瓣膜内皮细胞的分离

本视频方案演示了如何从主动脉心脏瓣膜中分离出驻留的间质细胞以及特定侧面的内皮细胞。将瓣膜小叶从心脏中取出后置于冷生理盐水中。通过在胶原酶溶液中用棉签轻轻刮擦浸没的组织，可从瓣膜小叶两侧分离内皮层；若需进行特定侧面的分离，则将瓣膜小叶固定在石蜡床上，使内皮表面暴露。

随后向瓣膜小叶加入几滴冷的胶原酶，并将小叶孵育5至10分钟。胶原酶孵育后，通过轻轻刮擦组织去除特定侧面的内皮层。使用拭子收集释放的内皮细胞，洗涤后进行接种培养。

随后将剩余的小叶消化过夜，以分离间质细胞，并对分离的细胞进行收集和洗涤。所有分离得到的细胞均进行培养，可用于研究其在局部机械和生物信号刺激下于心脏瓣膜修复与重塑过程中的作用。大家好，我叫Russell Gould。

我目前在康奈尔大学生物医学工程系的Butcher实验室工作。今天我将向您展示如何分离瓣膜内皮细胞。该技术的意义在于帮助我们理解 resident V 细胞如何响应机械和生物信号进行持续的修复与重塑。

那么，让我们开始吧。首先，从当地屠宰场获取一头猪，并在无菌条件下切除主动脉根部。用生理盐水彻底冲洗主动脉根部的血液。

使用冰冷且无菌的 DPBS，必须尽快彻底清除所有血液成分，以减少瓣膜内皮细胞（VEC）的死亡和细菌污染。此阶段不建议使用抗生素和抗真菌剂，因为它们可能对内皮细胞（ecs）造成损害。接下来，直接从主动脉根部进行分离。

每个瓣膜的瓣叶。分离瓣叶时应谨慎操作，因为任何瓣环组织都会污染细胞群体。将分离的瓣叶置于含有12毫升冷DPBS的无菌15毫升锥形管中。

多次振荡以去除碎片，并用新鲜的DPBS重新填充。最后将瓣膜瓣片置于冰上运回实验室。到达实验室后，将装有组织的容器置于超净台内，随后分离内皮层，并在带盖器械盘中对以下物品进行高压灭菌：带齿组织镊、组织剪和棉签。

同时准备无菌胶原酶溶液、内皮细胞培养基和间质细胞培养基，具体步骤详见随附的书面实验方案。每个瓣膜加入三毫升冰冷的胶原酶溶液，将15毫升离心管中的三个瓣叶全部放入无菌35毫米培养皿中。

将组织在 37 摄氏度下孵育 5 至 10 分钟。接着，用干燥的无菌棉签在小叶两侧表面轻轻旋转，以去除内皮层。旋转方向和施加的剪切力大小对样本纯度至关重要。

棉签的旋转方向与持棉签手的直线运动方向相反。这种反向运动产生可控的剪切力，从而将内皮细胞从组织上剥离。施加的力度应足以感受到组织的阻力，但不得穿透基底膜；可偶尔将棉签在胶原酶溶液中轻蘸，以使细胞从棉签纤维尖端脱落。

完成刮取后，内皮层的质地应比之前略显光滑。收集悬浮在胶原酶溶液中的细胞，并转移至一个新的无菌15升离心管中。刮取完瓣叶上的内皮细胞后，立即将瓣叶放入含有10毫升胶原酶溶液的15毫升离心管中，用于间质细胞的分离。

将离心管在室温下以1000 RPM离心五分钟，使分离的细胞沉淀，吸除上清液。向15毫升离心管中加入三毫升内皮细胞培养基。再次以相同条件离心，并吸除培养基。

第二次离心有助于滤除一些不需要的物质，例如移液器吸头纤维。将离心后的内皮细胞重悬于5 mL内皮细胞培养基中，并接种至预先包被胶原蛋白的T25培养瓶中。每个离心管使用一个培养瓶，细胞接种后至少培养两到三天再更换内皮细胞培养基。

这有助于细胞恢复并分裂。由于分离过程较为剧烈，且细胞得率可能较低，因此必须在细胞接近汇合时进行传代。由于接触抑制可能导致细胞转化，因此也可从特定一侧分离内皮细胞。

为此，首先准备一个含有石蜡床线的培养皿。使用直径60毫米的玻璃培养皿并衬有铝箔。每片小叶计算使用两个玻璃培养皿。

铝箔有助于去除石蜡，以便重复使用培养皿。接下来，将石蜡珠放入培养皿中，装至约半满，盖上盖子进行高压灭菌。高压灭菌完成后，石蜡已融化，此时将整套培养皿转移至凉爽平坦的表面上。

随着石蜡冷却，其会硬化并形成一层可支撑针头穿刺的结构。60分钟后，即可使用已灭菌的培养皿固定瓣膜组织。将从瓣膜分离的瓣叶从15毫升离心管中取出，放置于石蜡床表面。

将瓣叶调整至心室面朝下，贴于石蜡表面，使纤维化面暴露。用针固定瓣叶边缘，以暴露内皮层。随后，在每个朝上的内皮表面滴加数滴冷胶原酶，并将组织在37摄氏度下孵育5至10分钟。

孵育完成后，用无菌干燥的棉签在瓣叶表面轻轻旋转，以先前相同的方式小心去除内皮层。偶尔将棉签在胶原酶溶液中轻蘸，以使细胞从棉签纤维尖端脱落。完成擦拭后，内皮层的质地应感觉比之前略为平滑。

收集细胞悬液并转移至新的无菌15毫升离心管中。来自同一瓣膜的标签小叶可合并在一起，并注明侧向特异性。用几滴冷的DPBS冲洗固定瓣膜，以去除残留的细胞或碎片。

将小叶转移到新的培养皿中，使心室面暴露，然后按照上述方法收集内皮细胞。完成从G小叶刮取内皮细胞后，立即将小叶放入含有10毫升胶原酶溶液的15毫升离心管中。洗涤细胞沉淀，重悬并培养，操作方法同非部位特异性内皮细胞的分离。

如果细胞得率很低，可考虑换用更小的培养瓶或使用多孔板。由于细胞间的黏附有助于细胞生长，因此请在细胞接近汇合时进行传代。由于接触抑制可能导致细胞转化，因此在离心内皮细胞的同时，开始进行间质细胞的分离，并将含有瓣叶的试管孵育约12至18小时。

在胶原酶溶液中，可根据需要轻轻振荡。消化孵育结束后，使用血清移液管轻轻混匀消化后的组织，直至细胞悬液变得均匀。此均质化过程有助于进一步解离组织并释放间质细胞，随后参照内皮细胞的方法进行离心和洗涤。

除使用5 mL间质细胞培养基重悬外，将离心所得的间质细胞重悬于15 mL间质细胞培养基中，并将细胞接种至T75培养瓶中，每根离心管使用一个培养瓶。在更换间质细胞培养基前，让细胞至少生长一至两天，与内皮细胞相比，此时可能含有更多组织碎片。此外，间质细胞本身比内皮细胞更快达到汇合状态，且在这些代表性图像中可获得更高的细胞产量。

培养2至3天后，展示了瓣膜内皮细胞（V Cs）和瓣膜间质细胞（vs. Valvular interstitial cells）的形态。Becs呈现出典型的内皮细胞形态，细胞呈鹅卵石样排列，并开始形成簇状结构。

VS. 培养至汇合时，其细胞形态类似于肌成纤维细胞，通常呈梭形，且分布稀疏；ECS 则表现出典型的内皮细胞形态，细胞呈鹅卵石样排列，生长具有接触抑制性。VI CS 的形态也类似于肌成纤维细胞，细胞通常呈梭形，且无接触抑制。VEC 和 VIC 的功能特性可通过染色进行推断，例如对乙酰化低密度脂蛋白（LDL）的摄取。

VEC 细胞与高水平的乙酰化低密度脂蛋白（LDL）摄取相关。而 VIC 细胞则与低水平的乙酰化 LDL 摄取相关，此处展示了 VEC 和 VIC 的细胞标志物。ECS 细胞对血管性血友病因子（von Willebrand factor）染色呈阳性，而 vs.

不呈现血管性血友病因子染色。此外，静脉内皮细胞对α-平滑肌肌动蛋白染色呈阴性，而动脉内皮细胞对α-平滑肌肌动蛋白染色呈阳性。好了，希望你们今天从我们的分离实验中学到了很多内容。

但需要注意的是，内皮细胞基底膜非常脆弱，对基底膜下基质的任何破坏通常都会导致组织中其他细胞的污染。为了确认分离是否成功， characterization 是评估所分离细胞纯度的关键步骤。祝你好运。