一种细胞间大分子转运检测方法 在活体植物中 利用基因枪轰击技术

以下实验的总体目标是分析荧光标记蛋白在植物表皮细胞间移动的程度。通过获取包裹DNA的金颗粒，在植物表皮中瞬时表达目标融合蛋白来实现该目的。第二步是将DNA递送至植物表皮，从而实现待测融合蛋白的表达及其在细胞间的移动。

接下来，在共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白，以监测荧光标记的待测蛋白的表达情况及其亚细胞定位。通过共聚焦显微镜分析荧光信号的分布，获得结果以显示荧光标记蛋白在细胞间运输的程度。大家好，我是来自纽约州立大学石溪分校生物化学与细胞生物学系KY实验室的Ben Myers。

今天我们将向您展示一种用于分析植物表皮中细胞间运动程度或荧光标记蛋白的方法。我们在实验室中使用该方法研究不同植物背景下植物病毒运动蛋白的细胞间运输，并比较不同类型蛋白质的细胞间移动能力。现在让我们开始吧。

开始本实验方案时，将一株拟南芥种植于Promix bx培养基中。使用适当大小的花盆，并在环境控制培养箱中培养，设置短光照周期以及40%至65%的相对湿度；对于心叶烟（nicotiana, hamana）和烟草（nicotiana tobacco）植株，将每株植物种植在较大花盆的Promix BX培养基中，并同样置于环境控制培养箱中，设置长光照周期以及40%至65%的相对湿度。

按照先前所述方法，偶尔使用市售产品对植株进行施肥。在培养 Opsis 植株六至八周后，选择大小超过 15 毫米 × 35 毫米的叶片用于实验，其中长度测量包含叶柄；对于 benanna 和 NAC 植株，需培养七至十周，然后分别选择大于 50 毫米 × 70 毫米（benanna）和 100 毫米 × 125 毫米（nac）的叶片。

在这些情况下，长度测量不包括人。在开始通过基因枪递送DNA包被的微粒之前，需按照先前详细描述的方法制备含有DNA包被金微粒的基因枪弹匣。然后用锋利的剃须刀片切下处于相同发育阶段的叶片，并立即将其腹面朝上放置于平坦的泡沫塑料表面上。

叶片的远轴面由于气孔密度较低且角质层较薄，是进行微弹轰击的较佳底物。对于拟南芥等小型叶片，可通过覆盖一小块窗纱网并用图钉将网固定在聚苯乙烯泡沫表面上来固定叶片。保持叶片平展，以提高微弹递送效率，并尽量减少微弹轰击过程中对组织的损伤。

然后将带有DNA包被微粒的 cartridge 装入基因枪中。针对兔眼视网膜色素上皮细胞，使用0.6微米微粒在140至160 PSI的压力下进行轰击。

使用每片叶片一个弹药筒对样品进行轰击，使微粒分散在直径为10至12毫米的表面区域。针对末端的benanna和baum叶片，使用0.6微米微粒在160至180 PSI的压力下进行轰击，适用于较大的末端benanna和烟草叶片。

同一叶片可进行多次轰击，但必须在主脉两侧对称的位置进行，以靶向处于相同发育阶段的叶片区域。瞬时表达的标记蛋白的荧光信号通过共聚焦显微镜观察。应谨慎优化显微镜检测条件，为每种待测蛋白选择最佳的显微成像参数。

使用 40 倍物镜观察在细胞内积累有限且信号强度较弱的蛋白质，例如烟草花叶病毒的质膜定位运动蛋白（tobacco mosaic virus movement protein）或 T-M-V-M-P。这可提供更高的分辨率和增强的灵敏度。然而，对于在细胞质中分布广泛且信号强度较强的蛋白质（如游离的黄色荧光蛋白或 YFP），可使用 10 倍物镜配合共聚焦显微镜的缩放功能进行快速成像。简单运输可通过出现含有荧光信号的多细胞簇来推断。

此类簇的数量以及每个簇中的细胞数量反映了细胞间物质运输的程度。为获得可靠数据，每种实验体系至少记录100个表达簇，并注意同时进行实验。

当进行比较时。此处检测了荧光标记蛋白的简单运输过程。展示了用表达 A TMV mp YFP 的构建体对末端哈马纳叶片进行微弹轰击后获得的典型共聚焦图像。

基于YFP信号在多细胞簇中的出现，可观察到TMV MP YFP存在简单的运动现象。然而，并非所有瞬时表达的TMV MP YFP均能发生移动，单细胞信号的存在即为此提供了证据。在某些微弹轰击实验中。

在少于40%的计数信号簇中，TMV MP YFP无法在细胞间移动；而在超过60%的信号簇中，该蛋白可在两至五个细胞间移动，其中以两个细胞间的传播最为常见。相对分子质量较小且不具有内在移动活性的蛋白质可通过细胞质膜SMA扩散，实现细胞间的移动。

例如，游离的YFP或一个XYFP可在多个细胞间扩散，且在计数的聚集中超过30%。相反，翻译型YFP二聚体或两个XYFP则不会发生这种非特异性扩散，其大小与TMV MP-YFP融合蛋白相当，完全局限于单个细胞内。我们刚刚向您展示了如何利用基因枪系统在植物表皮中进行瞬时表达，以分析荧光标记蛋白的细胞间运动。

进行此操作时，重要的是要记住准备健康、健壮的植株，高质量的DNA包被金颗粒用于DNA递送，并分析足够数量的表达簇以获得具有统计学可靠性的结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。