Name: 雪旺的星形胶质细胞使用相互作用分析检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解雪旺细胞与星形胶质细胞体外相互作用分析方法，探索边界形成与细胞迁移机制。该研究为脊髓损伤修复策略提供重要实验基础与再生医学应用价值。

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我们感谢Philippa Warren的热心帮助。

1. 边界实验：
<ol>
<li>基础准备：实验开始前，将腔室载玻片在聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）溶液中包被过夜，并准备好无菌玻璃盖玻片。使用杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM），添加10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素B（PSF）配制培养基。同时准备一瓶无钙镁的汉克斯平衡盐溶液（Calcium/Magnesium free Hanks balanced salt solution, HBSS）。</li>
<li>原代大鼠施万细胞在培养瓶中用0.1%胰蛋白酶消化3分钟；原代大鼠星形胶质细胞则用0.1%胰蛋白酶消化5分钟。 
通过加入含10% FCS和1% PSF的DMEM终止胰蛋白酶活性。</li>
<li>消化后的施万细胞和星形胶质细胞分别转移至两个15 mL离心管中，在300G条件下离心5分钟。</li>
<li>将施万细胞和星形胶质细胞重悬，调整细胞密度至2 × 106（细胞密度的变化参见代表性结果部分）。</li>
<li>取50 μL施万细胞悬液滴加于PDL包被的腔室载玻片一端的孔中，用玻璃条将液滴向孔中央涂抹，形成一条直线边缘。（使用玻璃切割器将矩形玻璃盖玻片纵向切割，使其宽度适合用于边界实验的腔室载玻片）</li>
<li>在同一孔的另一端滴加第二滴50 μL星形胶质细胞悬液，并向中心方向涂抹，形成与第一滴平行的直线边缘，两者之间保留约0.2 mm的小间隙。</li>
<li>将含有细胞液滴的腔室载玻片置于37°C培养箱中孵育2小时。</li>
<li>2小时后，用DMEM洗涤培养物以去除未贴壁的细胞碎片，并加入新鲜培养基（DMEM/10% FCS/1% PSF）。 
注意：DMEM/10% FCS/1% PSF培养基可额外补充佛司可林（forskolin，2μM）和牛垂体提取物（BPE，10μg/mL），以促进施万细胞增殖。BPE可提供支持施万细胞长期培养所需的生长因子，而佛司可林则通过提高施万细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平诱导其增殖。</li>
<li>细胞在37°C、7% CO2培养箱中培养约8–10天，每3天更换一次培养基。两种细胞的前沿最终会相遇，在两类细胞之间形成清晰的边界。此时可开展相关实验，分析参与边界形成的因子。</li>
<li>共培养体系可用4%甲醛固定，施万细胞使用抗P75抗体进行免疫染色，星形胶质细胞使用抗GFAP抗体染色，以区分共培养中的不同细胞类型。P75抗体识别施万细胞表面的低亲和力NGF受体，该受体在星形胶质细胞中缺失；抗GFAP抗体识别定位于星形胶质细胞胞质中的胶质纤维酸性蛋白。（代表性边界图像请见图1A）</li>
</ol>
2. 迁移实验：
<ol>
<li>将4孔板（每孔直径15 mm）用PDL包被过夜，用于制备星形胶质细胞单层。</li>
<li>使用0.1%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞培养物进行胰酶消化5分钟。加入含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素（PSF）的DMEM培养基以终止胰酶反应，并在300×g离心5分钟。（见图2）</li>
<li>将星形胶质细胞重悬于1×105 个细胞/mL的培养基中，每孔PDL包被的4孔板中加入1 mL该细胞悬液。星形胶质细胞培养24–48小时，直至形成完全融合的单层。</li>
<li>为评估施万细胞在星形胶质细胞单层上的迁移能力，在制备星形胶质细胞单层的同时，将圆形PDL包被的玻璃盖玻片放入50 mL离心管中，用塑料移液器碾碎，以获得小片状玻璃碎片。</li>
<li>将玻璃碎片转移至6孔板中的一个孔内，用镊子挑选合适大小的碎片并移至其他孔中。每个6孔板的孔中放置5片玻璃碎片。</li>
<li>对培养于培养瓶中的原代施万细胞使用0.1%胰蛋白酶消化3分钟。将消化后的施万细胞转移至15 mL离心管中，在300×g离心5分钟。将施万细胞重悬于DMEM/10%FCS/1%PSF培养基中，浓度为2×106 个细胞/mL。</li>
<li>在6孔板中每个含有5片玻璃碎片的孔上，各加入20 μL施万细胞悬液，并在37°C、7% CO2条件下孵育2小时。</li>
<li>2小时后，施万细胞已贴附于玻璃碎片表面，向每孔中加入含2 μM佛司可林（forskolin）和10 μg/mL牛垂体提取物（BPE）的DMEM/10%FCS/1%PSF培养基，确保碎片完全浸没于培养基中。</li>
<li>将含有玻璃碎片的6孔板置于培养箱中继续培养24–48小时，直至玻璃碎片表面被施万细胞完全覆盖。</li>
<li>当玻璃碎片表面形成完全融合的施万细胞层后，使用尖头镊子小心夹起每一片碎片，浸入HBSS中以去除未贴附的细胞，然后将碎片细胞面朝下倒置放置于星形胶质细胞单层上。</li>
<li>每孔加入1 mL DMEM/10%FCS/1%PSF培养基覆盖碎片，允许施万细胞迁移24至48小时。在此期间，可加入实验试剂（如生长因子），以评估其对施万细胞迁移数量和迁移距离的影响。</li>
<li>迁移期结束后，向每孔加入4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟，使玻璃碎片牢固附着于孔底。固定完成后，对施万细胞进行免疫染色，使用抗p75抗体（识别低亲和力神经生长因子受体），随后采用ABC链霉亲和素-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒显色，以便在光学显微镜下观察施万细胞。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
培养8-10天后，雪旺细胞与星形胶质细胞的共培养体系中会形成两种细胞类型之间的清晰边界。若在培养中使用佛司可林（forskolin）和牛垂体提取物（BPE），该边界更为明显，因为这些成分可促进雪旺细胞的增殖。
如果在10天内未观察到边界形成，可进一步延长培养时间，直至边界建立。改变细胞密度比例是促进边界形成的另一种方法。在制备细胞悬液时，可采用3:1的施万细胞与星形胶质细胞密度比例8,18。
在通过免疫染色鉴定施万细胞和星形胶质细胞后，可通过在确定的边界处画一条线，以评估细胞的相互混合情况，并在荧光显微镜下计数迁移至星形胶质细胞区域内的施万细胞数量。
以下是获得边界区域的两个图像示例，其中一个显示施万细胞与星形胶质细胞形成了清晰的分隔区域（图1A），而另一个由于操作技术不佳，细胞未能很好地分隔到不同区域（图1B）。
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="荧光显微镜下的神经元网络形成；绿色和红色染色，细胞相互作用研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 边界实验：施万细胞与星形胶质细胞相互作用。A) 在佛司可林和BPE存在下共培养10天，以促进施万细胞增殖，结果显示两种细胞类型之间形成清晰的边界（红色=P75，绿色=GFAP）。B) 一个10天的共培养实验，其中未形成明显边界，两种细胞前沿相互混合。这是由于在制备边界时，将星形胶质细胞和施万细胞的液滴并排放置过程中发生了液滴混合所致（红色=P75，绿色=GFAP）。
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="细胞培养显微图像，用于观察细胞形态和结构，是一种生物学研究工具。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 星形胶质细胞融合单层的代表性图像
迁移实验用于评估一种细胞在另一种细胞表面的移动，因此所研究的现象与边界形成不同。
操作时需要练习，以确保将盖玻片翻转至单层细胞上时，尖头镊子不会损伤覆盖有施万细胞的玻璃碎片及星形胶质细胞单层。为评估施万细胞的迁移情况，可在光学显微镜下测量从盖玻片边缘迁移的细胞最大迁移距离以及迁移细胞的数量。
以下是使用DAB染色法在星形胶质细胞单层表面进行P75抗体染色的施万细胞图像（图3）。 
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="真菌菌丝生长的显微图像；微生物学分析，结构研究，细胞形态学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 使用倒置盖玻片法进行迁移实验。
A) 施万细胞（棕色，用p75抗体免疫染色）从盖玻片边缘向外迁移。箭头指示细胞从盖玻片边缘迁移的方向。

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</ol>

无利益冲突声明。

上述检测方法已用于多项研究，以阐明多种因素在施万细胞-星形胶质细胞边界形成以及施万细胞在星形胶质细胞环境中迁移受限过程中的作用。
理解这些事件背后的机制至关重要，因为这将有助于开发出优化和增强施万细胞移植物在移植后整合的策略，从而促进再生的轴突从移植物重新进入宿主组织，并与宿主组织建立连接。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（矩形）</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>培养皿载片</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>4孔板，6孔板</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>4孔板6孔板</td></tr><tr><td>大鼠p75抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>二抗（Alexa标记）</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>羊抗小鼠568 羊抗兔488</td></tr><tr><td>生物素化二抗</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>羊抗小鼠</td></tr><tr><td>DAB片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>ABC Elite试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

利用雪旺细胞-星形胶质细胞相互作用分析 体外 检测方法

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

施万细胞是脊髓损伤后修复策略中常用的细胞之一。施万细胞能够通过分泌生长因子1,2，提供促进生长的黏附分子3以及细胞外基质分子4，支持轴突的再生与出芽。此外，它们还能在损伤部位对脱髓鞘的轴突进行再髓鞘化5。
然而，移植后施万细胞不会从植入部位迁移，也不会与宿主星形胶质细胞混合6,7。这导致施万细胞与星形胶质细胞之间形成明显的边界，从而阻碍轴突从移植物近端和远端重新生长进入宿主组织。与施万细胞接触的星形胶质细胞还会发生肥大，并上调抑制性分子的表达8-13。
体外 实验已被用于模拟施万细胞与星形胶质细胞之间的相互作用，并在理解细胞行为潜在机制方面发挥了重要作用。
这些 体外 实验方法包括边界分析法，即通过两种不同细胞共培养，每种细胞占据不同的区域，两群细胞前沿之间仅留有微小间隙。随着细胞分裂和迁移，两个细胞前沿逐渐靠近并最终发生碰撞，从而可在边界处分析两种细胞群体的行为。该技术的另一种变体是将两种细胞群体在培养中混合，随着时间推移，两类细胞发生分离，其中施万细胞聚集成岛状结构，分布于星形胶质细胞之间，从而形成多个施万细胞-星形胶质细胞边界。
研究两种细胞类型相互作用所采用的第二种方法是迁移实验，该实验可追踪细胞在另一种细胞单层表面的移动情况14,15。该实验通常被称为倒置盖玻片实验。将施万细胞培养在小块玻璃碎片上，然后将其倒置并贴附于星形胶质细胞单层表面，随后从盖玻片边缘评估细胞的迁移情况。
这两种检测方法在研究细胞排斥和边界形成的潜在机制方面发挥了重要作用。利用这些技术鉴定出的一些分子包括N-钙黏蛋白15、硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）16,17、FGF/肝素18、Eph/ephrin19。
本文旨在逐步描述边界测定法和迁移测定法，并阐明可能遇到的技术问题。

本文旨在逐步描述常用的方法 体外 用于研究施万细胞-星形胶质细胞相互作用的检测方法

施万细胞是脊髓损伤后修复策略中常用的细胞之一。施万细胞能够支持轴突的...

施万细胞是周围神经系统中的胶质细胞，已被用于脊髓损伤的修复。它们主要通过分泌支持轴突再生的生长因子，并提供促进生长的黏附分子和细胞外基质分子来发挥作用。此外，施万细胞还能在损伤部位对轴突进行髓鞘化。遗憾的是，移植的雪旺细胞不会从植入部位迁移，也不会与宿主星形胶质细胞混合。这导致形成明显的边界，阻碍了生长中的轴突与宿主组织的整合。在本视频中，采用了两种方法在体外研究雪旺细胞与星形胶质细胞之间的相互作用。首先，演示一种边界实验，其中在载玻片上建立雪旺细胞和星形胶质细胞的区域并进行培养。随后向载玻片中加入不同的试剂，并继续培养一段时间。然后对载玻片进行成像和分析，以确定这些试剂对雪旺细胞向星形胶质细胞区域迁移（或相反方向迁移）的影响。接下来演示一种迁移实验，其中覆盖有施万细胞巢的盖玻片碎片被倒置在星形胶质细胞单层上。同样，在培养基中加入不同的试剂，经过培养后进行成像，以评估施万细胞在星形胶质细胞单层上的迁移程度和迁移距离。最终，这类实验应有助于促进移植后优化和增强施万细胞移植物整合策略的开发。与现有方法相比，这些体外实验的优势在于，现有方法通常评估细胞在纯基质上的迁移，而本方法更接近于体内实验情况，即移植的细胞会与星形胶质细胞接触。此外，这些体外实验还可应用于其他领域，例如细胞生物学，以回答肿瘤细胞侵袭与迁移等关键科学问题。在开始实验前，请准备好以下物品：聚-D-赖氨酸包被的腔室载玻片、无菌玻璃载玻片、细胞培养基以及一瓶钙溶液。无镁Hanks平衡溶液开始，用胰蛋白酶消化初级雪旺细胞3分钟，初级大鼠星形胶质细胞5分钟。待细胞脱落后，加入细胞培养基以终止胰蛋白酶活性。随后，将雪旺细胞和星形胶质细胞分别转移至两个15毫升Falcon离心管中，在300 × g离心5分钟。同时，使用玻璃切割器将矩形玻璃盖玻片纵向切割，使其宽度能够适配用于边界实验的腔室载玻片，并便于涂布细胞悬液液滴。离心重悬后，将施万细胞和星形胶质细胞重悬于密度为每毫升2×10⁶个细胞的溶液中。在一端涂有聚赖氨酸的腔室载玻片小室中，加入50 µL施万细胞悬液液滴。使用玻璃条将液滴向腔室中心涂抹，以形成一条直边。接着，在同一孔的另一端放置第二滴50微升的星形胶质细胞悬液，并向中心方向涂抹。为形成与第一条直边平行的边缘，两者之间应保持0.2毫米的间隙。将含有液滴的培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育两小时。两小时后，用DMEM洗涤培养物，以去除任何未贴壁的细胞碎片。为了促进施万细胞增殖，向培养腔载玻片中加入培养基。该培养基中添加了四种加林（four galin）和牛垂体提取物（BPE）。四种加林可提高施万细胞内的环磷酸腺苷（cyclic AMP）水平，从而诱导细胞增殖，而BPE则提供长期培养所需的生长因子。将载玻片孵育8至10天。两种细胞的前沿最终会相互接触，并在两种细胞类型之间形成清晰的边界。此时可进行实验。分析参与边界形成的因素以检测边界，用4%多聚甲醛固定共培养细胞。为了区分施万细胞和星形胶质细胞，分别使用抗P75抗体和抗GFAP抗体进行免疫染色。P75抗体识别施万细胞上的低亲和力NGF受体，而星形胶质细胞缺乏该受体；抗GFAP抗体识别定位于星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白，以进行迁移实验。开始进行铺板。在四孔板的每个孔中加入1×10⁵个星形胶质细胞，溶于1毫升培养基中，孔径为15毫米。将该板置于37°C培养箱中培养24至48小时，直至单层细胞完全融合。同时，为了准备天鹅细胞以评估其在星形胶质细胞单层上的迁移能力，将圆形多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片放入一个50毫升的试管中，并使用塑料移液器将其压碎，形成小块玻璃碎片。用镊子将玻璃碎片转移至六孔板的一个孔中，挑选直径约5毫米的碎片，并将5片分别转移至其余各孔中。将胰蛋白酶作用于雪旺细胞3分钟。然后将细胞转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。用培养基将雪旺细胞重悬至浓度为2 × 10⁶ 个细胞/毫升。然后在每个组织片段上加入20微升施万细胞悬液，在37摄氏度、7%二氧化碳条件下孵育2小时。2小时后，从培养箱中取出施万细胞。向每孔中加入足量的培养基，培养基中需补充2微摩尔的四阶素和每毫升10微克的BPE。将带有贴壁细胞的碎片完全浸没在培养基中，于37°C孵育24至48小时，直至玻璃碎片表面被星形细胞完全覆盖。当碎片被星形细胞覆盖后，从培养箱中取出含有星形细胞和星形胶质细胞的样本。使用镊子小心夹起每一片带有贴壁星形细胞的碎片。将组织块浸入HBSS中以去除未贴附的细胞，然后将其倒置贴附于星形胶质细胞单层上。待所有组织块转移完毕后，向每孔加入1毫升细胞培养基。如果需要评估实验试剂（如生长因子）的作用，则应将其加入培养基中。将培养板放回培养箱，使施万细胞迁移24至48小时。迁移结束后，通过加入4%多聚甲醛固定30分钟，使玻璃碎片固定在每孔底部。使用P 75对施万细胞进行免疫染色，然后采用ABC Strept Avidin试剂盒（由Diam benadine提供）进行染色，以便在10天后通过光学显微镜观察施万细胞。施万细胞与星形胶质细胞的共培养显示出两种细胞类型之间清晰的边界。此处，施万细胞通过P 75进行鉴定。低亲和力NGF受体的染色呈红色，而星形胶质细胞通过呈绿色的GFAP染色进行识别。如果在培养中使用forskolin和BPE，这些细胞之间的边界会更加明显，因为施万细胞的增殖得到增强。相比之下，在此10天的共培养实验中，细胞未能很好地分隔成不同的区域。这是由于操作技术不佳以及两种细胞类型的混合所致。在准备边界实验时，迁移实验用于评估一种细胞类型在另一种细胞类型表面的移动，因此所评估的是与边界形成不同的现象。此图像显示天鹅细胞从盖玻片边缘向外迁移，箭头指示细胞迁移的方向。在进行体外实验时，需要注意的是，试剂的作用对象可能是星形胶质细胞或施万细胞，因此需要进一步的实验来明确究竟是哪种细胞类型导致了所观察到的迁移增加或减少。此外，还可以采用其他技术方法，例如免疫化学染色，尤其是在边界实验中，以揭示在施万细胞与星形胶质细胞交界处哪些分子的表达发生了上调或下调。

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

雪旺的星形胶质细胞使用相互作用分析<em在体外检测

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利用雪旺细胞-星形胶质细胞相互作用分析体外检测方法

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