Name: 细胞的细胞大分子运输检测在植物利用基因枪法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学习利用基因枪法在植物表皮中瞬时表达荧光标记蛋白，并通过共聚焦显微镜观察其细胞间运输与分布。该方法可定量分析蛋白质在植物细胞间的移动程度，为研究植物细胞间通讯机制提供可靠工具。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）、美国国家科学基金会（NSF）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）以及BARD向VC提供的资助。

背景
大分子通过植物细胞间连接结构——胞间连丝进行共质体运输，是许多植物病理学家和生物学家关注的研究领域。例如，已知多种病毒蛋白能够调节胞间连丝的大小排阻极限，从而促进病毒在细胞间的移动1-3。此外，一些内源性蛋白（包括重要的发育调控因子）被认为可通过胞间连丝在细胞间移动，以实现非细胞自主性的功能4。因此，建立一种可靠的方法来鉴定和可视化植物细胞间的大分子运输，已成为当前迫切需要的技术手段。
1) 培养目标植物
为了获得高转化效率，应使用健康、健壮的植株。
1. 拟南芥 植物 
在环境控制培养室中，将一株 Arabidopsis 种植于 Pro-Mix BX 培养基质中，使用规格为 10 cm × 10 cm × 10 cm 的花盆，培养条件为短日照周期（光照 8 小时，光强 130–150 μE m-2 s-1，温度 23°C；黑暗 16 小时，温度 20°C），相对湿度保持在 40–65%，培养 6 至 8 周5。根据文献描述5，定期使用市售肥料进行施肥。选择叶片尺寸大于 15 mm × 35 mm（长度测量包含叶柄）的植株用于实验。
2. N. benthamiana 和 N. tabacum
在环境控制培养室中，将一株植物种植于 Pro-Mix BX 培养基中，使用规格为 20 cm × 20 cm × 20 cm 的花盆，培养条件为长日照周期（16 小时光照，光照强度为 130–150 μE m-2 s-1，温度 23°C；8 小时黑暗，温度 20°C），相对湿度保持在 40–65%，培养 7 至 10 周。根据说明偶尔施用市售肥料。实验选用叶片尺寸大于 50 mm × 70 mm 的 N. benthamiana 植株，或大于 100 mm × 125 mm 的 N. tabacum 植株（上述长度测量不包括叶柄）。
2) 使用DNA包被的金微粒制备基因枪载体
该实验步骤的方案此前已有详细描述6。为在实验后期便于进行共聚焦显微镜分析，并获得最高的转化效率，使用高浓度（~1 μg/μl）且纯度良好的质粒DNA至关重要。
对于该实验，重要的是要确认制备的载弹在高频轰击下不会同时转化两个或多个相邻细胞，因为与荧光信号簇相关联的细胞数量被用作评估共质体运输程度的指标（即，单个细胞含有信号表明无运输发生，而多细胞信号簇则表明发生了运输）。每个载弹的质量可通过在轰击后16–20小时分析蛋白表达情况进行检测。我们的方案6 仅产生多细胞表达簇的试剂盒 &lt;在此时间范围内，所有表达事件的3%，因此适用于本实验。
3) 基因枪递送DNA包被的微粒
<ol>
	<li>使用锋利的剃须刀片切下处于相同发育阶段（即大小和年龄相同，参见步骤1）的叶片，并立即将其背面朝上放置于平整的泡沫塑料表面。由于叶片背面的毛状体密度较低且角质层较薄，因此更适合作为轰击的受体表面。Arabidopsis叶片因其相对较小，应覆盖一层窗纱网，并用图钉将网固定在泡沫塑料表面上。保持叶片平整可提高微粒递送效率，并在微轰击过程中最大限度减少组织损伤。</li>
	<li>将含有DNA包被微粒（按步骤1制备）的弹匣插入基因枪中。对于Arabidopsis，使用1-μm微粒时轰击压力为80–110 psi，使用0.6-μm微粒时为140–160 psi；对于N. benthamiana和烟草，使用1-μm微粒时压力为100–120 psi，使用0.6-μm微粒时为160–180 psi。对于Arabidopsis，通常每片叶片使用一个弹匣，因为每片叶片仅能提供足够一次轰击的表面积，微粒扩散区域直径约为10–12 mm。对于较大的N. benthamiana和烟草叶片，可在同一叶片上进行多次轰击，但必须在中脉两侧对称位置进行，以确保靶向相同发育阶段的叶片区域（见讨论部分）。</li>
	<li>将叶片从泡沫塑料表面取下，置于培养皿中的三层湿润Whatman滤纸上，用Parafilm密封培养皿，并在室温下孵育36–48小时，以允许转入基因的表达及其蛋白产物在细胞间的潜在移动。</li>
</ol>
4）蛋白质表达成像
通过共聚焦显微镜观察瞬时表达的标记蛋白的荧光信号。应仔细调整显微镜的设置，以获得每种待测蛋白的最佳检测条件。例如，对于细胞内积累有限且信号强度较弱的蛋白，如烟草花叶病毒运动蛋白（TMV MP）在胞间连丝的定位1-3,6，应使用40X物镜进行观察，以获得更高的分辨率和灵敏度；而对于在细胞质中广泛分布且信号较强的蛋白，如游离YFP，则可使用10X物镜结合共聚焦缩放功能进行快速成像（见图1）。
通过观察含有荧光信号的多细胞簇的出现可推断共质体运输情况。此类细胞簇的数量及每个簇中所含细胞的数目反映了细胞间运输的程度。为获得可靠数据，每种实验体系至少应记录100个表达簇。例如，若比较某种蛋白质在两种不同遗传背景（如野生型和转基因植株）中的细胞间移动能力，则总共应记录200个表达簇。重要的是，相互比较结果的实验应同时进行。
5. 代表性结果
下图展示了检测荧光标记蛋白胞间连丝运输的代表性实验。图A和图B显示了将表达TMV MP-YFP的构建体微弹轰击到N. benthamiana叶片后获得的典型共聚焦图像。在图A中，通过观察到YFP信号的多细胞簇，可判断TMV MP-YFP发生了胞间连丝运动。并非所有瞬时表达的TMV MP-YFP均能发生移动，部分微弹轰击结果显示为单细胞信号（图B），表明其运动受限。统计结果显示，在<40%的计数信号簇中，TMV MP-YFP无法在细胞间移动；而在>60%的信号簇中，该蛋白可在2-5个细胞间移动，其中以两个细胞的扩散最为常见（约占50%）（图1C）。
相对分子质量较小且无内在运动活性的蛋白质可通过胞间连丝（PD）在细胞间扩散。例如，游离的YFP或1xYFP（约27 kDa，图D）在30%的计数簇中可扩散至数个细胞（图C）。而对于翻译融合的YFP二聚体（2xYFP，54 kDa，图E），这种非特异性扩散则不会发生；其分子大小与烟草花叶病毒运动蛋白-YFP融合蛋白（TMV MP-YFP，57 kDa）相近，且完全局限于单个细胞内（图1C）。
<img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="显微镜荧光分析；病毒蛋白表达；示意图；实验结果；比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在 N. benthamiana 叶片组织中进行胞间连丝运输实验所获得的典型结果。(A, B) TMV MP-YFP 的可视化。(C) 信号簇的定量分析。1xYFP 和 2xYFP 分别代表游离 YFP 和翻译融合型 YFP 二聚体。(D) 1xYFP 的可视化。(E) 2xYFP 的可视化。显微图像中，左侧面板显示 YFP 信号，右侧面板显示 YFP 信号（绿色）与叶绿体自发荧光信号（白色）的叠加图像。图像为单层共聚焦切片。显微图中的星号标记了显示 YFP 信号的表皮细胞。标尺 = 50 μm。

<ol><li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. </a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viral+movement+proteins%3A+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li>
<li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1%2C3-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li>
<li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li>
<li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li>
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<li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+but+not+branched%2C+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li>
<li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li>
<li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li>
<li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

胞间连丝运输实验成功的关键在于获得高效的转化效率，从而产生具有统计学意义且易于检测的信号簇。为此，应使用从健康、健壮的植株上采集的叶片，并采用纯度高、浓度高的DNA制备物包裹金颗粒，以实现这一目标。
使用处于相同生长阶段的叶片对于确保检测的可靠性也至关重要。已知胞间连丝孔径会因组织发育阶段的不同而受到差异性调控7-11。许多植物物种的叶片以向基性方式发育，即从顶端向基部展开，叶片顶端部分比基部更成熟12。因此，不仅应选择发育阶段相同（通常通过叶片大小和在茎上的位置反映）的叶片用于每组实验，而且微轰击所针对的叶片区域也应位于相同的位置。
一些早期研究采用细胞自主性标记物，例如内质网锚定型绿色荧光蛋白（erGFP）11，以区分最初被转化的细胞与通过共质体运输获得测试蛋白的细胞。然而，后续一项研究表明，某些非细胞自主性蛋白与erGFP共表达时可诱导erGFP发生细胞间移动13，这质疑了erGFP作为初始转化标记物的可靠性，并显著增加了此类共表...

<table><tbody><tr><td>直径为1.0 &amp;mu;m的金微粒</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>直径为0.6 &amp;mu;m的金微粒</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel管路</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Helios基因枪弹制备站</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>管路切割器</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Helios基因枪</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>氦气调节器</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

一种细胞间大分子转运检测方法 在活体植物中 利用基因枪轰击技术

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

在此，我们介绍一种简单快速的方案，用于检测并评估细胞间大分子转运的程度 在植株中在本实验方案中，通过基因枪将编码目标蛋白的DNA构建体递送至植物组织，实现该蛋白在植物组织中的瞬时表达，并利用荧光标记对目标蛋白进行标记。随后通过共聚焦显微镜分析标记蛋白在细胞内及细胞间的分布情况。本文详细描述了该技术，并提供了在三种植物物种中检测与评估胞间连丝介导的蛋白质运输程度的分步实验方案。 拟南芥 拟南芥, Nicotiana benthamiana 和 N. tabacum （烟草）

通过瞬时表达带有荧光标记的目标蛋白质，并利用共聚焦显微镜分析其在细胞内和细胞间的分布，可以评估大分子在植物细胞间的转运情况。

本文介绍了一种简单快速的体内检测与评估细胞间大分子运输程度的实验方案。该方案中，一个……

以下实验的总体目标是分析荧光标记蛋白在植物表皮细胞间移动的程度。通过获取包裹DNA的金颗粒，在植物表皮中瞬时表达目标融合蛋白来实现该目的。第二步是将DNA递送至植物表皮，从而实现待测融合蛋白的表达及其在细胞间的移动。接下来，在共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白，以监测荧光标记的待测蛋白的表达情况及其亚细胞定位。通过共聚焦显微镜分析荧光信号的分布，获得结果以显示荧光标记蛋白在细胞间运输的程度。大家好，我是来自纽约州立大学石溪分校生物化学与细胞生物学系KY实验室的Ben Myers。今天我们将向您展示一种用于分析植物表皮中细胞间运动程度或荧光标记蛋白的方法。我们在实验室中使用该方法研究不同植物背景下植物病毒运动蛋白的细胞间运输，并比较不同类型蛋白质的细胞间移动能力。现在让我们开始吧。开始本实验方案时，将一株拟南芥种植于Promix bx培养基中。使用适当大小的花盆，并在环境控制培养箱中培养，设置短光照周期以及40%至65%的相对湿度；对于心叶烟（nicotiana, hamana）和烟草（nicotiana tobacco）植株，将每株植物种植在较大花盆的Promix BX培养基中，并同样置于环境控制培养箱中，设置长光照周期以及40%至65%的相对湿度。按照先前所述方法，偶尔使用市售产品对植株进行施肥。在培养 Opsis 植株六至八周后，选择大小超过 15 毫米 × 35 毫米的叶片用于实验，其中长度测量包含叶柄；对于 benanna 和 NAC 植株，需培养七至十周，然后分别选择大于 50 毫米 × 70 毫米（benanna）和 100 毫米 × 125 毫米（nac）的叶片。在这些情况下，长度测量不包括人。在开始通过基因枪递送DNA包被的微粒之前，需按照先前详细描述的方法制备含有DNA包被金微粒的基因枪弹匣。然后用锋利的剃须刀片切下处于相同发育阶段的叶片，并立即将其腹面朝上放置于平坦的泡沫塑料表面上。叶片的远轴面由于气孔密度较低且角质层较薄，是进行微弹轰击的较佳底物。对于拟南芥等小型叶片，可通过覆盖一小块窗纱网并用图钉将网固定在聚苯乙烯泡沫表面上来固定叶片。保持叶片平展，以提高微弹递送效率，并尽量减少微弹轰击过程中对组织的损伤。然后将带有DNA包被微粒的 cartridge 装入基因枪中。针对兔眼视网膜色素上皮细胞，使用0.6微米微粒在140至160 PSI的压力下进行轰击。使用每片叶片一个弹药筒对样品进行轰击，使微粒分散在直径为10至12毫米的表面区域。针对末端的benanna和baum叶片，使用0.6微米微粒在160至180 PSI的压力下进行轰击，适用于较大的末端benanna和烟草叶片。同一叶片可进行多次轰击，但必须在主脉两侧对称的位置进行，以靶向处于相同发育阶段的叶片区域。瞬时表达的标记蛋白的荧光信号通过共聚焦显微镜观察。应谨慎优化显微镜检测条件，为每种待测蛋白选择最佳的显微成像参数。使用 40 倍物镜观察在细胞内积累有限且信号强度较弱的蛋白质，例如烟草花叶病毒的质膜定位运动蛋白（tobacco mosaic virus movement protein）或 T-M-V-M-P。这可提供更高的分辨率和增强的灵敏度。然而，对于在细胞质中分布广泛且信号强度较强的蛋白质（如游离的黄色荧光蛋白或 YFP），可使用 10 倍物镜配合共聚焦显微镜的缩放功能进行快速成像。简单运输可通过出现含有荧光信号的多细胞簇来推断。此类簇的数量以及每个簇中的细胞数量反映了细胞间物质运输的程度。为获得可靠数据，每种实验体系至少记录100个表达簇，并注意同时进行实验。当进行比较时。此处检测了荧光标记蛋白的简单运输过程。展示了用表达 A TMV mp YFP 的构建体对末端哈马纳叶片进行微弹轰击后获得的典型共聚焦图像。基于YFP信号在多细胞簇中的出现，可观察到TMV MP YFP存在简单的运动现象。然而，并非所有瞬时表达的TMV MP YFP均能发生移动，单细胞信号的存在即为此提供了证据。在某些微弹轰击实验中。在少于40%的计数信号簇中，TMV MP YFP无法在细胞间移动；而在超过60%的信号簇中，该蛋白可在两至五个细胞间移动，其中以两个细胞间的传播最为常见。相对分子质量较小且不具有内在移动活性的蛋白质可通过细胞质膜SMA扩散，实现细胞间的移动。例如，游离的YFP或一个XYFP可在多个细胞间扩散，且在计数的聚集中超过30%。相反，翻译型YFP二聚体或两个XYFP则不会发生这种非特异性扩散，其大小与TMV MP-YFP融合蛋白相当，完全局限于单个细胞内。我们刚刚向您展示了如何利用基因枪系统在植物表皮中进行瞬时表达，以分析荧光标记蛋白的细胞间运动。进行此操作时，重要的是要记住准备健康、健壮的植株，高质量的DNA包被金颗粒用于DNA递送，并分析足够数量的表达簇以获得具有统计学可靠性的结果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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