Name: 维持细胞培养基的Wolbachia (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 学习从Anopheles gambiae细胞系中纯化Wolbachia pipientis并在无细胞培养基中培养这种内共生菌的方法。本视频演示了玻璃珠裂解、差速离心和细菌活力检测等关键技术步骤。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在无细胞培养基中维持沃尔巴克氏体

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

在本视频方案中，演示了以下操作步骤：（1）从培养的蚊子细胞中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia）共生菌；（2）利用荧光检测法评估纯化后沃尔巴克氏体的活性；（3）在无细胞培养基中维持这些已处于胞外状态的沃尔巴克氏体。纯化后的沃尔巴克氏体在胞外阶段仍可保持存活，但在重新接种至真核细胞之前不会复制。采用此方法纯化的胞外沃尔巴克氏体在室温下至少可维持一周的活性，可能更久。所获得的纯化沃尔巴克氏体适用于显微注射、DNA提取及其他相关应用。

本视频介绍了一种从冈比亚按蚊细胞系中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia pipientis）的方法，并随后在无细胞培养基中培养该内共生菌。同时演示了检测该细菌活力的实验方法。

在本视频方案中，演示了以下操作步骤：（1）从培养的蚊子细胞中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia）共生菌，（2）利用荧光检测法……

我叫Courtney Ston。我在约翰·霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院Jason Rascon博士的实验室工作。今天我们将从培养的昆虫细胞中进行细菌纯化。实际上，这是一个非常直接的步骤。我们首先收获细胞，然后利用玻璃珠裂解法物理破坏真核宿主细胞的细胞膜。接着，通过差速离心将细菌与宿主细胞碎片分离开来。然后我们采用一系列过滤步骤，进一步去除宿主细胞颗粒，最终仅保留纯化的细菌沉淀。这实际上是主要要求之一。这是一个细胞培养操作台，用于保持所有操作的无菌状态，因为细胞培养非常容易受到污染。我们还需要细胞培养基以及细胞本身，并将它们培养在塑料培养瓶中。此外，还需要直径为3毫米的玻璃珠、50毫升的锥形管，以及一台能够进行高速离心的离心机，大约需要18,000 ×g 的离心力来沉淀细菌，同时也需要能够以约3,000 ×g 或2,500 ×g 离心力沉淀宿主细胞。因此，我们首先要从培养的细胞开始操作。它们已经长好了，对吧？这些是 T75 培养瓶，每瓶中加入了 15 ml 培养基，和我们自己的一样。首先，我们将破坏细胞层，并将其收集到一个 50 ml 离心管中。只需在细胞层上反复刮擦，即可使所有细胞脱离并悬浮于培养基中。待细胞完全进入培养基后，用移液器将细胞悬液转移至 50 ml 无菌锥形离心管中。现在向这两种细胞悬液中加入3毫米的玻璃珠。这些玻璃珠已经过高压灭菌，实际上可以重复使用。使用后可用次氯酸钠溶液清洗并浸泡，然后再次高压灭菌，即可重新使用。倾倒时需注意，不要让玻璃B瓶的瓶口接触到离心管的管口。每个离心管中加入约五毫升刻度线量的玻璃珠。接下来的步骤是通过物理方式破碎酵母细胞，使细菌释放到悬浮液中。因此，我们使用涡旋振荡器，将其调至最高转速，涡旋5分钟。现在，我们将细胞与3毫米玻璃珠一起在涡旋振荡器上处理5分钟，然后用干净的移液枪将上清液转移至一个新的无菌50 mL离心管中。我们将收集新制备的悬液，该悬液包含释放出的细菌以及溶液和完整的细胞碎片。接下来，我们将进行低速离心步骤，以便将大部分物质沉淀下来，而使细菌保留在上清液中。我们将使用离心机，在2,500 ×g 条件下离心10分钟。同时，我们将在4°C条件下进行离心，以利于沉淀物在管底的聚集。然后将其放入此处，确保平衡后关闭，离心10分钟。现在我已经离心了含有宿主细胞碎片以及纯化细菌的上清液，离心条件为2,500 ×g，10分钟。如您所见，我的离心管底部有一个沉淀，其中含有真核细胞碎片。我新释放出的细菌仍存在于上清液中，因为离心力不足以使它们同时沉淀下来。因此，接下来我将移走上清液，并通过一个5微米的滤膜进行过滤。这是一个5 µm的滤器，可适配任意类型的注射器。我即将使用一支30 ml的注射器，首先将活塞向上拉起，然后在不接触滤器本身（尤其是下方这部分）的情况下，确保其保持无菌状态。通过旋转拧紧的方式将注射器与滤器连接，随后轻轻下压活塞，使上清液透过滤器进入收集管中。不要用力过猛，否则可能会压坏滤膜，导致其无法继续使用。如果发现需要施加很大压力才能过滤，就需要取下滤膜并更换新的，因为这表明滤膜已被大量细胞碎片堵塞。此时，根据样本体积，为了获得更纯净的细菌培养物，我们通常会采用另一种附加方法：向高速离心管中加入已过滤除菌的 250 毫摩尔蔗糖溶液。将瓶子装至至少80%满。我们通常会将其装至瓶颈处。这些离心管必须装得如此之满，以防止在高速离心机中发生内爆。现在，我们将把上清液放入高速离心机中，在18,000 ×g条件下离心，以收集纯化后的细菌。因此，我们必须确保离心管已对称平衡放置，然后关闭离心机，设定离心时间为10分钟。我们倾向于在 10 摄氏度或更低的温度下进行此操作，此处已设定相应温度。对于该离心机的特定转子，其角速度为每分钟 12.5 转。我们有转换图表可供参考，因此其离心力约为 18,670 ×g。现在我们已完成高速离心操作，以沉淀纯化后的细菌。现在可以看到，我们的高速离心管底部已经有了一个良好的细菌沉淀。接下来，我们需要将上清液全部移除，并放入液体废液容器中。此时，我们需要重新悬浮我们的细菌。我将用两毫升的培养基重悬菌体，培养基为添加了10%热灭活胎牛血清的Schneider昆虫培养基。通过反复吹打，使菌体沉淀完全重悬于溶液中，直至所有细菌重新进入悬浮状态。现在细菌已重新悬浮，我们将再进行一步纯化操作，以彻底去除任何可能存在的宿主细胞碎片。因此，我们将使用一个2.7微米的滤膜。我喜欢用5微米滤膜的塑料外壳作为支撑架。这样我们可以吸取溶液，将注射器拧到2.7微米滤膜上，然后将滤过的溶液收集到长期保存管中。与使用其他滤器类似，只需轻轻按压推杆即可。现在，我们已获得纯化细菌的溶液。接下来，我将向您展示如何进行活性检测。我们使用 Molecular Probes 公司的背光活死菌活力检测试剂盒。该试剂盒包含两种染料：碘化丙啶和细胞核染料碘化丙啶。碘化丙啶呈红色荧光，仅对细胞膜不完整的细菌进行染色，而细胞核染料可对所有细菌进行染色。因此，当你使用配备荧光光学系统的显微镜观察这些细菌时，所有细菌都会发出绿色荧光，而其中一部分——即死亡的细菌——会发出红色荧光。我们从纯化后的样品中取出少量等分试样，在本例中我将仅取10 µL，足以制作一张载玻片样本即可。然后我将把它分装到另外两个中。然后加入另外两种染料，只需将一微升碘化丙啶和细胞色素的混合物加入细菌悬液中。随后可将样品在避光条件下孵育15分钟。但我们发现，实际上可直接进行封片并立即观察，即可获得实验结果。好的，现在我将使用背光生命-死亡染色法对载玻片上的细菌染色样本进行观察。先将染液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，然后进行观察。我将使用红绿混合滤光片，以便评估细菌的存活率。因此，当我打开快门时，我看到的细菌大致只是微小的光点。但我观察到，大约有90%到95%的细菌呈绿色，而只有大约5%呈红色。这说明我们的细菌存活率非常高，对吧？以上我已为您演示了从培养的昆虫细胞中纯化具有活性的 Akia 的全过程。该方案包括通过物理方法裂解真核宿主细胞，随后采用差速离心法分离纯化细菌，并通过一系列过滤步骤，彻底去除所有宿主细胞组分，以确保所获得细菌的纯度。接着，我们介绍了活/死细菌染色检测法，该方法利用两种染料对细菌的活性进行评估。现在，您可以将纯化后的细菌用于多种实验，包括感染其他培养的细胞系统，以增强对特定系统的感染效果。您也可以利用这些活的纯化细菌进行代谢研究或多种其他研究。

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维持细胞培养基的Wolbachia

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