溶液注射至血管系统以进行基于对比度成像（例如荧光显微镜、微型计算机断层扫描等）的显微注射应用（图4）。以下是显微注射方案：
<ol>
	<li>准备注射装置
	<ol class="lroman">
		<li>使用微加工仪将外径0.75的玻璃毛细管拉制成斜面尖端的微针。尖端尺寸的选择取决于目标静脉的直径和所需的流速。</li>
		<li>将注射器连接到内径为0.03英寸的硅胶管上。</li>
		<li>将待注射溶液装入管路，并将微针连接至管路。</li>
		<li>将微针放置在显微操作器上，并将注射器固定于注射器支架或注射泵中。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>在杯中加入无菌水，使胚胎上浮。我们发现，为了使针头准确刺入血管（如卵黄静脉），必须进行水平穿刺。这要求胚胎与杯缘处于同一水平面。
 <ol class="lroman">
		<li>取出固定在胚胎下方塑料片上的橡皮筋。</li>
		<li>轻轻抬起塑料杯的一侧，向杯中加入一些无菌水。</li>
		<li>再次将橡皮筋固定在塑料片上。</li>
	</ol>
 </li>
	<li>将溶液注入胚胎血管。根据我们的经验，当将溶液注入卵黄囊血管时，微针的尺寸需约为1/10th 保持有效的灌注同时避免出血的血管直径。
<ol class="lroman">
	<li>将溶液泵入微针，确保不产生气泡。</li>
	<li>将微针尖端对准选定的血管。对于卵黄囊血管，选择分叉区域可获得最大的穿刺面积。</li>
	<li>将针头推向血管。血管会首先发生回缩。一旦针头刺入血管，开始灌注。随着灌注进行，流动血液的颜色应发生变化。如果未观察到颜色变化，可能是针头已穿出血管。此时，应缓慢回撤微针，同时持续泵入溶液，直至观察到血管内出现颜色变化。灌注完成后，将微针从血管中完全撤出。</li>
</ol>
</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="显微镜设置与荧光成像；光学分析；细胞结构观察" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：将荧光染料显微注射至血管系统中 体外培养 培养的鸡胚
二、显微外科手术——左心房结扎
这种ex-ovo培养体系非常适合对鸡胚进行外科操作，因为它能够完全暴露胚胎。以下是示例技术——左心房结扎术（LAL）（图5）的操作方案。该操作在培养开始后约24小时（HH24）进行：
<ol>
	<li>使用10-0尼龙外科缝线制备直径约0.5 mm的单结。</li>
	<li>用精细镊子局部去除覆盖胚胎的绒毛膜和尿囊膜，并从胚胎背部将其轻轻提起，使其垂直旋转，使胚胎左侧朝上可见。</li>
	<li>用精细镊子去除左心房上方的心包膜。</li>
	<li>将结对准左心房位置并收紧，结扎程度应使左侧血流减少约75%。用显微剪刀剪去结的线头，并小心移除并丢弃多余的缝线。</li>
	<li>将胚胎旋转回原始方向（右侧朝上）。</li>
	<li>假手术对照组将接受相同操作步骤，但缝线仅穿过而不打结。术后24小时确认左心房结扎效果（75%狭窄），不符合标准的胚胎将被剔除。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="胚胎发育比较，对照组与LAL处理组，显微镜观察，细胞分化证据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5：对照组与左心房结扎的鸡胚。 箭头指示左心房，在结扎胚胎中其大小约减少75%。

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由于蛋壳的限制，在禽类胚胎中进行光学观察和实验操作具有挑战性。开窗法显著限制了可用于注射和显微外科操作的微血管数量8。因此，仅能对早期胚胎进行操作，且无法实现连续观察。早期采用培养皿进行的体外（ex-ovo）培养应用受限，因为胚胎表面张力难以有效控制，导致无法长期培养9。我们近期通过使用六边形称量皿改进了该技术，可维持适宜的表面张力7，但此类培养体系在运输过程中仍存在困难。本文所介绍的技术解决了这一问题，并显著拓展了可应用的实验方法和成像技术类型，包括显微注射和外科手术操作。随着研究重点转向对后期形态发生事件的理解，该技术将有助于对目前难以持续进行实验研究的发育过程进行监测与调控。

<table><tbody><tr><td>可育的白来航鸡鸡蛋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model GB1，Avery Incubators，Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶圈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>温热的无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 盎司塑料杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直径 100 mm 的培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1602N 热风循环装置</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记的葡聚糖（2 MDa，磷酸盐缓冲液中 1% w/v）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微玻璃针拉制仪</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（内径 0.75 mm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model M3301L</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>精细 55 号镊子</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 尼龙外科缝合线</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>VWR international</td><td></td><td>外径 1 mm</td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器及吸头</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种适用于成像与显微手术应用的ex-ovo鸡胚培养系统

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

理解驱动正常与异常胚胎发育的遗传因素和微环境因素之间的关系，对于发现新的治疗策略至关重要。成像技术的进步使得研究人员能够对体轴结构的形成与成熟过程进行定量研究，但对较晚期胚胎形态发生的理解仍不够清晰。鸡胚胎是该研究领域中一种具有吸引力的脊椎动物模型系统，因其易于培养并可进行手术操作。早期胚胎可短暂培养在滤纸环上，从而为细胞模式形成与命运追踪研究提供完整的光学通路1,2。对于心脏形态发生等较晚期发育过程的研究，传统上通过蛋壳开窗进行3-5，但该方法因窗口尺寸限制而影响光学观察。我们此前开发了一种简单的方法，可将整个胚胎在体外培养于六边形称量皿中，最长可达10天，并实现了通过超声成像进行高分辨率观察6,7。然而，此类培养系统在运输过程中存在困难，限制了活体实验中可用的成像工具类型。本文中，我们提出一种改进的无壳培养系统，配备低成本、可携带的环境控制舱。将鸡蛋打破后置于由聚氨酯膜（保鲜膜）固定在部分盛有无菌水的塑料杯边缘所形成的吊床结构上。吊床的周长和深度尺寸均至关重要，以维持必要的表面张力，而吊床本身及其下方水体的力学特性有助于缓冲运输过程中产生的振动。此外，我们还开发了一种小型循环水浴装置，可在实验过程中实现持续的温度控制。我们证明，利用该系统可成功培养胚胎至少14天，且不出现形态发生缺陷或发育延迟，并已将该系统应用于多种显微手术与成像实验中。

本文介绍了一种简单的技术，可用于实现禽类胚胎的长期体外培养。ex-ovo 培养技术特别适用于需要对禽类胚胎进行全程光学观察和/或无菌转运的纵向实验研究。

理解驱动正常与畸形胚胎发育的遗传因素和微环境因素之间的关系，是……的基础。

在X ovo鸡胚培养系统中，制备受精卵壳离体鸡胚培养物可用于研究胚胎发生过程。该操作程序首先获取受精鸡卵，并在37.5摄氏度条件下孵育72小时。随后制备用于承载带有发育中胚胎的蛋黄的吊床结构。接下来，可以将蛋黄转移到吊床状装置上，胚胎发育将在蛋壳外继续进行。该技术可用于血管内显微注射、超声成像和显微手术，其结果可揭示胚胎在正常和受干扰条件下的发育过程。大家好，我叫Akshay Shaker，是康奈尔大学生物医学工程系Jonathan Butcher领导的心血管发育生物工程实验室的一名硕士研究生。与以往的方法（如卵内鸡蛋培养）相比，我们的技术主要优势在于能够完全光学接触胚胎，并且在不造成损伤的情况下方便运输。大家好，我叫Char Hin，是康奈尔大学生物医学工程系Jonathan Chu实验室心血管发育生物工程实验室的博士后研究员。该方法有助于回答发育生物学领域中的一些关键问题，例如心脏缺陷在胚胎发生过程中是如何形成的。在开始此操作之前，使用70%乙醇擦拭对所有材料进行消毒。开始操作时，用温热的无菌水填充一个九盎司塑料杯的四分之三。根据需要重复此步骤，直至完成所有杯子的处理。一个标准的九盎司杯子的顶部直径为八厘米，此尺寸最适合本文所述的延长培养应用。接下来，剪取一段20厘米长的保鲜膜。用一块保鲜膜盖住装有温热无菌水的9盎司塑料杯杯口，并用橡皮筋固定保鲜膜。此操作中保鲜膜最为合适，因为它可防止蛋黄粘连，从而避免蛋黄破裂。在运输过程中，应将保鲜膜铺开，使其接触水面顶部。剪去胶带周围的多余塑料，并擦拭塑料表面。使用浸有70%乙醇的无尘擦拭布清洁吊床后，即可用于承载胚胎。受精的鸡卵在孵化前可在13摄氏度下保存最多五天。在不启动发育的情况下，红葡萄酒冷却器可维持此温度，使鸡蛋处于适合培养的状态。通过将鸡蛋置于60%恒定湿度的培养箱中，在37.5摄氏度下持续摇动培养72小时，以启动胚胎发育。当鸡蛋发育完成后，将其从培养箱中取出。用浸有70%乙醇的Kimwipe纸巾擦拭鸡蛋表面以进行消毒。将鸡蛋水平侧放在蛋托上，静置一到两分钟，以确保胚胎处于适当位置。每次操作最多处理六个鸡蛋，因为同时尝试敲开超过六个鸡蛋会增加操作难度。可能导致胚胎在室温下停留过久，从而影响其活性。一到两分钟后，胚胎已滑至卵的顶部。为将每个胚胎转移至吊床中，需在超净工作台内无菌操作。首先，使用金属桶边缘或玻璃烧杯边缘等锋利边缘轻轻敲击鸡蛋的底部。请注意，胚胎位于鸡蛋的上侧。用两个拇指向两侧轻轻拉开，将蛋壳的两半分开。然后将胚胎、卵黄和蛋白放置到吊床上。蛋白可为卵黄周围提供一个缓冲环境，吸收因移动系统而产生的震动。在长时间培养过程中，蛋白还能为胚胎提供营养。如果胚胎移植操作得当，胚胎应已位于上方。若胚胎位于下方，可使用闭合曲线形小剪刀或其它类似的钝头工具轻轻摩擦卵黄，使其自身旋转，从而使胚胎移至上方。若需将胚胎培养至胚胎期第七天以后，应在胚胎周围边缘散布粉碎的蛋壳碎片，作为骨骼发育和成熟所需的钙源。胚胎转移完成后，将一个直径为10厘米的培养皿盖在杯子上以密封胚胎。将吊床放入设定为37.5摄氏度的培养箱中。如果使用便携式培养箱，还需在培养箱内放置一到两个装有水的9盎司杯子。为了保持约60%的湿度，胚胎可继续发育，并可用于显微手术应用中的显微注射。该胚胎培养方法适用于需要将溶液注射至血管系统的显微注射操作。首先准备注射装置，从制备针头开始，使用微型拉针仪将玻璃毛细管拉制成斜面尖端的微针。针尖的大小取决于所需的流速。将微针注射器连接到内径为0.03英寸的硅胶管。用待注射的溶液填充注射器管路，并将微针注射器连接到管路上。将微针放置在显微操作仪上，并将注射器固定于注射器架或注射泵中。待注射装置准备就绪后，取出胚胎。为使微针正确进入血管（如重要血管），需进行水平穿刺。因此，胚胎需要与盛放它的杯子边缘处于同一水平。为了抬高胚胎，先取下固定塑料膜的橡皮筋，该塑料膜用于支撑胚胎。轻轻抬起塑料膜的一侧，在不显著移动胚胎的情况下向杯中加入一些水。然后再次将橡皮筋放在塑料膜上。现在胚胎已经抬高，可以将溶液注入胚胎的血管中。注意，在注射重要血管时，微针的尺寸应约为血管直径的十分之一。为了在不引起出血的情况下维持有效的灌注，首先将溶液泵入微针，确保内部无气泡残留。接着，将微针尖端与选定的活性血管对齐。选择一个区域可为靶向血管提供最大操作面积。确定注射区域后，将针头推向血管。血管会首先回缩。一旦针头刺入并开始灌注，流动血液的颜色会随着灌注而发生变化。如果未观察到颜色变化，可能是针头已穿透血管。此时，应缓慢回撤显微注射针，同时持续泵入溶液，直至血管内出现可见的颜色变化。灌注完成后，轻柔地将显微注射针从血管中抽出。该胚胎培养方法也适用于显微外科操作，例如在孵化第四天进行的左心房结扎术。首先，使用10-0尼龙外科缝线制备直径为0.5毫米的结。用精细镊子去除胚胎的绒毛膜和羊膜。从胚胎背部将其提起，并垂直旋转，使胚胎左侧朝上并便于操作。随后，去除左心房上方的心包膜。将结置于左心房上方，用镊子从两侧夹持并拉紧，使结扎程度约为原始血流的75%。使用显微剪刀剪除结扎线的线头，并小心移除多余的缝线后弃置。最后，将胚胎旋转回原始方向，使右侧朝上。图中所示为不同发育阶段的胚胎，已在体外培养，如刚才所示，水循环加热器可长时间维持环境条件，这在成像和显微外科操作过程中可能是必需的。采用X ovo方法培养的鸡胚适用于显微注射。在本实验中，将一种荧光染料注入X ovo培养的鸡胚血管系统中。采用X ovo方法培养的鸡胚也适用于显微手术。在本实验中，对体外培养的X染色体缺失（XO）鸡胚进行了左心房结扎手术。一旦掌握技术，每个鸡胚的体外培养过程可在约五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何建立适用于成像和显微外科操作且需要转运培养物的XO鸡胚培养体系。

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生物学

一个 EX - OVO鸡胚胎培养系统适用于成像和显微外科的应用

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