Name: 维持细胞培养基的Wolbachia (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 学习从Anopheles gambiae细胞系中纯化Wolbachia pipientis并在无细胞培养基中培养这种内共生菌的方法。本视频演示了玻璃珠裂解、差速离心和细菌活力检测等关键技术步骤。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在无细胞培养基中维持沃尔巴克氏体

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

在本视频方案中，演示了以下操作步骤：（1）从培养的蚊子细胞中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia）共生菌；（2）利用荧光检测法评估纯化后沃尔巴克氏体的活性；（3）在无细胞培养基中维持这些已处于胞外状态的沃尔巴克氏体。纯化后的沃尔巴克氏体在胞外阶段仍可保持存活，但在重新接种至真核细胞之前不会复制。采用此方法纯化的胞外沃尔巴克氏体在室温下至少可维持一周的活性，可能更久。所获得的纯化沃尔巴克氏体适用于显微注射、DNA提取及其他相关应用。

本视频介绍了一种从冈比亚按蚊细胞系中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia pipientis）的方法，并随后在无细胞培养基中培养该内共生菌。同时演示了检测该细菌活力的实验方法。

在本视频方案中，演示了以下操作步骤：（1）从培养的蚊子细胞中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia）共生菌，（2）利用荧光检测法……

我叫Courtney Ston。我在约翰·霍普金斯大学布隆伯格公共卫生学院Jason Rascon博士的实验室工作。今天我们将从培养的昆虫细胞中进行细菌纯化。实际上，这是一个非常直接的步骤。我们首先收获细胞，然后利用玻璃珠裂解法物理破坏真核宿主细胞的细胞膜。接着，通过差速离心将细菌与宿主细胞碎片分离开来。然后我们采用一系列过滤步骤，进一步去除宿主细胞颗粒，最终仅保留纯化的细菌沉淀。这实际上是主要要求之一。这是一个细胞培养操作台，用于保持所有操作的无菌状态，因为细胞培养非常容易受到污染。我们还需要细胞培养基以及细胞本身，并将它们培养在塑料培养瓶中。此外，还需要直径为3毫米的玻璃珠、50毫升的锥形管，以及一台能够进行高速离心的离心机，大约需要18,000 ×g 的离心力来沉淀细菌，同时也需要能够以约3,000 ×g 或2,500 ×g 离心力沉淀宿主细胞。因此，我们首先要从培养的细胞开始操作。它们已经长好了，对吧？这些是 T75 培养瓶，每瓶中加入了 15 ml 培养基，和我们自己的一样。首先，我们将破坏细胞层，并将其收集到一个 50 ml 离心管中。只需在细胞层上反复刮擦，即可使所有细胞脱离并悬浮于培养基中。待细胞完全进入培养基后，用移液器将细胞悬液转移至 50 ml 无菌锥形离心管中。现在向这两种细胞悬液中加入3毫米的玻璃珠。这些玻璃珠已经过高压灭菌，实际上可以重复使用。使用后可用次氯酸钠溶液清洗并浸泡，然后再次高压灭菌，即可重新使用。倾倒时需注意，不要让玻璃B瓶的瓶口接触到离心管的管口。每个离心管中加入约五毫升刻度线量的玻璃珠。接下来的步骤是通过物理方式破碎酵母细胞，使细菌释放到悬浮液中。因此，我们使用涡旋振荡器，将其调至最高转速，涡旋5分钟。现在，我们将细胞与3毫米玻璃珠一起在涡旋振荡器上处理5分钟，然后用干净的移液枪将上清液转移至一个新的无菌50 mL离心管中。我们将收集新制备的悬液，该悬液包含释放出的细菌以及溶液和完整的细胞碎片。接下来，我们将进行低速离心步骤，以便将大部分物质沉淀下来，而使细菌保留在上清液中。我们将使用离心机，在2,500 ×g 条件下离心10分钟。同时，我们将在4°C条件下进行离心，以利于沉淀物在管底的聚集。然后将其放入此处，确保平衡后关闭，离心10分钟。现在我已经离心了含有宿主细胞碎片以及纯化细菌的上清液，离心条件为2,500 ×g，10分钟。如您所见，我的离心管底部有一个沉淀，其中含有真核细胞碎片。我新释放出的细菌仍存在于上清液中，因为离心力不足以使它们同时沉淀下来。因此，接下来我将移走上清液，并通过一个5微米的滤膜进行过滤。这是一个5 µm的滤器，可适配任意类型的注射器。我即将使用一支30 ml的注射器，首先将活塞向上拉起，然后在不接触滤器本身（尤其是下方这部分）的情况下，确保其保持无菌状态。通过旋转拧紧的方式将注射器与滤器

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维持细胞培养基的Wolbachia

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