Name: 含量自发活动，研究昼夜节律和睡眠参数果蝇 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 8 s
Description: 学习使用DAM活动监测系统和行为分析软件来记录和分析果蝇的昼夜节律与睡眠表型。该方法通过监测运动活动节律，帮助研究人员理解生物钟的遗传与环境调控机制。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为授予 I. E 的 NIH34958 和授予 J. C. 的 NS061952。

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
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<li>Konopka, R. J., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clock mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).</li>
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<li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+tissue-specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li>
<li>Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+locomotor+activity+rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).</li>
<li>Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+entrainment+of+Drosophila%27s+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64, 251-266 (2009).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZordan%2C+MA+%22In+Circadian+Rhythms+Methods+and+Protocols%22">In Circadian Rhythms Methods and Protocols</a>. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本方案中，我们描述了用于测量的步骤 黑腹果蝇 运动活动节律，是果蝇生物钟可靠的行为输出，被用作检测生物钟功能的标准指标。该检测方法已用于大规模筛选新的生物钟突变体（例如 Konopka 和 Benzer 1971；Dubruille 等 2009）并持续用于解析和理解生物钟功能 体内它还被用于研究果蝇的睡眠-觉醒周期，尽管最近的报告表明，与利用运动活动节律相比，视频数字分析在量化睡眠方面更为可靠（Zimmerman 等 2008）。当利用运动活动节律分析睡眠时，白天睡眠百分比往往被高估。
为确保本实验方案的成功与可重复性，必须检测在年龄、遗传背景和培养条件上尽可能一致的果蝇，因为果蝇的行为表型（如昼夜节律和睡眠/休息活动）对上述所有因素均极为敏感。若在单次实验中使用多个培养箱，需确保所有培养箱均达到预期温度，因为某些昼夜节律参数可能随温度变化而改变。在选购用于果蝇实验的培养箱时需特别注意：不同产品的性能并不相同。尽管我们不倾向于推荐特定型号，但市场上存在多种选择。查找销售果蝇培养箱公司的相关信息时，一个可靠的资源来源是 果蝇 提供的工作在 &lt;www.flybase.org&gt;一些公司甚至出售“果蝇 “昼夜节律”培养箱，具备更多附加功能，例如已预装与Trikinetics系统兼容的线路以及温度梯度控制功能（如Tritech）。重要功能包括能够在生理温度范围内实现昼夜光照控制和良好的温度调控能力 果蝇 （约15–30°C）。培养箱的价格和尺寸差异较大，但随着Trikinetics公司新型活动监测仪的推出，即使是小型培养箱也能容纳相当数量的设备。此外，尽管可使用带湿度控制功能的培养箱，但只要放置一个盛有水的小托盘以提供湿度（50–70%即可），该附加功能并非必需。最后，尽管本方案中我们常规使用FaasX和Insomniac进行数据分析，但也存在其他可选程序和软件（Rosato和Kyriacou 2006），例如ClockLab（ActiMetrics）、Brandeis Rhythm Package（D. Wheeler，贝勒医学院，休斯顿）和MAZ（Zordan） 等 2007).

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;活动监测仪（DAM）</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>DAM2 或 DAM5</td><td>DAM2 型号更紧凑，可在单个培养箱中容纳更多设备</td></tr><tr><td>DAM 系统电源接口单元</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>PSIU9</td><td>包含 PS9-1 交流电源</td></tr><tr><td>光照控制器</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>LC6</td><td></td></tr><tr><td>派热克斯玻璃管</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>PGT5、PGT7 和 PGT10</td><td></td></tr><tr><td>塑料活动管帽</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>CAP5</td><td>可用纱线代替塑料管帽</td></tr><tr><td>DAM 系统数据采集软件</td><td>Trikinetics Inc.；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td></td><td>提供适用于 Mac 和 PC 的版本</td></tr><tr><td>FaasX 软件</td><td>法国国家科学研究中心</td><td></td><td>仅适用于 Mac</td></tr><tr><td>Insomniac 2.0 软件</td><td>匹兹堡大学医学院</td><td></td><td>基于 Matlab 运行，可在 PC 和 Macintosh 系统上使用</td></tr><tr><td>具备温度与昼夜节律控制功能的环境培养箱，例如 Percival 培养箱</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I-30BLL</td><td>内部空间尺寸：宽度 65 cm；高度 86 cm；深度 55 cm</td></tr><tr><td>具备温度与昼夜节律控制功能的环境培养箱，例如 DigiTherm 加热/制冷培养箱，配备昼夜定时照明与温度控制</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>05DT2CIRC001</td><td>内部空间尺寸：宽度 36 cm；高度 56 cm；深度 28 cm</td></tr><tr><td>APC Smart-UPS 2200VA 120V（应急电源备份装置）</td><td>APC</td><td>SU2200NET</td><td>输出功率容量为 1600 瓦</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养用琼脂（Bacto Agar）</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TissuePrep 石蜡颗粒</td><td>Fisher Scientific</td><td>T565</td><td>熔点为 56&amp;#x00B0;C–57&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>加热块</td><td>VWR international</td><td>12621-014</td><td></td></tr></tbody></table>

检测运动活性以研究昼夜节律和睡眠参数 果蝇

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

大多数生命形式在细胞、生理和行为现象上都表现出由内源性昼夜（circadian）节律驱动的日常节律&equiv;24小时）起搏器或生物钟。人类昼夜节律系统的功能障碍与多种疾病或紊乱相关。通过对遗传筛选的研究，利用易于测量的行为节律作为生物钟功能的读出指标，我们在理解昼夜节律机制方面已取得显著进展。相关研究采用 果蝇 在昼夜节律的细胞与生化基础研究方面做出了开创性贡献。标准的昼夜节律行为检测指标通常测量 果蝇 是运动活动。通常，监测系统包含专门设计的设备，可用于测量生物体的运动活动 果蝇这些设备安置在暗室内的环境可控培养箱中，通过红外光束的阻断来记录置于小管内的单只果蝇的运动活动。当持续测量多天时， 黑腹果蝇 表现出活动与非活动的每日周期，这种行为节律由动物体内的内源性昼夜节律系统所调控。随着商业化运动活动监测设备的出现以及数据分析软件的发展，整体实验流程已得到显著简化。我们采用Trikinetics公司生产的系统，该系统是目前全球使用最广泛的装置，本文所述即为其操作流程。近年来，相同的监测设备已被用于研究睡眠行为 果蝇由于可以同时测量大量果蝇的每日清醒-睡眠周期，且通常仅需1至2周的连续运动活动数据即可，因此该系统非常适合用于大规模筛选以鉴定 果蝇 表现出昼夜节律或睡眠特征的改变。

我们描述了记录每日运动活动节律的实验步骤 黑腹果蝇 以及后续的数据分析。运动活动节律是动物生物钟可靠的生理行为输出指标，在研究昼夜节律突变体或探究环境如何调控昼夜节律系统时，常被用作评估生物钟功能的标准读出指标。

绝大多数生命形式在细胞、生理和行为现象上均表现出由内源性昼夜节律（约24小时）驱动的日常节律。

以下实验的总体目标是通过检测果蝇的运动活动日节律，来表征其昼夜节律和睡眠表型。该目标可通过构建转基因果蝇、获取特定突变体或设置必要的杂交以准备实验动物来实现。第二步需要制备含有食物来源的玻璃活动管，这些活动管将作为实验期间果蝇的栖息环境。接下来将一至五日龄的果蝇放入活动管中，然后将活动管装载到DAM活动监测仪中，以监测其运动活动节律。利用DAM系统获得的结果可揭示昼夜节律和睡眠参数方面的缺陷与变异，这些分析基于软件（如far sex和insomniac）对每日运动活动节律的解析。该方法有助于回答昼夜生物学领域中的关键问题，例如哪些蛋白质和调控机制参与了正常节律的产生，以及光和温度等环境因素如何通过特定的分子通路调节行为节律。运动活动监测系统涉及多种设备，例如专用监测装置、具备昼夜光照控制能力的环境培养箱、数据采集装置、计算机以及外设材料（如线路）。应选择一个通风良好、具备温度控制功能的暗室来安置运动活动监测系统，以避免培养箱负荷过重，并确保能够维持稳定的温度。暗室需与外部光源完全隔绝。操作时无需完全在黑暗中进行，因为果蝇的昼夜节律系统对红外光不敏感。因此，在需要于暗室中观察的情况下，我们只需使用一个标准的手电筒，并在其前端覆盖一个购买的红色滤光片。此外，还需配备一个不间断电源应急备用装置，其瓦特容量足以支持活动监测系统的各个组件。如果建筑物内发生电压骤升或断电情况，请将不间断电源应急备用装置连接至建筑物的应急备用电路（如有）。如果培养箱内的照明控制系统并非由培养箱本身直接调控，则只需将培养箱插入应急电源即可，无需使用不间断电源，因为短暂几秒的断电不会影响培养箱内的温度。接下来，设置一台计算机（PC 或 Macintosh），专门用于数据采集和/或培养箱的控制。手动将电话线网络整齐地布置在环境控制培养箱的支架周围，以便于活动监测设备的插拔操作。将多个电话线以并联方式布置，使其汇入一条主线，并从培养箱中引出后连接至计算机；通过电源接口单元将培养箱内的监测设备连接到计算机，该单元可通过电话线为活动监测仪供电。最后，使用胶带或黑色布料遮蔽电子设备的LED光源或密封不严的培养箱门，以确保在无非预期光照的条件下测量自由运行的节律。使用在相同环境条件下饲养且年龄相同的适当对照动物来评估这些表型至关重要。此外，昼夜节律存在性二型性。通常的做法是使用在25摄氏度下培养、日龄在1至5天之间的成年雄性果蝇进行这些检测，因为雌性果蝇的产卵活动会影响运动行为真实性的测量。在检测特定突变果蝇的昼夜节律和睡眠-觉醒参数时，应将突变品系与相同遗传背景的野生型品系进行杂交。 例如，W 1118 或 yw。由于果蝇雄性不发生染色体交换，因此最好通过将突变型雌性与野生型雄性杂交来进行杂交实验，同时接种野生型对照和突变型果蝇。在标准果蝇培养基中培养约 10 至 14 天，待子代羽化后，收集 1 至 5 日龄的雄性果蝇，留作实验使用。活动管代表果蝇的栖息环境。实验过程中，活动管是细长的直径五毫米的玻璃管，一端含有食物物质，另一端用纱线或塑料塞密封。建议使用 freshly made 的活动管。它们通常需在实验开始前数天至一周进行准备。由于玻璃活动管可多次重复使用，以下制备步骤以已使用过且未清洁的活动管作为起始材料进行描述。如果您使用的是新的活动管，可直接跳至后续所示的活动管高压灭菌步骤。将使用过的活动管的塞子取下，并放入大玻璃烧杯中。管子的量不应超过烧杯容积的一半。向烧杯中加入自来水，确保完全浸没管子。将装有玻璃管的烧杯放入微波炉加热，直至水完全快速沸腾。融化石蜡和琼脂培养基时需小心，因为水温很高。从微波炉中取出烧杯，用刮勺或塑料棒搅拌试管。使用10毫米移液管使被困的石蜡浮至顶部。然后重复微波处理步骤。将烧杯从微波炉中取出，并等待其冷却。将烧杯放入冷室可加快该过程。随着水温降低，石蜡将聚集在水面并逐渐凝固。用手去除凝固的石蜡。这将去除试管上的大部分石蜡。将反应管转移至另一个装有新鲜自来水的烧杯中，重复微波和去除石蜡的步骤。由于大部分石蜡已在前一步骤中被去除，因此无需等待石蜡凝固。将烧杯中的水倒出，然后将试管转移至新的烧杯中。由于水仍然很热，请小心操作。最后一次重复微波处理过程。将烧杯中的水倒出，并等待反应管冷却。接着，将反应管垂直放入250毫升或500毫升的玻璃烧杯中，注意不要放置过密。通过使用带有干燥程序的高压灭菌器或直接在干燥烘箱中干燥试管，对试管进行灭菌，以准备将食物装入活动管中。在蒸馏水或自来水中配制5%蔗糖和2%细菌培养用琼脂的溶液，然后对该溶液进行高压灭菌。高压灭菌后的食物可立即使用，也可在4摄氏度下长期保存。理想情况下，食物的温度应保持在约 65 摄氏度，以填充活动管。使用 10 毫升移液器将液体食物溶液沿玻璃烧杯内壁移入，从底部向上填充至管体积的三分之一处。轻轻旋转烧杯，确保所有管子均匀地充满食物溶液。在室温或4摄氏度条件下等待食物完全凝固。当玻璃管内的冷凝水消失后，即可将管子从烧杯中取出。从烧杯中取出活动管时，应将管子向下推并同时旋转，使管内已凝固的食物与烧杯底部分离。将试管从烧杯中取出，最好一次性成束取出。接着，用纸巾逐根擦拭试管，去除试管外表面多余的培养基。将试管置于洁净的容器中备用。取一个不带管架的通用实验室块状加热器，小心地将加热孔覆盖。用多层结实的铝箔包裹加热孔内壁，加入石蜡颗粒至铝箔衬里的加热孔中使其熔化。手持管子的非接触食物端，将接触食物端浸入熔化的石蜡中。将涂有石蜡的部分浸入盛有冷水的玻璃烧杯中，以加快石蜡凝固。重复上述操作。将石蜡管浸入水中后，可防止管子相互粘连。这些管子可立即使用，或储存于密封容器中，并在4°C条件下保存以备后续使用。若储存超过一周，食物会因过度干燥而影响实验效果。若试管保存在 4 摄氏度条件下，使用前应将其置于实验台面上，使其升至室温。在将果蝇装入活动监测管之前，打开将用于放置活动监测仪的培养箱。根据实验设计要求，通过培养箱的控制装置调节温度，并使用 DAM 系统光照控制器或培养箱自带的光照控制系统设置明暗循环周期。接下来，用二氧化碳麻醉果蝇。然后使用细小的画笔，将一只果蝇轻轻转移至活动管中。用精细镊子夹住一段长约半英寸的纱线中部，将纱线插入活动管的非食物端，以堵塞开口，防止果蝇在实验过程中逃逸。同时让空气进入试管，将试管保持侧放状态，直到果蝇苏醒，以防止果蝇粘附在食物上。随后将试管插入活动监测仪中。对于较新型号的Tri Kinetics紧凑型监测仪，需使用橡皮筋固定试管，以确保红外光束穿过试管的中心位置。最后，将活动监测仪放入培养箱中，并通过电话线连接至数据采集系统进行检测。使用DAM系统采集软件，确保所有监测设备均已正确连接，并且正在从每台设备采集数据。现在果蝇已被装入活动管中，且运动活动监测系统已准备就绪，可以开始记录数据。通过将果蝇暴露于设定的光照、黑暗或明暗循环（LD）以及温度条件下，持续两到五整天，使其生物节律同步并适应环境。最常用的同步化条件是在25摄氏度下进行12小时光照、12小时黑暗的光暗循环。在此方案中，研究昼夜节律时，将培养箱中光照开启的时间定义为ZT（Zeitgeber时间）0点，其他所有时间均相对于该时间点。在标准的12小时光照/12小时黑暗（LD）条件下，野生型果蝇（rosophila melanogaster）通常表现出两次活动高峰，一次集中在ZT 0点附近，称为早晨峰；另一次集中在ZT 12点附近，称为傍晚峰。自由运行的运动节律则在持续黑暗且温度恒定的条件下进行测量，以评估其内在节律特性。在LD周期的最后一天的暗期，可随时更改光照周期的设置，使得实验的下一天代表DD周期的第一天。连续七天的DD数据采集足以计算果蝇的昼夜节律周期以及节律的振幅或强度。通常情况下，为了获得特定基因型可靠的自由运行周期，至少需要16只果蝇的样本量。实验结束后，使用 DAM 系统软件采集的原始二进制数据将被下载到便携式数据存储设备上，例如 U 盘。原始二进制数据需通过 DAM File Scan 1 0 2 x 软件进行处理，在分析昼夜节律参数时，数据将被汇总为 15 分钟或 30 分钟的时间段；在分析睡眠时，则汇总为 1 至 5 分钟的时间段。静息参数。目前，果蝇中睡眠静息的标准定义为连续五分钟的不活动期。完成本实验方案后，可利用同一数据集比较实验组与对照组动物的昼夜节律及睡眠参数。在明暗循环（LD）或持续黑暗（DD）条件下，可通过活动记录图展示果蝇数日内的每日运动活动或平均活动情况。黑腹果蝇通常表现出两次活动高峰，一次集中在ZT 0左右，称为早晨峰，另一次集中在ZT 12左右，称为傍晚峰。这两次活动高峰由内源生物钟控制，即使在自由运行的DD条件下仍可观察到。在活动记录图中可清晰观察到这些活动峰时间的变化，这可能提示内源生物钟特性的改变。另一项可指示生物钟正常功能的特性是在明暗循环（LD循环）中出现的运动活动预先增加现象，即在实际的暗转明或明转暗过渡之前，活动水平会提前上升。这种行为在野生型果蝇中表现明显，但在per⁰突变体中则缺失且表现为无节律性。在该突变体中。观察到的明暗条件下活动的早晨和傍晚高峰纯粹是由于光照条件突然变化引起的惊吓反应。无节律钟基因的果蝇并不能预判环境变化，而仅仅是对其作出反应。在持续黑暗（DD）条件下，行为节律性的丧失更为显著，通常表现为运动活动的早晨或傍晚高峰完全消失，如 per⁰ 果蝇中所见。除了诱导图外，运动活性数据还可以以双图谱形式表示每只果蝇或每种果蝇基因型的数据，其中两天的数据在每一行上依次绘制，而前一天的活动曲线则开始下一行的两天活动数据。例如，在ACTO图谱的第一行绘制LD第一天和第二天的数据。下一行则从重复绘制LD第二天开始，随后是LD第三天，依此类推。按照此格式，整个实验过程中的运动活动数据以ACTO图形式展示。与简化图相比，ACTO图的一个优势在于能够轻松观察每日活动节律周期长度的变化。除了生成诱导图和ACTO图之外，这些节律变化也可被清晰识别。来自DD条件的运动活动数据可提交至far X，利用多种不同程序计算周期长度，包括用于分析睡眠和静息参数的cycle P，其中静息定义为连续五分钟不活动。可使用基于MATLAB的程序insomniac分析运动活动检测所记录的数据，并检测多种睡眠参数，还可计算果蝇在不同时间间隔内的睡眠时间百分比，例如每小时或每12小时的睡眠百分比。其他可检测的更常见睡眠参数还包括平均静息片段长度，该参数用于衡量睡眠的连续程度，可反映睡眠质量。另一个参数是觉醒活动次数，用于衡量果蝇在清醒状态下的活动速率。该参数有助于区分真正存在睡眠或静息行为异常的果蝇与因疾病或过度活跃而表现异常的果蝇。例如，一些果蝇可能只是因为生病而导致活动能力下降，从而看似睡眠增多。对于这些果蝇而言，其清醒状态下的活动水平将低于对照组动物。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过检测运动活动的昼夜节律来鉴定果蝇的昼夜节律和睡眠表型。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

含量自发活动，研究昼夜节律和睡眠参数果蝇</em

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在本视频文章中，我们介绍了一种利用红外捕获（IR）型激光显微切割技术（LCM）从三龄幼虫中分离单个或多个黑腹果蝇（Drosophila）da神经元的方法。从分离的神经元中获得的RNA可直接用于后续实验，包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）或微阵列分析。...

激光捕获显微切割 果蝇 外周神经元

学习使用DAM活动监测系统和行为分析软件来记录和分析果蝇的昼夜节律与睡眠表型。该方法通过监测运动活动节律，帮助研究人员理解生物钟的遗传与环境调控机制。

检测运动活性以研究昼夜节律和睡眠参数果蝇

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