Name: HIV - 1使用转速依赖的慢病毒表达载体的绿色荧光蛋白阳性细胞的特定标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学习使用HIV-1 Rev依赖的慢病毒载体表达GFP来特异性标记HIV阳性细胞的方法。该技术通过流式细胞术检测GFP阳性细胞，为HIV感染治疗提供潜在应用价值。

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本工作部分由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）向 Y. W. 提供的公共卫生服务基金 1R01AI081568 资助，以及 M. Rosen 和 Day2 公司组织的 2009 年纽约市艾滋病骑行活动的捐赠者和参与者的慷慨捐助支持。

1. 转染质粒以产生依赖Rev的慢病毒颗粒
实验设置：Rev依赖性GFP慢病毒载体pNL-GFP-RRE-SA此前已有描述4,5,6。为组装成病毒颗粒，将该质粒与HIV-1包装质粒pCMVΔ8.2（由Dr. Dider Trono惠赠）以及携带VSV-G糖蛋白的质粒（pHCMV-G）共同转染至HEK293T细胞中。转染采用磷酸钙法进行。
缓冲液的配制：通过将5 g Hepes、8 g NaCl、0.37 g KCl、1 g 右旋糖、0.103 g Na2HPO4（无水）溶于100 mL H2O中，配制10×HBS（Hepes缓冲盐溶液）。将10×HBS缓冲液分装为每管1 mL，于-20°C保存。转染时，用H2O将10×HBS稀释为2×HBS（1:5稀释），并调节pH至7.05–7.12（配制10 mL 2×HBS通常需约50 μL 1 M NaOH）。将2×HBS缓冲液经0.22 μm Millipore滤器过滤除菌。CaCl2缓冲液的配制：将CaCl2溶于10 mM Hepes中，终浓度为2 M，调节pH至5.8，过滤除菌后于4°C保存。
实验步骤：
<ol>
	<li>转染前一天，将 2 × 106 个 HEK293T 细胞接种于 100 mm 培养皿中，在 37°C、5% CO2 条件下，用 10 mL DMEM + 10% FBS 培养过夜。</li>
	<li>次日，吸除细胞上清液，更换为 5 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续培养 4 小时。</li>
	<li>在 5 mL 聚苯乙烯管中，加入 480 μL 2× HBS 缓冲液。</li>
	<li>在另一支 5 mL 聚苯乙烯管中，加入 60 μL 2 M CaCl2 缓冲液、质粒 DNA 和转染 TE 缓冲液（1 mM Tris，25 mM EDTA，pH 8.0），总体积补至 480 μL。每培养皿所加质粒的比例为：pNL-GFP-RRE-SA 10 μg、pCMVΔR8.3 7.5 μg 和 pHCMV-G 2.5 mg。</li>
	<li>将质粒 DNA-CaCl2 混合液逐滴加入 2× HBS 管中，室温孵育 30 分钟，形成细小沉淀。</li>
	<li>用移液器将 960 μL 混合液逐滴加入细胞中，于 37°C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>次日，吸除上清液，加入 10 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续在 37°C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	<li>转染后 48 小时，收集上清液转移至 50 mL 无菌离心管中以收获病毒。向每个培养皿中加入 10 mL 新鲜 DMEM + 10% FBS，继续培养过夜。将病毒上清液置于 4°C 保存。</li>
	<li>转染后 72 小时继续收集上清液，合并所有上清液，于 500 × g 离心 15 分钟，沉淀并去除细胞碎片。</li>
	<li>收集上清液，经 0.22 μm Millipore 滤器过滤。病毒进一步通过尺寸排阻层析柱进行浓缩。</li>
</ol>
2. 浓缩病毒颗粒并测定病毒滴度
<ol>
	<li>使用尺寸排阻柱（100,000 MW 截留，Centricoin）浓缩病毒颗粒。将病毒上清液加入柱中，在 4°C 条件下以 6,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>收集浓缩后的病毒上清液，分装后于 -80°C 保存。</li>
	<li>通过感染经 TNF 处理的 HIV-1 阳性 Jacket 细胞系 J1.1 7 来测定病毒滴度。将细胞以每毫升 2.5 × 105 个细胞的密度接种于 96 孔板中（总体积 100 µL），并加入 100 µL 系列稀释的 vNL-GFP-RRE-SA 病毒液感染一周。根据 Reed 和 Muench 的方法 8，通过计数表达 GFP 的阳性孔来估算病毒颗粒的滴度（TCID50）。</li>
</ol>
3. 使用慢病毒颗粒 vNL-GFP-RRE-SA 标记 HIV-1 阳性细胞
实验设置：首先用HIV-1感染人CD4 T细胞系CEM-SS。感染后48小时，用慢病毒颗粒vNL-GFP-RRE-SA对细胞进行超级感染。超级感染再持续两天后，通过流式细胞术分析GFP阳性细胞。作为对照，未感染HIV-1的CEM-SS细胞以相同方式感染vNL-GFP-RRE-SA。结果显示，只有HIV-1感染的CEM-SS细胞产生GFP阳性细胞，而未感染HIV-1的CEM-SS细胞则无GFP阳性细胞出现。
步骤：
<ol>
	<li>感染前两小时，加入polybrane至终浓度为4 mg/mL。计数细胞，并为每次感染取2 × 105个细胞。用200 ng（p24）的HIV-1NL4-3感染细胞，持续2小时。</li>
	<li>以300 × g离心10分钟洗涤细胞，将细胞重悬于2 × 105个细胞/mL，于37°C培养48小时。</li>
	<li>计数细胞，并为每次vNL-GFP-RRE-SA感染取2 × 105个细胞。加入100 µL的vNL-GFP-RRE-SA，于37°C过夜孵育。洗涤细胞后重悬于2 × 105个细胞/mL。</li>
	<li>在二次感染后48小时进行流式细胞术分析。将感染的细胞离心沉淀，重悬于500 µL 1%多聚甲醛中，室温孵育20分钟，随后在FACScan分析仪（Becton Dickinson）上进行检测。</li>
</ol>
4. 典型结果
如果实验成功，在 HIV-1 感染的 CEM-SS 细胞中将通过流式细胞仪检测到大量 GFP 阳性细胞群体，而在对照组中，HIV-1 未感染的 CEM-SS 细胞中则不会检测到 GFP 阳性细胞。
如果实验成功进行，依赖 Rev 的慢病毒载体 vNL-GFP-RRE-SA 将能够通过检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，特异性地检测活细胞群体中复制的 HIV。在此示例中，收集的 CEM-SS 细胞使用 PE 标记的抗小鼠 CD24、HSA 的大鼠单克隆抗体进行染色，随后通过流式细胞仪同时分析 HSA 和 GFP 的表达情况。
<img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="流式细胞术图谱；分析GFP和HSA表达；显示HIV-1的影响；表达结果为18.9%。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 如图所示，在感染HIV-1并被vNL-GFP-RRE-SA超感染的细胞中检测到大量GFP阳性细胞群（图1c）。相比之下，在未感染HIV-1的CEM-SS细胞中，无论是否进行慢病毒超感染，均未检测到GFP阳性细胞（图1a和图1b）。

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

与早期开发的Tat依赖性表达载体类似，此处描述的Rev系统利用了进化而来的HIV过程。引入Rev依赖性使得基于LTR的表达载体高度依赖于复制型HIV的存在。本文所报道的该载体作为一种HIV依赖性报告病毒，为识别HIV阳性细胞提供了一种全新的方法。该载体允许对活细胞进行检测，可表达任意基因用于基础或临床实验，并且作为假型慢病毒，能够感染大多数细胞类型和组织。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80&amp;#x00B0;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞系</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS 细胞系</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 细胞系 J1.1</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>通过将克隆的前病毒DNA转染HeLa细胞制备</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>完全缺失pNL4-3中所有HIV ORF</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>将HIV-1 A5和D4插入pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>由Dr. Dider Trono提供</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS（HEPES缓冲盐溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1% 多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（漂白剂）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 管</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;m Millipore 滤膜</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;m Millipore 滤膜</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>尺寸排阻柱（100,000 MW 截断）</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

利用表达绿色荧光蛋白的rev依赖型慢病毒载体特异性标记hiv-1阳性细胞

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

大多数HIV响应性表达载体基于HIV启动子——长末端重复序列（LTR）。尽管LTR可响应早期HIV蛋白Tat，但它也受细胞活化状态及整合位点局部染色质活性的影响。这可能导致较高的HIV非依赖性活性，从而限制了基于LTR的报告系统用于标记HIV阳性细胞的应用价值 1,2,3在此，我们构建了一种表达型慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还包含多个HIV DNA序列，其中包括Rev响应元件和HIV剪接位点。 4,5,6该载体被整合到一种慢病毒报告病毒中，可在活细胞群体中高度特异性地检测复制中的HIV。通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达来测定该载体的活性。本文所报道的该载体的应用为现有方法（例如）提供了一种全新的替代方案 原位 PCR 或 HIV 抗原染色，以鉴定 HIV 阳性细胞。该载体还可表达治疗性基因，用于基础或临床实验中靶向 HIV 阳性细胞。

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1 Tat和Rev依赖的方式调控报告基因的表达。该载体可通过表达GFP特异性地检测活细胞中复制的HIV。

利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

大多数HIV响应性表达载体基于HIV启动子——长末端重复序列（LTR）。尽管这类载体可响应早期HIV蛋白Tat……

本实验的总体目标是利用携带绿色荧光蛋白的HIV-1 rev依赖型慢病毒载体来鉴定HIV阳性细胞。该目标首先通过共转染产生rev依赖型慢病毒颗粒来实现；实验的第二步是用HIV-1感染人CD4+ T细胞。接下来，用携带 GFP 基因的慢病毒颗粒对 HIV 阳性的人 CD4 T 细胞进行超级感染。最后一步是通过流式细胞术检测 GFP 阳性细胞来鉴定 HIV 阳性细胞。最终，可通过流式细胞术获得结果显示 GFP 阳性细胞的百分比。该技术的应用意义在于为 HIV 感染的治疗提供了可能，因为 rev 依赖型载体同样能够向 HIV 感染的细胞递送并选择性表达治疗基因，从而诱导杀伤 HIV 阳性细胞。演示该实验步骤的是来自本实验室的研究助理教授 gi。为制备 rev 依赖型慢病毒颗粒，需将 HEK 293T 细胞与三种质粒共转染：rev 依赖型 GFP 慢病毒载体、HIV-1 包装质粒以及携带 VSV-G 糖蛋白的质粒。在质粒转染前一天，将 2 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞接种于 10 毫升培养基中。在100毫米的培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞过夜。次日，将细胞中的培养基更换为5毫升新鲜培养基。然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养细胞4小时。在4小时孵育结束前准备好转染试剂。HEK 293T细胞将转染三种质粒，其比例为10微克rev依赖性GFP慢病毒载体、7.5微克HIV-1包装构建体和2.5微克VSVG糖蛋白。首先按所需比例预先混合三种质粒DNA。然后准备两个5毫升的聚苯乙烯试管。向第一管中加入480微升的2倍HBS缓冲液，向第二管中也加入480微升的2倍HBS缓冲液。向血浆DNA和转染缓冲液中加入60微升的2摩尔氯化钙缓冲液，总体积达到480微升。接着，将血浆DNA与氯化钙的混合物逐滴加入两倍HPS的试管中，在室温下孵育30分钟。将逐渐形成细小的沉淀。现在用移液器将全部960微升混合液逐滴加入HEK 293T细胞中。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天，移除 S 上清液，加入 10 毫升新鲜培养基。将细胞再次于 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。转染后 48 小时，通过移除 SUP 上清液并将其转移至 50 毫升无菌管中来收集病毒。向培养皿中加入 10 毫升新鲜培养基，继续培养过夜。将病毒上清液置于 4 摄氏度保存。转染后 72 小时继续收集，通过收集上清液并与之前收获的上清液混合完成。然后将S上清液在500 × g离心15分钟，以沉淀并去除细胞碎片。离心后，收集S上清液并转移至新管中。随后通过0.22 µm的Millipore滤器过滤上清液。接下来将通过尺寸排阻层析柱进一步浓缩病毒，以富集病毒颗粒。将病毒上清液加入尺寸排阻层析柱中，在4°C条件下以6,000 × g离心15分钟。收集浓缩后的病毒上清液，预留约100微升用于测定病毒滴度。将剩余部分分装，并于-80摄氏度保存。测定病毒滴度是本实验流程中最关键的步骤之一。使用GFP VIR载体对细胞进行超级感染时，需要较高的感染复数。为了通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的百分比以确定病毒滴度，将用TNF处理的HIV-1阳性J-Lat细胞系感染病毒上清液。这些HIV-1阳性细胞被培养。在96孔板中，以每毫升2.5 × 10⁵个细胞的密度接种，总体积为100微升。制备六组rev依赖型慢病毒颗粒的10倍系列稀释液，用于感染HIV-1阳性细胞；将每种病毒稀释液各100微升加入细胞的每个孔中。在37°C二氧化碳培养箱中孵育七天。通过荧光显微镜观察GFP阳性细胞来估算颗粒滴度。根据Reid和MU的方法进行计算，滴度被确定为能够产生GFP阳性孔的稀释点。在50%的孔中感染至标记IV时，可观察到携带rev依赖型慢病毒颗粒的阳性细胞。首先用HIV-1感染人CD4 T细胞系。每次感染使用2 × 10⁵个细胞。感染前2小时。向细胞中加入聚脑（poly brain），使其终浓度为每毫升4微克。在37摄氏度下孵育2小时。随后通过将HIV溶液加入5毫升离心管之一中感染细胞。另外两个细胞管不进行感染，将作为对照。将所有细胞在37摄氏度下孵育2小时。2小时后，在300 × g下离心细胞10分钟，弃去上清液以去除无细胞病毒，并将细胞重悬于新鲜培养基中，浓度为每毫升培养基含2 × 10⁵个细胞，在37摄氏度下继续培养48小时。48小时后，HIV感染的细胞已准备好进行感染。使用rev依赖型慢病毒颗粒时，取两份10的5次方个细胞，分别加入100微升慢病毒颗粒，对HIV V1感染的细胞进行感染作为对照；同时，用100微升慢病毒颗粒感染未感染HIV V1的人源CD4+ T细胞。将细胞在37摄氏度下孵育过夜，次日进行后续操作。弃去用过的培养基，加入新鲜培养基，将细胞重悬至浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞。感染后48小时，通过离心收集细胞，然后重悬于500 µL 1%多聚甲醛中，将重悬的细胞转移至流式细胞管中用于流式细胞术分析。室温孵育20分钟后，可在FACScan分析仪上检测细胞的GFP阳性率。如果实验成功进行，rev依赖性慢病毒载体V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A将能够通过检测绿色荧光蛋白GFP的表达，在活细胞群体中高度特异性地检测出正在复制的HIV。在此示例中，收集的C-E-M-S-S细胞用PE标记的抗小鼠CD24 HSA大鼠单克隆抗体染色，随后通过流式细胞仪同时分析HSA和GFP的表达，结果如图所示。在感染HIV-1并超级感染V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A的细胞中，检测到显著数量的GFP阳性细胞群。相比之下，在未感染HIV-1且无慢病毒超级感染的C-E-M-S-S细胞中，或在未感染HIV-1但有慢病毒超级感染的细胞中，均未检测到GFP阳性细胞。请注意，操作HIV可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取适当的预防措施，例如遵循相应的生物安全等级操作规范。

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

HIV - 1使用转速依赖的慢病毒表达载体的绿色荧光蛋白阳性细胞的特定标记

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

慢病毒表达载体是稳定表达各种效应分子或报告基因构建体的最有效工具，适用于分裂和非分裂的哺乳动物细胞以及完整生物体。本文提供了一种将慢病毒表达构建体包装成假病毒颗粒，并利用这些假病毒颗粒转导靶细胞的实验方案。...

包装基于HIV或FIV的慢病毒载体表达构建体及VSV-G假型病毒颗粒的转导

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扩增与检测表达绿色荧光蛋白的传染性绵羊梅迪-维斯纳病毒分子克隆

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.

用于转导中枢神经系统细胞的慢病毒载体的制备

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使用荧光蛋白进行多重应用的遗传条形码技术

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

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一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。...

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

学习使用HIV-1 Rev依赖的慢病毒载体表达GFP来特异性标记HIV阳性细胞的方法。该技术通过流式细胞术检测GFP阳性细胞，为HIV感染治疗提供潜在应用价值。

利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

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