利用全叶片成像技术评估活体细菌细胞诱导的气孔响应

在此实验中，利用叶片成像技术检测保卫细胞对活体细菌细胞刺激的响应。首先，从甘油保存菌种中复苏培养细菌，并制备接种物。随后，采集健康的幼嫩叶片，并用碘化丙啶染色。

将染色后的叶片切割，叶片小片置于细菌悬浮液表面进行孵育。最后在显微镜下观察叶片表面，可测量气孔开度。利用荧光显微镜获得的结果显示，气孔开度会响应细菌而发生变化。

与现有方法（如使用表皮剥离）相比，该方法的主要优势在于与细菌接触的叶片保持完整，从而模拟了细菌侵入叶片的自然条件。开始本实验时，将拟南芥种子播种于体积比为1:1:1的培养基、蛭石和珍珠岩的混合物中，在光照培养箱中培养植株，并根据需要浇水。

在抽薹前，当植株长出幼嫩且完全展开的叶片时，约4至6周后即可用于实验。实验开始前两天，准备细菌划线培养：将保存在甘油中的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）接种到改良的LB培养基上，在28摄氏度下培养24小时。

使用新鲜培养物制备接种物，并始终从甘油菌种开始接种培养平板。由于细菌在连续传代后毒力会下降，因此应使用平板上生长的细菌接种一管10毫升的假单胞菌液体培养基。将培养物置于50毫升锥形瓶中，在28摄氏度下剧烈振荡培养过夜，直至其在600纳米处的光密度（OD）达到0.8至1.0之间。

在600 nm处测定OD值，并在1,360 × g条件下离心10分钟收集细胞。将细胞重悬于蒸馏水中，使最终OD值为0.2。该OD值对应每毫升含10^8个菌落形成单位。

细菌准备好后，继续准备叶片并进行染色实验。首先，将碘化丙啶（propidium iodide，简称 PI）溶于水中，配制成 20 微摩尔的溶液。每次染色三片小型叶片，10 毫升溶液即足够使用。

从生长室中取出植株，用镊子取下三片幼嫩且完全展开的叶片。将整片叶片浸入PI溶液中5分钟。随后取出叶片，用蒸馏水短暂冲洗。

接下来，将一片叶片下表面朝下放置在显微镜载玻片上。用锋利的剃刀刀片将叶片切成四块，避开主脉，使叶片能够平铺在载玻片上，以便与细菌共孵育。在载玻片上的叶片碎片下方加入300 µL细菌悬浮液，确保叶片的下表面与接种液充分接触。

将样品置于与植物生长时相同的环境条件下进行孵育。当需要在显微镜下观察叶片时，将叶片片段转移至新的载玻片上，使下表皮朝上。注意：制片时无需使用盖玻片。

同一片叶片样品可在孵育过程中进行多次成像，可根据研究目的设置相应的时间序列。此处使用激光扫描共聚焦显微镜观察叶片，利用相同的叶片样品检测碘化丙啶（PI）的荧光信号以观察叶片下表面，并随时间推移采集气孔图像。保存图像用于测量气孔开口的宽度。

在每个时间点，每种处理至少测量60个气孔的气孔开度宽度。使用LSM图像浏览器，计算气孔开度宽度的平均值和标准误。可采用双尾配对t检验计算结果的统计学显著性。

此处 t 检验是一张典型的在激光扫描共聚焦显微镜下观察的拟南芥叶片表面的显微图像。在明场视野中，碘化丙啶对活细胞的细胞壁进行染色，从而增强保卫细胞的可见性，并有助于识别未受损的细胞。在这些显微图像中，可以观察到一系列气孔孔径开度，从完全关闭的气孔到完全张开的气孔均有呈现。

完全闭合的气孔通过保卫细胞的形状来识别。开放气孔的孔径宽度被视为零微米。所示孔径宽度是通过在气孔孔隙最宽处绘制一条直线进行测量的。

以下是活体叶片接种实验的典型结果。将拟南芥叶片在黑暗条件下与三种不同菌株的假单胞菌（Pseudomonas syringae）共同孵育，只有Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000菌株能够打开黑暗中的气孔，该结果通过每种细菌菌株随机选取60个气孔测量其孔径宽度得出。该技术为植物-细菌互作领域的研究人员探索植物物种对病原体早期响应的机制提供了途径。