利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

本实验的总体目标是利用携带绿色荧光蛋白的HIV-1 rev依赖型慢病毒载体来鉴定HIV阳性细胞。该目标首先通过共转染产生rev依赖型慢病毒颗粒来实现；实验的第二步是用HIV-1感染人CD4+ T细胞。

接下来，用携带 GFP 基因的慢病毒颗粒对 HIV 阳性的人 CD4 T 细胞进行超级感染。最后一步是通过流式细胞术检测 GFP 阳性细胞来鉴定 HIV 阳性细胞。最终，可通过流式细胞术获得结果显示 GFP 阳性细胞的百分比。

该技术的应用意义在于为 HIV 感染的治疗提供了可能，因为 rev 依赖型载体同样能够向 HIV 感染的细胞递送并选择性表达治疗基因，从而诱导杀伤 HIV 阳性细胞。演示该实验步骤的是来自本实验室的研究助理教授 gi。为制备 rev 依赖型慢病毒颗粒，需将 HEK 293T 细胞与三种质粒共转染：rev 依赖型 GFP 慢病毒载体、HIV-1 包装质粒以及携带 VSV-G 糖蛋白的质粒。在质粒转染前一天，将 2 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞接种于 10 毫升培养基中。

在100毫米的培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞过夜。次日，将细胞中的培养基更换为5毫升新鲜培养基。

然后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养细胞4小时。在4小时孵育结束前准备好转染试剂。HEK 293T细胞将转染三种质粒，其比例为10微克rev依赖性GFP慢病毒载体、7.5微克HIV-1包装构建体和2.5微克VSVG糖蛋白。

首先按所需比例预先混合三种质粒DNA。然后准备两个5毫升的聚苯乙烯试管。向第一管中加入480微升的2倍HBS缓冲液，向第二管中也加入480微升的2倍HBS缓冲液。

向血浆DNA和转染缓冲液中加入60微升的2摩尔氯化钙缓冲液，总体积达到480微升。接着，将血浆DNA与氯化钙的混合物逐滴加入两倍HPS的试管中，在室温下孵育30分钟。

将逐渐形成细小的沉淀。现在用移液器将全部960微升混合液逐滴加入HEK 293T细胞中。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。

第二天，移除 S 上清液，加入 10 毫升新鲜培养基。将细胞再次于 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。转染后 48 小时，通过移除 SUP 上清液并将其转移至 50 毫升无菌管中来收集病毒。

向培养皿中加入 10 毫升新鲜培养基，继续培养过夜。将病毒上清液置于 4 摄氏度保存。转染后 72 小时继续收集，通过收集上清液并与之前收获的上清液混合完成。

然后将S上清液在500 × g离心15分钟，以沉淀并去除细胞碎片。离心后，收集S上清液并转移至新管中。随后通过0.22 µm的Millipore滤器过滤上清液。

接下来将通过尺寸排阻层析柱进一步浓缩病毒，以富集病毒颗粒。将病毒上清液加入尺寸排阻层析柱中，在4°C条件下以6,000 × g离心15分钟。收集浓缩后的病毒上清液，预留约100微升用于测定病毒滴度。

将剩余部分分装，并于-80摄氏度保存。测定病毒滴度是本实验流程中最关键的步骤之一。使用GFP VIR载体对细胞进行超级感染时，需要较高的感染复数。

为了通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的百分比以确定病毒滴度，将用TNF处理的HIV-1阳性J-Lat细胞系感染病毒上清液。这些HIV-1阳性细胞被培养。

在96孔板中，以每毫升2.5 × 10⁵个细胞的密度接种，总体积为100微升。制备六组rev依赖型慢病毒颗粒的10倍系列稀释液，用于感染HIV-1阳性细胞；将每种病毒稀释液各100微升加入细胞的每个孔中。在37°C二氧化碳培养箱中孵育七天。

通过荧光显微镜观察GFP阳性细胞来估算颗粒滴度。根据Reid和MU的方法进行计算，滴度被确定为能够产生GFP阳性孔的稀释点。在50%的孔中感染至标记IV时，可观察到携带rev依赖型慢病毒颗粒的阳性细胞。

首先用HIV-1感染人CD4 T细胞系。每次感染使用2 × 10⁵个细胞。感染前2小时。

向细胞中加入聚脑（poly brain），使其终浓度为每毫升4微克。在37摄氏度下孵育2小时。随后通过将HIV溶液加入5毫升离心管之一中感染细胞。

另外两个细胞管不进行感染，将作为对照。将所有细胞在37摄氏度下孵育2小时。2小时后，在300 × g下离心细胞10分钟，弃去上清液以去除无细胞病毒，并将细胞重悬于新鲜培养基中，浓度为每毫升培养基含2 × 10⁵个细胞，在37摄氏度下继续培养48小时。

48小时后，HIV感染的细胞已准备好进行感染。使用rev依赖型慢病毒颗粒时，取两份10的5次方个细胞，分别加入100微升慢病毒颗粒，对HIV V1感染的细胞进行感染作为对照；同时，用100微升慢病毒颗粒感染未感染HIV V1的人源CD4+ T细胞。将细胞在37摄氏度下孵育过夜，次日进行后续操作。

弃去用过的培养基，加入新鲜培养基，将细胞重悬至浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞。感染后48小时，通过离心收集细胞，然后重悬于500 µL 1%多聚甲醛中，将重悬的细胞转移至流式细胞管中用于流式细胞术分析。室温孵育20分钟后，可在FACScan分析仪上检测细胞的GFP阳性率。

如果实验成功进行，rev依赖性慢病毒载体V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A将能够通过检测绿色荧光蛋白GFP的表达，在活细胞群体中高度特异性地检测出正在复制的HIV。在此示例中，收集的C-E-M-S-S细胞用PE标记的抗小鼠CD24 HSA大鼠单克隆抗体染色，随后通过流式细胞仪同时分析HSA和GFP的表达，结果如图所示。在感染HIV-1并超级感染V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A的细胞中，检测到显著数量的GFP阳性细胞群。

相比之下，在未感染HIV-1且无慢病毒超级感染的C-E-M-S-S细胞中，或在未感染HIV-1但有慢病毒超级感染的细胞中，均未检测到GFP阳性细胞。请注意，操作HIV可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须采取适当的预防措施，例如遵循相应的生物安全等级操作规范。