Name: 禽流感胚胎瓣膜祖细胞的分离和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-27T17:35:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 了解如何从禽类胚胎中分离和培养HH14瓣膜心内膜细胞及HH25瓣膜间充质细胞。本方法使用胶原凝胶三维培养技术，为研究心脏发育生物学提供可靠的体外模型。

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本研究由哈特韦尔基金会、美国心脏协会（科学家发展资助 #0830384N）和勒杜克克基金会（Mitral 07CVD04）提供支持。

1. 准备
<ol>
	<li>将可孵化的鹌鹑蛋或鸡蛋在60%湿度和37°C条件下培养至14-期（约2天）或25期（约4.5天）。</li>
	<li>制备无菌Earl's平衡盐溶液（EBSS）
 <ol>
		<li>将100 mL 10X EBSS加入600 mL 18 MΩ水中</li>
		<li>加入2.2 g碳酸氢钠</li>
		<li>调节溶液pH至7.2</li>
		<li>加水定容至1000 mL</li>
		<li>通过0.2 μm滤膜过滤除菌</li>
 </ol>
 </li>
	<li>制备无菌M199培养基
 <ol>
		<li>将一包M199粉末加入700 mL 18 MΩ水中</li>
		<li>加入2.2 g碳酸氢钠</li>
		<li>调节溶液pH至7.2</li>
		<li>加入10 mL（1%）青霉素-链霉素溶液</li>
		<li>加水定容至1000 mL</li>
		<li>通过0.2 μm滤膜过滤除菌</li>
		<li>加入1 mL无菌100X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂</li>
		<li>加入10 mL（1%）无菌鸡血清</li>
 </ol>
 </li>
	<li>制备胶原蛋白浓度为1.5 mg/mL的三维胶原凝胶。本实验室先前的研究表明，胶原蛋白浓度高于1.5 mg/mL时，基质的生物力学刚度过高，细胞难以迁移；而低于1.5 mg/mL时，胶原纤维过少，细胞团可局部撕裂纤维，形成孤立的细胞岛。
 <ol>
		<li>按以下顺序将下列冰冻试剂加入无菌15 mL离心管中：
 	<ul>
 	<li>3X M199：体积 = 所需总体积 / 3</li>
 	<li>无菌18 MΩ水：体积 = 所需总体积（M199体积 + 鸡血清体积 + 0.1 M NaOH体积 + 胶原体积）</li>
 	<li>无菌鸡血清：体积 = 所需总体积 × 0.01</li>
 	<li>大鼠尾胶原I型：体积 = （胶原凝胶浓度 × 所需总体积）/ 胶原储备液浓度</li>
 	<li>无菌0.1 M NaOH：体积 = 胶原体积 × 0.2 注意：所加水、0.1 M NaOH和胶原的量将根据胶原储备液的浓度而变化。</li>
 </ul>
 </li>
		<li>用无菌移液器充分混匀胶原溶液。</li>
		<li>立即向表面积为1.9 cm2的培养孔中加入0.3 mL胶原溶液。此体积足以完全覆盖孔底，并形成约3 mm厚的凝胶。细胞侵袭研究要求凝胶厚度至少为250 μm。</li>
		<li>将胶原溶液在37°C、5% CO2和100%湿度条件下静置至少1小时，使其充分凝胶化。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 前EMT心内膜细胞的分离与培养
<ol>
	<li>胚胎分离
	<ol>
 	<li>将一段长约一英寸的实验室胶带贴在鸟蛋较宽的一端，此处为气室所在位置。胶带可稳定脆弱的鹌鹑蛋壳。</li>
		<li>用灭菌的弯头剪刀尖端轻轻刺穿蛋壳上贴有胶带的气室区域。</li>
		<li>在贴有胶带的蛋壳部分剪出一个足够大的孔，使蛋黄能够通过。从刺孔处开始，向外呈螺旋状剪开。注意需剪穿外层膜，但避免刺破蛋黄。</li>
		<li>当蛋壳上的孔完全剪好后，观察鹌鹑胚胎。胚胎通常位于蛋黄上方。</li>
		<li>用一只手将蛋黄从蛋壳的切口处缓缓倒出，另一只手持 #55 镊子。当胚胎随蛋黄顶部露出时，轻轻将 #55 镊子插入胚胎下方，将其从蛋黄上取下。 
注意：对于鸡胚，胚胎分离需将鸡蛋在锋利洁净的表面上敲裂，并将内容物倒入一个 100 mm 的培养皿中。胚胎通常位于蛋黄上方。用 #55 镊子轻轻插入胚胎下方，将其从蛋黄上取下。</li>
		<li>将取出的胚胎放入盛有冰冻无菌 EBSS 的 100 mm 培养皿中。</li>
 </ol>
 </li>
	<li>根据 Hamburger 和 Hamilton1 的分期标准对胚胎进行分期。14- 期胚胎已过 13 期但尚未达到 15 期，具有 20–21 个体节和尾芽。14- 期胚胎的一个关键特征是头部角度，其与身体的夹角略大于 90°。</li>
	<li>使用 #55 镊子从 14- 期鹌鹑胚胎中取出心脏，横切部位为房室管（AV canal）和动脉干（OFT）与胸壁接触处。将取出的心脏统一放置在培养皿的一侧。</li>
	<li>用无菌移液管收集分离的心脏，并转移至另一个盛有无菌冰冻 EBSS 的 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用 #55 镊子从心室横向剪下动脉干（OFTs）和房室管（AV canals）。</li>
	<li>将剩余的房室管和/或动脉干（OFTs）纵向切开。</li>
	<li>将移液器调至 20 uL 体积。用此移液器吸取六段纵向切开的房室管和动脉干（OFTs）。</li>
	<li>将房室管和动脉干（OFTs）排入胶原凝胶表面。用移液器吸除凝胶表面多余的 EBSS。</li>
	<li>使用 #55 镊子调整外植块的方向，使其平展，并使管腔面朝向胶原凝胶。操作时尽量避免镊子刺穿胶原凝胶。</li>
	<li>在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 2 小时后，用 #55 镊子去除外植块中的心肌层。内皮细胞应保留在胶原凝胶表面。或者，也可选择保留心肌层。若去除心肌层，则内皮细胞在无干预条件下不会发生上皮-间质转化（EMT）；若保留心肌层，则部分内皮细胞会转化为间充质细胞，但转化程度可受外界因素调控。 
注意：即使计划保留心肌层，也必须让外植块至少孵育 2 小时以充分贴附于凝胶表面，方可加入培养基。</li>
	<li>向每个含有外植块的孔中加入 0.4 mL M199 培养基。</li>
	<li>在 37°C、5% CO2 及 100% 湿度条件下培养细胞。</li> 
</ol>
3. EMT后房室垫间充质细胞的分离与培养
<ol>
	<li>在锋利、洁净的表面上敲开鸡卵，将内容物倒入一个100 mm的培养皿中。胚胎应位于卵黄的上表面。使用#5镊子夹住包围胚胎的膜结构，将胚胎取出，并转移至另一个盛有冰冻、无菌EBSS的100 mm培养皿中。</li>
	<li>根据Hamburger和Hamilton的标准对胚胎进行分期1。25期胚胎的特征包括明显的肘关节和膝关节，以及轻微的眼部色素沉着。</li>
	<li>分离所有HH25期胚胎的心脏，并将心脏集中放置在培养皿的一侧。</li>
	<li>使用无菌移液管收集分离的心脏，并转移至另一个盛有无菌、冰冻EBSS的100 mm培养皿中。</li>
	<li>一次性分离所有心脏的房室（AV）区域。将房室组织集中放置在培养皿的一侧。轻轻振荡房室区域以去除所有血液，因为血液可能影响细胞活力。</li>
	<li>使用无菌移液管收集分离的房室组织，并转移至另一个盛有无菌、冰冻EBSS的100 mm培养皿中。</li>
	<li>依次从房室组织中分离出心内膜垫。确保房室心内膜垫上无心肌组织残留。</li>
	<li>使用无菌移液管收集分离的心内膜垫，并转移至一个无菌的15 mL离心管中。</li>
	<li>在15 ×g条件下离心3分钟，使心内膜垫沉降至离心管底部。</li>
	<li>使用无菌1000 μL吸头尽可能吸除上清EBSS，注意不要扰动沉淀的心内膜垫。</li>
	<li>加入1 mL预热至37°C的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。让心内膜垫在胰蛋白酶中孵育直至完全消化，通常需要3–5分钟。</li>
	<li>向离心管中加入100 μL鸡血清以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>在160 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。使用无菌1000 μL吸头吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于2 mL M199培养基中，通过移液混匀。取10 μL细胞悬液进行血细胞计数板计数，以确定所分离的细胞总数。</li>
	<li>根据所获得的细胞数量，确定需要制备的胶原凝胶数量。细胞接种密度应为2 × 105 个细胞/mL，每孔凝胶体积为250 μL。</li>
	<li>在160 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。使用无菌1000 μL吸头吸除上清液。</li>
	<li>按照上述方案，依次向细胞沉淀中加入3× M199培养基、水、鸡血清、胶原蛋白和0.1 M NaOH。通过轻柔移液混匀。</li>
	<li>每孔1.9 cm2的生长面积中加入250 μL混合液。</li>
	<li>将胶原溶液置于37°C、5% CO2、100%湿度条件下静置至少1小时，使其充分凝胶化。</li>
	<li>每孔加入0.4 mL培养基，并过夜培养。</li>
	<li>若需在无应力条件下继续培养凝胶，可使用无菌200 μL移液枪头将凝胶从培养孔壁边缘分离。保持与孔壁连接的凝胶则为机械约束培养条件。</li>
</ol>
4. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="胚胎发育比较；显微镜图像；胚胎发生阶段 A 和 B。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：胚胎示例。 (A) HH14 期鹌鹑胚胎，以及 (B) HH25 期鸡胚胎如图所示。
<img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig2.jpg" alt="细胞结构分析，显微镜图像，样品表面形貌比较，比例尺 200 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：HH14 期心脏瓣膜区心内膜外植体培养 2 小时后的结果。 (A) 保留心肌组织；(B) 去除心肌组织。
<img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="细胞生长比较，显微图像，实验，细胞形态，受控条件分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：HH14期瓣膜心内膜外植体。 （A）在心肌存在的情况下，许多细胞经历心内膜向间充质转化，在培养48小时后呈现纺锤形的间充质表型。（B）当去除心肌后，所有细胞在培养48小时后均维持鹅卵石状的心内膜表型。
<img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="细胞培养的显微图像；比例尺：200 微米；生物学研究的实验数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4 "> 图 4：HH25 期瓣膜间充质细胞在胶原凝胶中的形态。 细胞在接种后立即呈现圆形。
<img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="显微镜图像，细胞分析；A：200微米比例尺，B：放大视图；显微镜研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5 "> 图5：培养中的HH25间充质细胞。 （A）在受限胶原凝胶中培养48小时后，HH25间充质细胞开始伸展。（B）HH25细胞在无应力胶原凝胶中接种7天并解除限制6天后，已将凝胶收缩至原始面积的约50%。

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li>
<li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho%2FPI+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

从HH14期胚胎中分离心内膜细胞的方法- 由Runyan和Markwald最初建立的心脏发育模型提供了一种可控的、 体外 研究启动和调控胚胎EMT因素的环境2. HH14- 无心肌组织的内膜垫外植体在缺乏生物力学或生化干预的情况下不会发生上皮-间质转化（EMT）。若外植体上保留心肌组织，则可向部分内皮细胞发出信号，诱导其发生间质转化，但该过程可能受到外部因子的调控。利用Butcher所述方法，从HH25期房室瓣膜垫中分离胚胎前体间充质细胞 等 为确定哪些信号驱动向成熟瓣膜间质细胞分化提供了机会3在机械应力或无应力条件下培养细胞，可使研究者探究生物力学刺激的影响，而添加至培养基中的因子则可提供生化信号。 体外 有助于解析影响上皮-间质转化、细胞分化和结构重塑机制的模型可用于深入理解先天性心脏病缺陷的成因，并有望为组织工程应用中引导干细胞向成熟瓣膜细胞表型分化提供策略。

<table><tbody><tr><td>超精细弯头邦氏剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>萨姆科科学公司，赛默飞世尔科技</td><td>2041S</td><td></td></tr><tr><td>4孔培养板</td><td>Nalge Nunc International</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性滤器，PES，0.2 μm &amp;mu;m 孔径膜</td><td>Nalge Nunc International</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>无菌15 mL离心管</td><td>康宁</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿，100 mm × 15 mm</td><td>VWR 国际公司</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>VWR 国际公司</td><td>89097-920</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白 I</td><td>BD 生物科学</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>10X Earle液&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-064-131</td><td></td></tr><tr><td>M199 粉末</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂（100倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Invitrogen</td><td>16110-082</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N 氢氧化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>可育鹌鹑蛋（&lt;em&gt;Coturnix coturnix&lt;/em&gt;)</td><td>坎伯兰湖游戏鸟养殖场</td><td></td><td></td></tr><tr><td>受精的鸡卵（&lt;em&gt;Gallus gallus&lt;/em&gt;)</td><td>康奈尔大学家禽场</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

禽类胚胎瓣膜前体细胞的分离与培养

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

胚胎心脏瓣膜的正确形成与功能对发育进程至关重要。早期胚胎心脏是一个U形管道，由心肌层包围的内膜层构成。心肌层向房室（AV）交界处和流出道（OFT）管腔分泌富含透明质酸的心脏胶质，即一种凝胶状基质。在HH14期，瓣膜形成过程开始，此时部分内膜细胞接收到来自心肌层的信号，发生内皮-间质转化（EMT），并侵入心脏胶质中。到HH25期，瓣膜垫已完全间质化，这种间充质组织最终将发育为心脏的瓣膜结构和间隔装置。由于EMT及细胞分化过程的启动与调控机制与严重先天性心脏病密切相关，因此理解这些机制具有重要意义。本研究中，我们介绍了分离前EMT内皮细胞和后EMT间充质细胞的方法，这两种细胞是瓣膜前垫中的不同细胞表型。前EMT内皮细胞可在有或无心肌层存在的情况下进行培养。后EMT的房室瓣膜垫间充质细胞则可培养于机械受限或无应力的胶原凝胶内部。这些三维体外（in vitro）模型可模拟关键的瓣膜形态发生事件，有助于解析早期和晚期瓣膜形成的机制。

本文将提供一种分离和培养鹌鹑或鸡HH14-期心脏瓣膜内皮细胞以及HH25期瓣膜垫间充质细胞的方法。

胚胎心脏瓣膜的正确形成与功能对胚胎发育进程至关重要。早期胚胎心脏是一个U形的管道结构，由……

为了在培养中分离禽类瓣膜 HH 14 期去除了心内膜的细胞或 HH 25 期瓣膜垫间充质细胞，需将受精蛋孵育两天。第一阶段为 HH 14 期（即去除心内膜）或孵育 4.5 天以获得 HH 25 期样本。随后分离胚胎并取出心脏。该实验步骤的下一步是分离HH 14期去除房室管和流出道的组织，或分离HH 25期的房室管。将HH 14期去除房室管和流出道的组织进行纵向切割，或分离HH 25期的房室瓣膜垫组织。将HH 14期（x轴负向）的外植体腔面朝下放置于胶原凝胶上。将HH 25期的瓣膜垫用胰蛋白酶消化后，将细胞接种于胶原凝胶内，两者均进行培养。最终，这些三维体外模型可模拟关键的心瓣形态发生事件，有助于解析早期和晚期瓣膜发生的机制。大家好，我叫Gretchen Mahler，来自康奈尔大学的生物医学工程系。今天您将学习的方法有助于回答心脏发育生物学领域中的关键问题，例如哪些因素能够启动并调控胚胎瓣膜的上皮-间质转化（Valvular EMT）。大家好，我叫Russell Gould。我在康奈尔大学生物医学工程系的Butcher实验室工作。在我们开始今天的讲解之前，需要强调的是，这些技术的可视化非常重要，因为分离步骤较难掌握。这是由于鸡胚心脏不断变化的几何形态以及这些镊子使用时的微小尺度所致。现在我们开始吧。首先，按照随附的书面方案详细说明，准备无菌的厄尔氏平衡盐溶液（简称EBSS）和无菌M199培养基。接下来，通过将以下冰浴试剂加入无菌的15毫升离心管中，制备三维胶原凝胶。按顺序依次加入：3倍体积的199培养基、18兆欧的无菌水、无菌鸡血清、大鼠尾胶原蛋白I型以及无菌的0.1摩尔氢氧化钠。所需胶原蛋白终浓度为1.5毫克/毫升。浓度过高会形成机械强度过大的基质，使细胞无法穿过。浓度过低则胶原纤维过少，细胞团可导致局部纤维撕裂，形成细胞岛。用无菌移液管充分混匀胶原溶液，并立即转移0.3毫升溶液至生长面积为1.9平方厘米的孔中。此胶原蛋白溶液足以完全覆盖孔板，并形成约三毫米厚的凝胶。对于细胞侵袭研究，凝胶厚度至少需达到250微米。在继续分离胚胎心脏细胞之前，将胶原蛋白溶液置于37摄氏度、5%二氧化碳及100%湿度条件下凝胶化至少一小时，并将受精的鸡胚或鹌鹑蛋在37摄氏度、60%湿度条件下培养至14期减阶段。对于鹌鹑蛋，将一段长约一英寸的实验室胶带贴在蛋的较宽一端，此处为气室所在位置。该胶带可稳定脆弱的鹌鹑蛋壳，便于使用灭菌弯头剪刀的尖端进行操作。轻轻刺破鸡蛋气室处的封口胶带区域。在胶带覆盖的部分切出一个足够大的孔，使蛋黄能够通过。从刺破点开始，向外以螺旋形状切割。确保切开外膜，但在蛋壳穿孔完成后避免刺破蛋黄。观察鹌鹑胚胎，胚胎通常位于蛋黄的上方。开始将蛋黄通过小孔倒出，一手持55号镊子，另一手轻轻将鸡蛋切开；当胚胎随蛋黄顶部露出时，迅速将55号镊子轻轻滑入胚胎下方，将其从

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生物学

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