无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

本实验的总体目标是使用完全型无血清替代物、无饲养层培养基，将人诱导性多能干细胞适应并维持在无饲养层的培养条件下。该过程首先需准备明胶、TRX包被或CellStart包被的培养板。实验的第二步是利用disc space将IPS细胞从MEF饲养层转移至无饲养层培养基中进行传代。

该实验流程的最后一步是持续以无饲养层条件培养你的诱导多能干细胞（IPS细胞）。最终，可通过多能性标志物的免疫染色获得结果，显示与甲基纤维素培养体系中相似的细胞生长状态和干性特征。大家好，我是来自Life Technologies公司GIBCO网站的Kate Wagner。

与现有技术相比，该技术的主要优势在于在整个工作流程中使用敲除型血清替代物（knockout serum replacement）可节省时间并提高细胞培养的一致性。目前，敲除型产品系列包含适用于人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的饲养层依赖、无饲养层以及无异源条件下的全套培养基和试剂。KSR 可用于细胞系的建立、生长、扩增、冻存以及分化的初始步骤。

以下视频将向您展示如何在无饲养层条件下，使用KSR对细胞进行适应和包装。在制备包被培养皿的前一天，需要准备好经Gel TRX包被的培养皿。在前一晚将一管Gel TRX置于冰箱中过夜，缓慢解冻。次日，将解冻后的Gel TRX用基础培养基按1:100的比例稀释，即将1毫升Gel TRX转移至含有99毫升基础培养基的瓶子中。轻轻混匀该溶液。

我们推荐使用Knockout DMEM/F12作为基础培养基，但请参见实验方案正文中的其他选择。用Gel Rex溶液覆盖每个培养皿的整个表面。对于每个60毫米的培养皿，加入1.5毫升的Gel Trek溶液。

将培养皿在 37 摄氏度下孵育 1 小时。额外的平板可用封口膜包裹后置于冰箱中，保存时间最长可达 4 周。额外稀释的 gelt TRX 可分装后在 -20 至 -80 摄氏度保存，但在使用前应避免反复冻融。

将包被有 gelt TRX 的培养皿转移至超净台或层流罩中，并使其平衡至室温。同时，准备好所有其他所需试剂，并确保所有培养基均已平衡至 37 摄氏度并适当充气。为使人源 IPCs 适应无饲养层培养基的首次培养。

诱导多能干细胞（IPSC）在饲养层细胞上培养，直至其融合度达到70%至80%。从每个60毫米的培养皿中吸除培养基，并加入适量的消化液（dispase溶液），用量为1毫升。随后，将培养皿置于37°C条件下孵育3至5分钟。

吸出每块培养皿中的 dispa 溶液，用 DPBS 轻轻冲洗甲醇饲养细胞 2 至 3 次。接着，向每块培养皿中加入适量的完全血清替代培养基。使用细胞刮棒，轻轻将细胞从培养皿表面刮下。

将每皿的细胞悬液收集至单独的15毫升锥形管中。用适量的完全无血清替代培养基冲洗每个培养皿，并将冲洗液加入含有细胞悬液的15毫升锥形管中，随后在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。

离心后，小心吸除并弃去上清液，切勿扰动细胞沉淀。轻轻弹击离心管，使细胞沉淀完全从管底脱落。根据所需的传代比例，加入适量的完全血清替代物、无饲养层培养基。

轻轻重悬沉淀物。不要将细胞团块分散成更小的团块，因为较小的团块不易良好贴附于表面。吸除先前制备的凝胶Rex包被培养皿中残留的凝胶TRE溶液，并缓慢向每个培养皿中加入适量的细胞悬液。

将培养皿前后、左右反复移动数次，使细胞在皿表面均匀分散。轻轻将培养皿放入37摄氏度、含4%至6% CO2的湿化空气培养箱中。此后每天更换培养液，直至细胞融合度达到约70%至80%。

当在完全无血清、无饲养层培养基中培养的人诱导性多能干细胞达到 70% 至 80% 汇合度时，即可进行传代。若存在任何已分化细胞，应在传代前将其去除。使用移液器吸去 60 毫米培养皿中的废弃培养基，并用缓冲液清洗细胞两次。

用预热的 DPBS 轻轻加入一毫升基于圆盘的预热溶液至培养皿中。轻轻摇晃培养皿，使溶液覆盖整个细胞表面。将培养物置于 37 °C 下孵育 3 至 5 分钟。

接下来，吸除消化液，用DPBS轻柔地洗涤细胞两次，加入完全血清替代物、无饲养层培养基，然后轻轻刮下培养皿表面的细胞。使用细胞刮刀将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。用完全血清替代物冲洗培养皿两次。

用无饲养层培养基轻轻冲洗未脱落的细胞。将两次冲洗的培养基连同细胞一并收集至15毫升离心管中。在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞形成沉淀，注意不要扰动细胞沉淀。

小心吸出并弃去上清液。轻轻弹动离心管，使细胞沉淀完全从管底脱落。用完全血清替代物轻柔重悬细胞。

使用5毫升血清移液管将细胞悬液转移至新鲜的60毫米gelt TRX包被培养皿中，按所需传代比例进行接种。切勿滴定。

将培养皿前后、左右反复移动数次，使细胞在其表面分散均匀。次日，将培养皿置于37摄氏度、含4%至6%二氧化碳的湿化空气培养箱中。轻柔地用完全血清替代物替换用过的培养基。

更换无饲养层的完全培养基以去除细胞碎片。此后每天更换一次用过的培养基。此相差图像显示了在经gelt TRX包被的培养皿上，使用完全血清替代物、无饲养层培养基培养的人诱导性多能干细胞。

胰岛前体细胞（IPC）的形态与人类胚胎干细胞相似，表现为细胞核较大、细胞质较少。免疫染色显示，在添加生长因子混合物的敲除血清替代培养基中培养的IPC表达了多能性标志物OCT4和SSEA4。观看本视频后，您应充分了解如何在敲除血清替代、无饲养层的条件下适应和维持您的IPC培养。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。