Name: 多光谱实时荧光成像术在妇科肿瘤前哨淋巴结的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习多光谱实时荧光成像术在妇科肿瘤前哨淋巴结检测中的应用，使用吲哚菁绿荧光示踪剂实现术中实时可视化与精准切除，提高宫颈癌和外阴癌手术准确性。

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我们感谢Ina Wesselman女士对手术室人员的培训和规划工作。

1. 术中多光谱荧光相机
<ol>
	<li>该定制相机系统由德国慕尼黑工业大学/亥姆霍兹中心生物与医学影像研究所（IBMI, Technical University / Helmholtz Zentrum, Munich, Germany）与美国加利福尼亚州雷德伍德海岸的SurgOptix公司（SurgOptix Inc, Redwood Shores, CA, USA）密切合作开发。术中多光谱荧光相机系统的装置如图2所示。</li>
	<li>光线通过光学系统后，被分离为可见光、发射（荧光）波长带的光和激发波长带的光。这些光束由CCD相机（CCD）检测（图2）。所有相机获取的多光谱信号经过处理，以校正伪影并获得真实的定量荧光染料生物分布。彩色图像和荧光信号可分别在外部显示器上显示，也可叠加为一幅图像。</li>
	<li>本研究中相机的激发滤光片和发射滤光片分别设置为采集750 nm和800 ±20 nm的光信号。</li>
</ol>
2. 光学对比剂的制备
<ol>
	<li>在无菌条件下配制荧光造影剂吲哚菁绿（ICG, Pulsion AG, Munich, Germany）。使用浓度为 0.5 mg/mL。必须使用无菌蒸馏水而非氯化钠（NaCl）溶液，因为后者会导致ICG聚集。</li>
	<li>配制后，溶液必须保存在避光、低温处，以避免荧光强度因光漂白而迅速下降。注意：此后应始终避免ICG暴露于光线下。</li>
</ol>
3. 术中成像——ICG的准备与注射
<ol>
	<li>手术前，在手术室中对摄像头进行定位并启动，以尽量减少对标准手术操作的干扰，并将其连接至高清显示屏（图2B）。</li>
	<li>由穿戴无菌手术服的研究人员使用标准无菌罩单（Carl Zeiss Vision BV，荷兰斯利德雷赫特，OPMI Drape REF 306071）覆盖摄像头。</li>
	<li>注意：应仅使用透明的消毒剂，因为有色消毒剂通常具有自发荧光，可能干扰成像过程。此外，无菌罩单和手术标记物也可能具有自发荧光。建议在手术前测试手术室及手术区域中使用的所有材料是否具有自发荧光。</li>
	<li>在无菌条件下配制荧光对比剂吲哚菁绿（ICG），使用浓度为0.5 mg/mL。必须使用无菌蒸馏水而非氯化钠溶液（NaCl），因为后者会导致ICG聚集。配制完成后，溶液应储存在阴暗、低温处，以避免荧光强度快速衰减。注意：建议在配制ICG后更换手套，因为即使少量ICG溢出也可能影响图像质量。</li>
	<li>打开腹腔后开始成像操作。当目标区域暴露后，将摄像头移入手术区域。在无菌条件下调节变焦和对焦。关闭手术室内的照明灯，以更好地检测荧光信号。</li>
	<li>将1.0 mL浓度为0.5 mg/mL的ICG与1.0 mL标准蓝色染料（专利蓝 / bleu patenté，Guerbet，法国）混合于同一注射器中。外科医生在原发肿瘤周围的四个象限内注射对比剂，避免试剂溢出。注意：若ICG溢出至手术手套上，必须更换手套。采集淋巴流动过程及荧光示踪淋巴结显影的静态图像或实时视频（图3）。所有图像和视频均直接保存至计算机。</li>
	<li>除荧光检测外，还根据标准方案通过γ探针或肉眼观察淋巴结是否呈蓝色染色，或同时采用两种方法来确认示踪淋巴结。放射性示踪剂通常在手术前一天注射，随后进行淋巴显像以定位放射性示踪淋巴结。此步骤属于标准操作流程，不包含在荧光成像方案中。</li>
	<li>示踪淋巴结的实时切除操作由荧光信号和淋巴结的蓝色染色共同引导。摄像头的实时成像功能有助于发现残留荧光或荧光淋巴结的意外定位。</li>
	<li>切除示踪淋巴结后，对所有切除的淋巴结进行离体（ex vivo）成像，检测是否存在荧光信号。拍摄静态图像时可延长曝光时间以获得更高分辨率（图4）。</li>
	<li>淋巴结的组织病理学检查可确定示踪淋巴结内是否存在肿瘤细胞。</li>
</ol>
4. 典型结果
荧光淋巴结可被检测到，且具有较高的信噪比。此外，还可通过监测吲哚菁绿（ICG）在淋巴管中的流动，实现淋巴结的实时定位成像。检测结果可能受淋巴结深度增加的影响，可能需要采用不同的照明方案以实现有效检测。未来，应用特异性靶向肿瘤的荧光探针，有望利用该技术在术中实时检出含有癌细胞的阳性前哨淋巴结。
<img src="/files/ftp_upload/2225/2225fig1.jpg" alt="淋巴系统示意图；通过淋巴管识别原发肿瘤和前哨淋巴结。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 前哨淋巴结（SLN）理论。 SLN 是肿瘤淋巴引流的第一站淋巴结。
<img src="/files/ftp_upload/2225/2225fig2.jpg" alt="光学激发装置示意图（CCD、激光）与手术室图像；多通道成像系统。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 多光谱荧光相机系统的示意图（A）。相机系统在手术室中的基本装置（B）。
<img src="/files/ftp_upload/2225/2225fig4.jpg" alt="外科成像技术：用于解剖结构可视化的彩色、荧光及叠加成像方法" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 外阴癌淋巴结的多光谱荧光成像 淋巴结的彩色图像 体内 (A). 同一淋巴结的荧光图像， 体内 （B）伪彩荧光图像与彩色图像叠加（C）。
<img src="/files/ftp_upload/2225/2225fig5.jpg" alt="组织成像：彩色、荧光、叠加；诊断显微镜；荧光标记物的可视化" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 淋巴结的多光谱荧光成像 离体 在宫颈癌中。 淋巴结的彩色图像 离体 (A). 同一淋巴结的荧光图像， 离体 （B）伪彩荧光图像与彩色图像的叠加（C）。

<ol><li>Tinga, D. J., Bouma, J., Aalders, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+squamous+cell+versus+adeno%28squamous%29+carcinoma+of+the+cervix%2C+what+factors+determine+the+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Patients with squamous cell versus adeno(squamous) carcinoma of the cervix, what factors determine the prognosis.</a> Int J Gynecol Cancer. 2 (2), 83-91 (1992).</li>
<li>McMahon, C. J., Rofsky, N. M., Pedrosa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+metastases+from+pelvic+tumors%3A+anatomic+classification%2C+characterization%2C+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic metastases from pelvic tumors: anatomic classification, characterization, and staging.</a> Radiology. 254 (1), 31-46 (2010).</li>
<li>Zivanovic, O., Khoury-Collado, F., Abu-Rustum, N. R., Gemignani, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sentinel+lymph+node+biopsy+in+the+management+of+vulvar+carcinoma%2C+cervical+cancer%2C+and+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Sentinel lymph node biopsy in the management of vulvar carcinoma, cervical cancer, and endometrial cancer.</a> Oncologist. 14 (7), 695-705 (2009).</li>
<li>Fuller, J., Guderian, D., Kohler, C., Schneider, A., Wendt, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+edema+of+the+lower+extremities+after+lymphadenectomy+and+radiotherapy+for+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlenther+Onkol%22%5BJournal%5D)">Lymph edema of the lower extremities after lymphadenectomy and radiotherapy for cervical cancer.</a> Strahlenther Onkol. 184 (4), 206-211 (2008).</li>
<li>Ayhan, A., Celik, H., Dursun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+mapping+and+sentinel+node+biopsy+in+gynecological+cancers%3A+a+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic mapping and sentinel node biopsy in gynecological cancers: a critical review of the literature.</a> World J Surg Oncol. 6, 53-53 (2008).</li>
<li>Tanis, P. J., Nieweg, O. E., Valdes Olmos, R. A., Rutgers, E. J., Kroon, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+sentinel+node+and+validation+of+the+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">History of sentinel node and validation of the technique.</a> Breast Cancer Res. 3 (2), 109-112 (2001).</li>
<li>Ghobashy, A. E. E. l, Saidi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sentinel+lymph+node+sampling+in+gynaecological+cancers%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sentinel lymph node sampling in gynaecological cancers: techniques and clinical applications.</a> Eur J Surg Oncol. 35 (7), 675-685 (2009).</li>
<li>Alford, R., Simpson, H. M., Duberman, J., Hill, G. C., Ogawa, M., Regino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+organic+fluorophores+used+in+molecular+imaging%3A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: literature review.</a> Mol Imaging. 8 (6), 341-354 (2009).</li>
<li>Themelis, G., Yoo, J. S., Soh, K. S., Schulz, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+intraoperative+fluorescence+imaging+system+using+light-absorption+correction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time intraoperative fluorescence imaging system using light-absorption correction.</a> J Biomed Opt. 14 (6), 064012-064012 (2009).</li>
</ol>

VN 和 GMvD 是 SurgOptix 公司科学委员会的成员。在手术前，研究方案已获得当地机构审查委员会（IRB）的批准，并已获取患者的知情同意。

本视频演示了多光谱术中荧光成像技术在妇科肿瘤术中前哨淋巴结（SLN）检测中的应用。该方法相较于传统的SLN手术具有若干优势。注射在手术过程中、患者麻醉状态下进行，而非在手术前一日完成，对患者更为友好，尤其适用于妇科肿瘤患者。此外，术中成像可为外科医生提供淋巴流及其向SLN引流模式的直接视觉反馈，而非通过盖革计数器间接获取。在宫颈癌中，由于淋巴结位于盆腔深部，该技术可能有助于提高检出率。
然而，最重要的意义在于逐步推进的靶向成像方法。靶向荧光对比剂可与肿瘤特异性抗体或特异性作用于肿瘤细胞的底物相融合。通过这种方式，术中荧光成像有望彻底改变目前肿瘤外科手术的临床实践。

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/details.stp?id=2225">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error with an author's name. The author name was corrected to include a first initial as follows:
K. Tim Buddingh
instead of:
Tim Buddingh

A correction to an authors name has been made for the article Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology.

Erratum: Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

<table><tbody><tr><td>吲哚菁绿（ICG）</td><td>Pulsion Medical Systems AG, Munich, Germany</td><td>D-81829</td><td>使用蒸馏水配制的ICG溶液，而非0.9% NaCl溶液。</td></tr><tr><td>专利蓝 / Bleu patent&amp;#233;</td><td>Guerbet</td><td>12322784</td><td></td></tr><tr><td>注射用无菌水</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多光谱荧光相机系统</td><td>德国慕尼黑工业大学生物与医学成像研究所（IBMI）和美国SurgOptix公司</td><td>原型</td><td></td></tr></tbody></table>

妇科肿瘤术中前哨淋巴结多光谱实时荧光成像检测

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

几乎所有实体瘤的预后均取决于是否存在淋巴结转移1-3。外科治疗通常将肿瘤的根治性切除与肿瘤引流区域的完全淋巴结清扫术相结合。然而，淋巴结切除会因感染、伤口裂开和淋巴水肿而导致并发症发生率升高4,5。作为一种替代方法，前哨淋巴结活检术（SLN）在数十年前被开发出来，用于检测肿瘤引流区域的第一个淋巴结6。在发生淋巴道转移的情况下，前哨淋巴结是首个受累的淋巴结（图1）。因此，若前哨淋巴结未发现转移灶，则远端淋巴结也应无肿瘤转移，无需予以切除。前哨淋巴结活检术目前已成为多种肿瘤类型治疗的一部分，如乳腺癌和黑色素瘤，也适用于外阴癌和宫颈癌的治疗7。当前前哨淋巴结检测的标准方法是在术前一日于肿瘤周围注射放射性胶体，并在术中注射染色剂。然而，该方法在宫颈癌和外阴癌中的缺点包括在生殖器区域进行多次注射，从而增加患者的心理负担，以及需要使用放射性胶体。
多光谱荧光成像是近年来发展起来的一种新兴成像技术，可在术中应用，且无需注射放射性胶体。进行术中荧光成像需要两个组成部分：一种荧光剂和一套用于术中成像的定量光学系统。我们采用的荧光染料为吲哚菁绿（ICG）。ICG 已被使用数十年，用于评估心脏功能、脑灌注和肝灌注8。它是一种惰性药物，具有安全的药理学和生物学特性。当以约 750 nm 的光激发时，ICG 会在近红外光谱区约 800 nm 处发射荧光。本研究使用了一套定制的多光谱荧光成像相机系统9。
本视频文章的目的是演示在宫颈癌和外阴癌患者中，使用术中荧光成像技术检测前哨淋巴结（SLN）的方法。荧光成像技术与标准方法联合使用，标准方法包括放射性胶体和蓝色染料。未来，术中荧光成像有望取代现有方法，并可便捷地拓展应用于其他适应证，如乳腺癌和黑色素瘤。

荧光成像是一种在肿瘤外科手术中具有前景的创新性影像引导手术技术。本视频中，我们介绍了在妇科肿瘤学领域应用荧光成像技术检测前哨淋巴结的技术操作流程。该方法采用多光谱荧光相机系统，并结合荧光造影剂吲哚菁绿（indocyanine green）进行实施。

几乎所有实体瘤的预后均取决于是否存在淋巴结转移1-3。外科治疗通常结合根治性……

以下实验的总体目标是在宫颈癌或外阴癌手术过程中检测前哨淋巴结。前哨淋巴结是肿瘤引流区域的第一个淋巴结。在该操作中，将荧光剂吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）与标准蓝色染料共同注射至原发肿瘤周围。溶液将被推送至第一个引流淋巴结。手术室在术前会安装一套定制的术中多光谱荧光相机系统，该系统基于荧光信号实时记录体内淋巴流动过程，并结合体内及离体结果评估荧光信号强度以及传统的蓝色染色检测方法，从而引导外科医生切除前哨淋巴结。与现有方法相比，该技术的主要优势在于其为一步式操作，可在手术过程中同步实现淋巴结的可视化与切除。这一平台技术不仅可为外科医生提供解剖学信息，同时还能提供体内动态实时荧光示踪，从而改进当前外科肿瘤学的理念。为执行本方案，需设置术中多光谱荧光相机，该设备通常为定制化配置。此处所示系统由慕尼黑生物与医学成像研究所开发。在与SEARCHs的密切合作下，采用激光激发荧光探针。相机的滤光片被调节至近红外荧光，激发波长为750纳米，发射波长为800 ± 20纳米。发射光通过光学系统后，将被分离为可见光、固有荧光和近红外荧光。CCD 相机经过校准，可检测独立的光束，从而对所有相机的多光谱信号进行处理，以获得准确的定量荧光四通道生物分布。该系统还可校正伪影。控制台及手术室内显示器可在无菌条件下分别显示彩色图像和荧光信号，也可将两者叠加显示为一幅图像。将荧光造影剂吲哚菁绿（indocyanine green）用无菌蒸馏水配制成浓度为0.5毫克/毫升的溶液。切勿使用生理盐水，因其会导致试剂立即沉淀。为防止光漂白并保持ICG试剂的完整性，应将溶液储存于避光、阴凉处。为尽量减少对标准手术流程的干扰，应在术前于手术室中放置并启动相机系统，并检查与术中使用的高清显示屏的连接情况。按照视频中所示，使用无菌操作技术和条件，用标准无菌手术单覆盖相机。注射荧光剂之前，将摄像头置于患者上方，并暴露目标区域。调整变焦以聚焦摄像头，并关闭手术室内的灯光，以更清晰地检测荧光信号。在原发肿瘤周围的四个象限内，小心注射含有 0.5 毫克/毫升 ICG 与等体积标准蓝色染料的 1 毫升莲花注射器溶液，注意防止 ICG 溢出。若 ICG 污染外科手套，只需在手术过程中更换手套即可。调整摄像头位置，确保持续记录目标区域。采集淋巴流动及荧光示踪淋巴结显影的静态图像或实时视频。曝光时间为180至200毫秒时，可获得质量良好的视频。将所有数据相应保存在计算机中，以供后续分析。使用同步记录的荧光图像作为指导，通过肉眼观察亚甲蓝注射所致的蓝色染色，作为该操作的标准步骤之一。实时切除前哨淋巴结。实时成像有助于检测荧光信号在非预期位置的分布，并依次获取所有切除淋巴结的离体荧光图像。在采集静态图像时，可使用较长的曝光时间。前哨淋巴结将被送检进行组织病理学分析，以确定是否存在肿瘤细胞。本示例展示了使用多光谱荧光成像方案在活体中对阴部癌症患者的前哨淋巴结进行术中检测的强大能力。腹股沟区域的荧光淋巴结在切除前被清晰地可视化。在此段短视频中，我们展示了基于荧光信号对宫颈癌患者前哨淋巴结进行实时检测的过程。本文展示了一例宫颈癌患者淋巴结的离体图像。通过伪彩标度将同一淋巴结的荧光图像叠加于其彩色图像之上，从而获得信噪比高、清晰度好的图像。该技术不仅为外科肿瘤学领域内前哨淋巴结的影像引导切除研究奠定了基础，同时也为实体瘤患者肿瘤边界评估及个体化治疗，以及可能存在局部区域转移的患者提供特异性肿瘤靶向成像的可能性。通过观看本视频，您应对妇科癌症中前哨淋巴结的实时术中荧光成像技术形成清晰的认识。

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