Name: 从鼠眼视网膜干细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学习从鼠眼睫状体上皮分离视网膜干细胞并进行体外培养形成克隆球体的方法。该技术展示自我更新和多能性特征，为神经科学与再生医学研究提供可靠模型。

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我们感谢劳拉·克拉克（Laura Clarke）提供的宝贵帮助。本工作由加拿大卓越中心：干细胞网络（NCE: Stem Cell Network）、加拿大卫生研究院（CIHR）和美国国立卫生研究院（NIH）资助。

1. 准备解剖溶液和酶溶液
<ol>
	<li>提前配制人工脑脊液（ACSF）和无血清培养基，并冷藏保存。</li>
	<li>称取犬尿酸（Kynurenic Acid）（0.2 mg/mL），加入10 mL高糖ACSF中，在37°C水浴中提前溶解，因其不易溶于水。</li>
	<li>称取胰蛋白酶（Trypsin）（1.33 mg/mL）和透明质酸酶（Hyaluronidase）（0.67 mg/mL），置于同一15 mL离心管中，-20°C保存备用；使用前将犬尿酸溶液加入此管，并用22 μm注射器滤器过滤。</li>
	<li>称取胰蛋白酶抑制剂（Ovamucoid：1 mg/mL），溶于温热的无血清培养基中，并用22 μm注射器滤器过滤。</li>
	<li>配制铺板培养基：含FGF2（10 ng/mL）和肝素（Heparin）（2 μg/mL）的无血清培养基。</li>
</ol>
2. 从小鼠眼球中分离视网膜干细胞
<ol>
	<li>视网膜干细胞的分离在专门用于原代培养实验的无菌房间内进行。开始此操作前，先设置好解剖显微镜和冷光源，然后摆放好无菌的解剖器械。每个超净台均配备一个灼烧灭菌器，用于各步骤之间对器械进行灭菌。</li>
	<li>我们将从刚被摘除的小鼠眼球中分离视网膜干细胞，这些眼球在按照批准的动物伦理协议处死后，立即放入含有人工脑脊液（ACSF）的无菌培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用镊子清洁眼球：去除附着在角膜/巩膜交界处的毛发和结缔组织。然后将眼球转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。</li>
	<li>用齿镊轻轻固定眼球使其保持静止，使用斜面显微解剖剪剪除眼外肌。如果视神经仍附着在眼球上，也一并去除。在此过程中尽量避免挤压眼球。将眼球转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。</li>
	<li>接下来使用弯头显微解剖剪将眼球沿中线剪成两半：从视神经处开始，沿角膜中央剪开，最终回到起始的视神经位置。若两半眼球大小大致相等，则更有利于下一步操作。</li>
	<li>用两把镊子夹住角膜部分，轻轻将两半眼球分开。去除并丢弃晶状体、玻璃体以及神经视网膜，仅保留眼球壳。将眼球壳转移至另一含有 ACSF 的新培养皿中。</li>
	<li>现在我们准备分离睫状体上皮。首先，将眼球壳调整方向，使角膜位于右侧，视网膜色素上皮（RPE）位于左侧。用直头镊子在 RPE 侧轻轻固定眼球壳。</li>
	<li>接着，使用解剖刀轻轻下压（而非来回锯动）将角膜和虹膜从睫状体上皮上切下。</li>
	<li>随后，将睫状体上皮从 RPE 上切下。使用无齿镊将一段睫状体上皮转移至另一含有 2 mL ACSF 的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>以相同方法，从另一侧眼球壳中分离睫状体上皮。</li>
	<li>待两段睫状体上皮均收集完毕后，将组织条转移至含有 2 mL Dispase 的 35 mm 培养皿中。将培养皿连同组织条一起放入 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。</li>
	<li>10 分钟后，将组织条从 Dispase 溶液转移至另一含有 2 mL 过滤后的胰蛋白酶、透明质酸酶和犬尿酸的培养皿中。将培养皿置于 37 °C 条件下继续孵育 10 分钟。</li>
	<li>现在回到解剖显微镜下操作。用直头镊固定巩膜，使用弯头无齿镊的底部轻轻刮擦，将睫状体上皮从巩膜上分离。</li>
	<li>将巩膜从培养皿中移除。此时培养皿中仅应保留目标细胞和酶解液。</li>
	<li>使用火焰抛光的棉塞玻璃移液管，将上述溶液转移至 14 mL 离心管中。轻轻吹打溶液约 30 次，使上皮细胞充分解离。</li>
	<li>将离心管以 1500 RPM 离心 5 分钟。离心结束后，小心取出离心管，因为此时细胞容易从管底脱落。</li>
	<li>用火焰抛光的移液管小心吸除大部分上清液，然后向细胞沉淀中加入 1 mL 含血清-free培养基的胰蛋白酶抑制剂。使用小口径棉塞移液管吹打约 50 次，直至形成单细胞悬液。</li>
	<li>再次以 1500 RPM 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并替换为 1 mL 铺板培养基。使用火焰抛光的玻璃移液管轻轻吹打，重悬细胞。</li>
	<li>细胞计数后，按所需密度接种至 24 孔板中。我们通常以 10 个细胞/μL 的密度进行铺板，即先在每孔中加入培养基，再加入细胞悬液，最终每孔培养液体积为 500 μL。</li>
	<li>将培养板放入 37 °C CO2 培养箱中，期间避免移动，直至 7 天后观察并计数形成的细胞球。</li>
</ol>
3. 视网膜干细胞的分离结果
<ol>
	<li>当该操作成功实施后，分离的睫状体上皮细胞在解离并低密度接种培养后应呈现如下形态（图1）。</li>
	<li>培养7天后，对形成的视网膜干细胞球进行计数。只有直径超过75 μm且呈游离悬浮状态的细胞球才可被计为干细胞来源的细胞球（图2）。然而，部分细胞增殖能力有限，会形成不符合尺寸标准的类球体，此类结构不计入干细胞来源的细胞球；此类类球体的示例如下所示（图2）。</li>
</ol>
4. 典型结果
<img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="显微镜图像、细胞观察、50μm比例尺、生物学研究、细胞研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1.
<img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="颗粒物显微镜图像；RSC球形颗粒与较小颗粒对比，比例尺100 µm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本方案描述了如何从小鼠眼睛的睫状体上皮中分离视网膜干细胞1-3。分离睫状体上皮条带的方法可能有所不同，但本方案已优化了获得单细胞悬液所用的酶和操作步骤。此外，分离得到的睫状体上皮条带应避免含有大量视网膜色素上皮（RPE）或角膜组织，因为这些组织似乎会对每只眼睛所能分离得到的球状体总数产生不利影响。同时，我们配制的无血清培养基最初是为脑源性神经球设计的13，也非常适合视网膜干细胞球的培养。还应注意，在细胞接种并放入培养箱后，应避免扰动细胞，以防止生长中的球状体发生聚集14。
视网膜干细胞形成克隆球后，可对其进行计数，以获得每只眼球中干细胞的预期数量。随后可将这些细胞球解离为单个细胞，并进行传代培养以确定其自我更新能力，或通过不同组合的生长因子和/或蛋白质诱导其分化为神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）中的各类细胞类型。

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>双臂光纤照明</td></tr><tr><td>弯曲微型 Vannas 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>斜角 Vannas 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>无齿</td></tr><tr><td>#5 Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>直头</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>有齿弯曲</td></tr><tr><td>#3 手术刀柄</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 手术刀片</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>电热灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>犬尿烯酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>带棉塞移液管</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>火焰抛光</td></tr><tr><td>14 mL 管</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>聚苯乙烯</td></tr><tr><td>无血清培养基</td><td></td><td></td><td>配方参见编号 13</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

成年小鼠视网膜干细胞（RSC）是哺乳动物眼球睫状体上皮（CE）中一种罕见的静息态细胞1,2,3睫状缘（CE）由非色素性内层细胞和色素性外层细胞组成，起源于CE单个色素细胞的克隆性RSC集落包含色素性和非色素性细胞，这些细胞可分化为神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的所有细胞类型。关于球形集落内所有细胞是否均含有至少一定量的色素，目前仍存在争议。4；然而这些细胞仍具有形成视网膜神经层内各种细胞类型的能力1-3在某些物种中，例如两栖动物和鱼类，其眼睛在受伤后具有再生能力。5然而，哺乳动物的眼睛并不具备这种再生能力。我们旨在鉴定出干细胞 体内 并理解维持哺乳动物视网膜干细胞处于静息状态的机制6-8，即使在损伤后仍具有活性，并可作为细胞来源，通过移植帮助修复眼部损伤的物理或遗传模型9-12在此，我们描述了如何从鼠眼分离睫状上皮细胞，并在体外培养中培育这些细胞以形成克隆性视网膜干细胞球。由于目前尚无已知的干细胞特异性标记物 体内这些球体是目前已知唯一能够前瞻性鉴定眼睫状上皮中干细胞群体的方法。

在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。

成年小鼠视网膜干细胞（RSC）是一种稀有的静息细胞，位于哺乳动物眼球的睫状上皮（CE）内1,2,3。CE由……组成

本实验的总体目标是从眼球的睫状体上皮中分离出视网膜干细胞。首先从视神经开始，沿角膜切开眼球并再次回到视神经处，将眼球切成两半，随后去除神经视网膜和晶状体，完成初步处理。实验的第二步是切除角膜、虹膜以及视网膜色素上皮，从而获取睫状体上皮组织。该操作流程的第三步是通过酶处理睫状上皮，去除巩膜，并将上皮组织机械解离为单个细胞。最后一步是将细胞重悬于无血清培养基中，接种至含有添加生长因子的无血清培养基的组织培养板中。最终，可通过体外克隆球体形成实验，前瞻性地获得眼睫状上皮中干细胞数量的结果。您好，我叫 Brenda Coles。我们实验室最初是在研究关于两栖动物和鱼类眼睛再生能力的文献时，提出了这一方法，并假设哺乳动物眼睛中可能也存在具有相同能力的细胞。视网膜干细胞的分离是在专门用于原代培养实验的特定无菌房间中进行的。开始此操作之前，先设置好解剖显微镜和冷光源，然后摆放好无菌的解剖器械。每个超净台都配有高温灭菌器，用于在操作步骤之间对器械进行灭菌。我们将从刚取出的小鼠眼球中分离视网膜干细胞，眼球取出后应立即放入含有无菌人工脑脊液的培养皿中。小鼠应根据批准的动物伦理规程实施安乐死。该操作中最困难的部分是在显微镜下解剖一个球形物体。必须格外小心，以免破坏目标组织。在解剖显微镜下，用镊子清理眼球，去除角膜巩膜交界处的毛发及相连组织。然后用齿镊固定眼球，将其转移至盛有人工脑脊液（A CSF）的新培养皿中。使用斜角显微解剖剪去除眼外肌。如果视神经仍附着在眼球上，也应将其去除，注意在此过程中尽量不要挤压眼球。将眼球转移至含有脑脊液的新培养皿中。接下来使用弯头显微解剖剪将眼球切成两半。从视神经开始，沿角膜中央剪开，最终回到起始的视神经处，完成环形切割。若两半眼球大小大致相等，则更有利于后续操作。用两把镊子夹住角膜，轻轻将眼球的两半分开。移除并丢弃晶状体、内脏以及视网膜神经组织。将眼球壳转移到含有人工脑脊液的新培养皿中。现在我们准备分离睫状上皮。首先将眼球壳定向，使角膜位于右侧，视网膜色素上皮位于左侧。用直镊子轻轻在RPE侧将眼球壳固定住。接下来，使用手术刀轻轻下压而非来回锯动，将角膜和虹膜从眼球的睫状体上皮上分离。随后，将睫状体上皮从视网膜色素上皮（RPE）上分离。使用无齿镊子将一段睫状体上皮转移至一个新的含有人工脑脊液（A CSF）的35毫米培养皿中。以相同方式，从另一只眼球壁中分离睫状体上皮。收集到睫状体上皮条带后，将其转移至一个含有2毫升消化液的35毫米培养皿中。将含有组织条带的培养皿置于37°C培养箱中孵育10分钟。10 分钟后，用直镊子固定巩膜，将条带从解剖空间转移至含有两毫升经滤过的滴液的培养皿中，滴液成分为 Halle ur haase 和 kind reic 酸。将培养皿置于 37 摄氏度环境中 10 分钟。此时返回解剖显微镜下继续操作。使用无刻度弯头镊子的尖端轻轻将睫状上皮从巩膜上刮离。将巩膜从培养皿中移除。培养皿中仅应留下睫状上皮组织。现在是目标细胞和酶溶液。使用经火焰抛光并带有棉塞的移液管，将溶液转移至一个14升离心管中。轻轻推动溶液反复通过移液管，上下吹打30次，以分离上皮细胞，然后将离心管在1500 RPM条件下离心5分钟。离心完成后，小心地从离心机中取出离心管。由于细胞容易从管底脱落。此时，用火焰抛光的移液管轻柔地吸出大部分上清液，然后向细胞中加入1毫升含无血清培养基的胰蛋白酶抑制剂。使用带有小孔棉塞的移液管将样本反复吹打约50次，直至形成单细胞悬液。再次以1500 RPM离心5分钟，弃去上清液，并加入1毫升铺板液。使用火焰抛光的玻璃移液管轻轻吹打重悬细胞，并将培养基置于低温环境。计数后，将细胞以所需密度接种。在24孔板中，我们通常先向每个孔中加入培养基，然后加入细胞悬液，使培养基终体积为500 µL，接种密度为每微升10个细胞。将培养板放入37摄氏度的二氧化碳培养箱中，在此期间避免移动，直至七天后计数成功形成的球状体。解剖得到的睫状上皮细胞在低密度解离并接种后应呈现如下形态。培养七天后，对形成的视网膜干细胞球状体进行计数。一个细胞球的直径应超过75微米，并且为悬浮状态，方可被计数为干细胞来源的细胞球。然而，某些细胞增殖能力有限，会形成不符合尺寸标准的PHE，这些细胞球将不被计为干细胞来源的细胞球。以下展示的是此类星状体在发育完成后的一个示例。该技术为视觉科学领域的研究人员探索利用视网膜干细胞治疗视网膜疾病的可能性铺平了道路。

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