从鼠眼视网膜干细胞的分离

在这段视频中，我们将演示如何隔离鼠标眼睫状体上皮视网膜干细胞，并在文化中成长，他们形成克隆视网膜领域。被隔离的领域拥有的干细胞的大是大非特性:自我更新和multipotentiality。

该程序的总体目标是从眼睛的睫状上皮中分离视网膜干细胞。这是通过首先清洁眼睛并将眼睛切成两半，从视神经开始，切开角膜并在视神经处汇合，然后去除神经视网膜和晶状体来实现的。该程序的第二步是通过切断角膜虹膜和视网膜色素上皮来切除睫状上皮。

该程序的第三步是酶促处理睫状上皮，去除巩膜并将上皮机械解离成单细胞。该程序的最后一步是将细胞重悬于无血清培养基中，并将它们接种在含有生长因子的无血清培养基的组织培养板中。最终，可以获得结果，前瞻性地显示通过克隆球在体外形成的眼睛睫状上皮中发现的干细胞数量。

大家好，我是 Brenda Coles。我们的实验室在研究两栖动物和鱼类眼睛中的再生能力的论文时首次提出了这种方法，并假设哺乳动物的眼睛中可能有一个细胞具有相同的能力。视网膜干细胞的分离在专用于原代培养实验的特定无菌室中进行。

在开始此过程之前，设置解剖显微镜和冷光源，然后布置无菌解剖器械。每个罩子都有一个热拍消毒器，用于在步骤之间对器械进行消毒。我们将从眼睛中分离出视网膜干细胞，这些细胞已立即放入含有人工脑脊髓液的无菌培养皿中 根据批准的动物伦理协议从处死的小鼠中取出后，该程序最困难的方面是在显微镜下解剖圆形物体。

必须非常小心，以免破坏感兴趣的组织 在解剖显微镜下，用镊子清洁眼睛。去除附着在角膜巩膜边缘的毛发和连接组织。然后将眼睛转移到带有 A CSF 的新培养皿中，同时用锯齿镊子保持眼睛静止。

使用有角度的显微解剖剪刀去除眼肌。如果视神经仍然附着在眼睛上，也要切除它，在此过程中尽量不要挤压眼睛。将眼睛转移到带有 CSF 的新培养皿上。

接下来使用弯曲的微型解剖剪刀将眼睛切成两半。从视神经开始，切开角膜的中间，回到开始切割的视神经。如果两只眼睛的大小大致相等，那将是理想的，因为这将使下一步更容易。

用两把镊子夹住角膜，轻轻地将两半眼睛分开。从眼壳中取出并丢弃晶状体、内脏和神经视网膜。将蛋壳转移到装有 A CSF 的新培养皿中。

现在我们准备分离睫状上皮。首先，确定眼壳的方向，使角膜位于您的右侧，视网膜色素上皮位于您的左侧。用 RPE 侧的直镊子轻轻地将眼壳固定下来。

接下来，使用手术刀轻轻向下推手术刀，而不是使用锯切动作，将角膜和虹膜从眼睛的睫状上皮上切开。之后，将睫状上皮从 RPE 上切开。使用无锯齿镊子将睫状上皮条转移到含有 A CSF 的新 35 毫米培养皿中。

以同样的方式，将睫状上皮与另一个眼壳隔离开来。收集睫状上皮条后，将条带转移到含有 2 毫升 dis 间隙的 35 毫米培养皿中。将带有条带的培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 10 分钟。

10 分钟后，将试纸从 dis 空间转移到一个装有两毫升过滤滴注的盘子中，加入 Halle ur haase 和各种 reic acid。将盘子放在 37 摄氏度下 10 分钟。现在返回解剖显微镜，同时用直镊子压住巩膜。

使用曲线底部非额定镊子轻轻地将睫状上皮从巩膜上刮开。从培养皿中取出巩膜。所有这些都应该留在盘子里。

现在是感兴趣的细胞和酶溶液。使用火焰抛光棉塞移液器，将溶液转移到 14 L 试管中。轻轻地将溶液从移液器中压入和压出，将该溶液揉搓 30 次以分离上皮细胞，以 1500 RPM 的速度离心试管 5 分钟。

离心完成后，小心地从离心机中取出试管。由于细胞很容易从管底部脱落。在此阶段，使用火焰抛光移液器轻轻吸出大部分 SuperNet，然后在无血清培养基中加入 1 毫升胰蛋白酶抑制剂到细胞中。

使用小钻孔棉塞移液器将样品 tri 约 50 次，直到成为单细胞悬液。再次离心试管 5 分钟。在 1500 RPM 时，去除上清液并替换为 1 毫升电镀液。

培养基：使用火焰抛光玻璃移液器轻轻冷藏，以重悬细胞。计数后，细胞以所需的密度接种。在 24 孔板中，我们通常每微升接种 10 个细胞，方法是先用培养基填充每个孔，然后添加细胞悬液以获得最终体积为 500 微升的培养基。

将板放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中，在成功执行此程序 7 天后计数出现的球体之前，它不会移动。解剖的睫状上皮细胞在解离并以低密度铺板后应如下所示。培养 7 天后，对出现的视网膜干细胞球进行计数。

球体的直径应超过 75 微米且可自由浮动，才能算作干细胞衍生球体。然而，一些细胞的增殖有限，并形成不符合大小标准的 PHE，不会被算作干细胞衍生的球体。这里显示了这种小行星的一个例子 发展之后.

这项技术为视觉科学领域的研究人员探索使用视网膜干细胞治疗视网膜疾病的可能性铺平了道路。