在无细胞培养基中维持沃尔巴克氏体

我叫Courtney Ston。我在约翰·霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院Jason Rascon博士的实验室工作。今天我们将从培养的昆虫细胞中进行细菌纯化。

实际上，这是一个非常直接的步骤。我们首先收获细胞，然后利用玻璃珠裂解法物理破坏真核宿主细胞的细胞膜。接着，通过差速离心将细菌与宿主细胞碎片分离开来。

然后我们采用一系列过滤步骤，进一步去除宿主细胞颗粒，最终仅保留纯化的细菌沉淀。这实际上是主要要求之一。这是一个细胞培养操作台，用于保持所有操作的无菌状态，因为细胞培养非常容易受到污染。

我们还需要细胞培养基以及细胞本身，并将它们培养在塑料培养瓶中。此外，还需要直径为3毫米的玻璃珠、50毫升的锥形管，以及一台能够进行高速离心的离心机，大约需要18,000 ×g 的离心力来沉淀细菌，同时也需要能够以约3,000 ×g 或2,500 ×g 离心力沉淀宿主细胞。因此，我们首先要从培养的细胞开始操作。

它们已经长好了，对吧？这些是 T75 培养瓶，每瓶中加入了 15 ml 培养基，和我们自己的一样。

首先，我们将破坏细胞层，并将其收集到一个 50 ml 离心管中。只需在细胞层上反复刮擦，即可使所有细胞脱离并悬浮于培养基中。待细胞完全进入培养基后，用移液器将细胞悬液转移至 50 ml 无菌锥形离心管中。

现在向这两种细胞悬液中加入3毫米的玻璃珠。这些玻璃珠已经过高压灭菌，实际上可以重复使用。使用后可用次氯酸钠溶液清洗并浸泡，然后再次高压灭菌，即可重新使用。

倾倒时需注意，不要让玻璃B瓶的瓶口接触到离心管的管口。每个离心管中加入约五毫升刻度线量的玻璃珠。接下来的步骤是通过物理方式破碎酵母细胞，使细菌释放到悬浮液中。

因此，我们使用涡旋振荡器，将其调至最高转速，涡旋5分钟。现在，我们将细胞与3毫米玻璃珠一起在涡旋振荡器上处理5分钟，然后用干净的移液枪将上清液转移至一个新的无菌50 mL离心管中。我们将收集新制备的悬液，该悬液包含释放出的细菌以及溶液和完整的细胞碎片。

接下来，我们将进行低速离心步骤，以便将大部分物质沉淀下来，而使细菌保留在上清液中。我们将使用离心机，在2,500 ×g 条件下离心10分钟。同时，我们将在4°C条件下进行离心，以利于沉淀物在管底的聚集。

然后将其放入此处，确保平衡后关闭，离心10分钟。现在我已经离心了含有宿主细胞碎片以及纯化细菌的上清液，离心条件为2,500 ×g，10分钟。

如您所见，我的离心管底部有一个沉淀，其中含有真核细胞碎片。我新释放出的细菌仍存在于上清液中，因为离心力不足以使它们同时沉淀下来。因此，接下来我将移走上清液，并通过一个5微米的滤膜进行过滤。

这是一个5 µm的滤器，可适配任意类型的注射器。我即将使用一支30 ml的注射器，首先将活塞向上拉起，然后在不接触滤器本身（尤其是下方这部分）的情况下，确保其保持无菌状态。通过旋转拧紧的方式将注射器与滤器连接，随后轻轻下压活塞，使上清液透过滤器进入收集管中。

不要用力过猛，否则可能会压坏滤膜，导致其无法继续使用。如果发现需要施加很大压力才能过滤，就需要取下滤膜并更换新的，因为这表明滤膜已被大量细胞碎片堵塞。此时，根据样本体积，为了获得更纯净的细菌培养物，我们通常会采用另一种附加方法：向高速离心管中加入已过滤除菌的 250 毫摩尔蔗糖溶液。

将瓶子装至至少80%满。我们通常会将其装至瓶颈处。这些离心管必须装得如此之满，以防止在高速离心机中发生内爆。

现在，我们将把上清液放入高速离心机中，在18,000 ×g条件下离心，以收集纯化后的细菌。因此，我们必须确保离心管已对称平衡放置，然后关闭离心机，设定离心时间为10分钟。

我们倾向于在 10 摄氏度或更低的温度下进行此操作，此处已设定相应温度。对于该离心机的特定转子，其角速度为每分钟 12.5 转。我们有转换图表可供参考，因此其离心力约为 18,670 ×g。现在我们已完成高速离心操作，以沉淀纯化后的细菌。

现在可以看到，我们的高速离心管底部已经有了一个良好的细菌沉淀。接下来，我们需要将上清液全部移除，并放入液体废液容器中。此时，我们需要重新悬浮我们的细菌。

我将用两毫升的培养基重悬菌体，培养基为添加了10%热灭活胎牛血清的Schneider昆虫培养基。通过反复吹打，使菌体沉淀完全重悬于溶液中，直至所有细菌重新进入悬浮状态。现在细菌已重新悬浮，我们将再进行一步纯化操作，以彻底去除任何可能存在的宿主细胞碎片。

因此，我们将使用一个2.7微米的滤膜。我喜欢用5微米滤膜的塑料外壳作为支撑架。这样我们可以吸取溶液，将注射器拧到2.7微米滤膜上，然后将滤过的溶液收集到长期保存管中。

与使用其他滤器类似，只需轻轻按压推杆即可。现在，我们已获得纯化细菌的溶液。接下来，我将向您展示如何进行活性检测。

我们使用 Molecular Probes 公司的背光活死菌活力检测试剂盒。该试剂盒包含两种染料：碘化丙啶和细胞核染料碘化丙啶。碘化丙啶呈红色荧光，仅对细胞膜不完整的细菌进行染色，而细胞核染料可对所有细菌进行染色。

因此，当你使用配备荧光光学系统的显微镜观察这些细菌时，所有细菌都会发出绿色荧光，而其中一部分——即死亡的细菌——会发出红色荧光。我们从纯化后的样品中取出少量等分试样，在本例中我将仅取10 µL，足以制作一张载玻片样本即可。然后我将把它分装到另外两个中。

然后加入另外两种染料，只需将一微升碘化丙啶和细胞色素的混合物加入细菌悬液中。随后可将样品在避光条件下孵育15分钟。但我们发现，实际上可直接进行封片并立即观察，即可获得实验结果。

好的，现在我将使用背光生命-死亡染色法对载玻片上的细菌染色样本进行观察。先将染液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，然后进行观察。我将使用红绿混合滤光片，以便评估细菌的存活率。

因此，当我打开快门时，我看到的细菌大致只是微小的光点。但我观察到，大约有90%到95%的细菌呈绿色，而只有大约5%呈红色。这说明我们的细菌存活率非常高，对吧？

以上我已为您演示了从培养的昆虫细胞中纯化具有活性的 Akia 的全过程。该方案包括通过物理方法裂解真核宿主细胞，随后采用差速离心法分离纯化细菌，并通过一系列过滤步骤，彻底去除所有宿主细胞组分，以确保所获得细菌的纯度。接着，我们介绍了活/死细菌染色检测法，该方法利用两种染料对细菌的活性进行评估。

现在，您可以将纯化后的细菌用于多种实验，包括感染其他培养的细胞系统，以增强对特定系统的感染效果。您也可以利用这些活的纯化细菌进行代谢研究或多种其他研究。