估算水生系统中的病毒生成速率

本实验的总体目标是确定水生微生物群落中病毒的产生速率。首先，通过降低目标样品中游离病毒的丰度，同时保持原有微生物群落的完整性。实验的第二步是将样品在诱导条件下进行培养，并每隔两到三小时采集一次子样品，持续长达10小时。

该实验步骤的第三步是对每个时间点采集的子样品中的病毒进行计数。最后一步是确定病毒颗粒丰度在样品中的增加速率，并计算病毒的产生速率。最终，通过计数结果可以获得病毒在微生物群落中产生的速率，从而使得研究人员能够推断出由病毒活动引起的微生物死亡速率。

大家好。我叫Audrey Madison，我在田纳西大学Steven Milham博士的实验室以及微生物学系工作。今天，在Charles Budoff和Claire Campbell的帮助下，我们将向您展示一种用于分析病毒在水生系统中产生速率的实验方法。

为此，我们通过减少样品中游离病毒的数量，并定量统计其在裂解病毒感染的微生物过程中重新出现的速率。目前，我们在实验室中采用该方法研究病毒的生态学特性，以及它们如何影响微生物群落的结构。在完成上述介绍后，接下来让我们开始具体操作。

在开始此操作之前，应尽可能无菌地收集约20升海水。样品采集后，先通过直径为142毫米、孔径为0.8微米的滤膜对水样进行预过滤。对于生物生产力较高的水体系统，可先用更大孔径或玻璃纤维滤膜进行过滤，以作预防性处理。

为了获得超滤水，可设置一个超滤系统（如AmCon M 12系统），配备卷式膜滤芯，以去除样品中所有病毒。通过约25%的最大转速并施加15至16千帕的反向压力，可将样品中的病毒去除并浓缩。所得约500毫升的浓缩液中含有已被富集的病毒群落，可用于其他研究；而滤出的无病毒透过液则将用于病毒增殖检测。

每次使用后，应清洁Omicron M 12系统，以防止滤芯膜受损。当处理海水时，先用至少六升Milli Q水冲洗膜，随后用0.1摩尔氢氧化钠溶液清洗30至45分钟。然后再用至少额外六升Milli Q水冲洗滤芯。

实验结束后，可将螺旋柱保存在 0.05 摩尔的磷酸溶液中，置于 4 摄氏度条件下。开始进行病毒削减实验时，取自同一采样点的 500 毫升海水样品（该样品即为我们制备无病毒水所用的水源）置于立体过滤装置中，使用孔径为 0.2 微米、低蛋白吸附性的滤膜进行过滤。此时，还需同时采集一份子样品，用于测定起始水样中病毒和细菌的总丰度。

使用无菌移液管持续重悬样品，同时将样品在低于200毫米汞柱的压力下轻轻抽真空，以防止细菌细胞在滤膜上聚集；然后缓慢加入三倍体积（即500毫升）的超滤液至细菌悬液中，以减少样品中游离病毒的丰度，同时维持细菌种群密度恒定。最后，用无病毒的超滤水将细菌组分重新稀释至500毫升。接着，将其均分为三份，每份150毫升，并将这三份样品分别置于透明的250毫升聚碳酸酯瓶中。

这代表您的时间零点样品集。从您的时间零点样品中采集用于细菌和病毒丰度估算的样品，并将样品转移至冻存管中，加入无菌戊二醛，使其终浓度为2.0%至2.5%。

作为固定剂，立即用液氮快速冷冻这些样品，并在处理前于负80摄氏度保存。或者，可以使用切向流系统来浓缩海洋微生物。若采用TFF方法，需获取约500毫升的天然样品。

当细菌组分减少至约10至15毫升时，使用截留分子量为0.2微米的切向流过滤系统，在超滤去病毒水中浓缩该样品，具体操作如病毒去除方法所述。将所得的重复样品瓶在诱导条件下孵育。在海上利用环境培养舱时，我们采用流动海水培养装置，并连接表层海水供应系统以维持环境温度。通过使用蓝色丙烯酸材料或中性密度遮光网降低光照强度，可使光照水平与表层环境条件相匹配。

在野外工作站或实验室工作时，或在无法获取海水的情况下，可使用带光照的培养箱。需继续按照零时样品的采样方法，至少每2.5小时采集一次子样品，持续至少10小时。除显微镜样品外，部分研究人员可能还需采集水样用于特定病毒的定量PCR分析。

对于qPCR样品，取5毫升样品加入无固定剂的冻存管中，立即在液氮中速冻，以备后续病毒生产显微镜检测使用。将冻存样品在冰上解冻，并按照书面实验方案 freshly prepare 溶液。然后将直径25毫米、孔径0.02微米的滤膜置于0.45微米的纤维素支撑滤膜上。接着将850微升固定后的样品加入该滤膜上方，在低于20千帕的真空压力下抽滤，直至完全干燥。

待纳米孔滤膜干燥后，用移液器吸取100微升SYBR Green工作液，加入无菌培养皿中。在保持真空状态的情况下，小心地将纳米孔滤膜从滤塔上取下，并将其放入SYBR Green溶液中。将样品置于室温避光条件下孵育20分钟。

小心地将滤膜从 Cyber Green 溶液中取出，并用 Kim 擦拭纸吸去滤膜背面的残留染料。然后在显微镜载玻片上滴加少量 Antifa 溶液，并盖上盖玻片。取下盖玻片，将干燥的滤膜置于显微镜载玻片上。

再次向盖玻片上加入少量 Antifa 溶液，然后缓慢将其放置在滤膜上，确保排除可能形成的气泡。使用带宽谱蓝色滤光片的荧光显微镜对病毒进行计数，每张滤膜至少统计 20 个视野，并确保量化每个视野网格中的病毒总数，以确认病毒在滤膜上的均匀分布。根据三个独立重复实验计算病毒丰度的平均值，并从生产速率中确定标准偏差。最后，根据起始丰度到病毒减少样本中稀释后丰度的微生物稀释倍数，对这些速率进行校正。

本研究产生的主要数据集是培养样品亚群中病毒丰度的重现率。这些结果构成了每个样品病毒丰度随时间变化的独立回归曲线。在模拟原位条件下，通过落射荧光显微镜监测了10小时培养期间病毒样颗粒的产生情况。

这些样品于2008年9月在新西兰海岸外的一次浮游植物水华期间采集。我们刚刚向您展示了如何估算病毒产生速率，包括使用不同的超滤系统并开展实验以测定病毒产生速率。

此外，我们向您展示了如何通过落射荧光显微镜对这些病毒进行计数。在进行该操作时，重要的是要记住使用洁净的设备，小心处理染色后的病毒，避免光照，并迅速完成样品处理，且每次使用后应正确清洗超滤滤芯。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。