免费接驳适应，文化和传代使用完整的基因敲除血清替代馈线中的人类iPS细胞

以下协议提供馈线自由的文化，使用完整的基因敲除血清替代馈线培养基（KSR - FF）为适应人类诱导多能干细胞（iPS）细胞的指令。一旦适应，也提供了不断维护的说明。

该程序的总体目标是使用完全敲除血清替代物、无饲养层培养基来适应和维持人诱导的多能干细胞适应无饲养层培养。这是通过首先制备凝胶、TRX 包被或细胞起始包被板来实现的。该程序的第二步是利用椎间盘空间将 IPS 从 MEF 传代到无饲养层培养基中。

该程序的最后一步是持续保持 IPS 细胞饲养层的空闲状态。最终，通过使用多能标记物进行免疫染色，可以获得显示与冰毒培养物相似的细胞生长和干性的结果。大家好，我是 Life Technologies GIB 联合站点的 Kate Wagner。

与现有技术相比，该技术的主要优点是，当您在整个工作流程中使用基因敲除血清替代物时，您可以节省时间并提高细胞培养的一致性。如今，基因敲除产品系列包括用于人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞和诱导多能干细胞的饲养层、无饲养层和无异种成分条件的培养基和试剂的完整清单。KSR 可用于衍生生长、扩增、冻存和分化的初始步骤。

以下视频将向您展示在无饲养层条件下使用 KSR 调整和包装细胞。在制备这些包被培养皿的前一天，需要凝胶 TRX 包被培养皿在无饲养层条件下适应和包装人诱导多能干细胞，第二天将一管 gelt TRX 放在冰箱中过夜，缓慢解冻一管 gelt TRX，通过将 1 毫升凝胶 Rex 转移到含有 99 毫升基础培养基的瓶子中，将解冻 gelt TRX 管稀释 1 至 100中等。轻轻混合溶液。

我们建议使用 knockout D-M-E-M-F 12 作为基础培养基，但有关其他选项，请参阅实验方案文本。用凝胶 Rex 溶液覆盖每个培养皿的整个表面。对于每个 60 毫米培养皿，添加 1.5 毫升凝胶 trek 溶液。

将培养皿在 37 摄氏度下孵育 1 小时。额外的盘子可以用香水包裹并在冰箱中存放长达 4 周。可以分配额外的稀释凝胶 TRX 并在零下 20 至零下 80 摄氏度下储存，但使用前应避免多次冻融循环。

将 gelt TRX 涂层培养皿转移到柠檬或流动罩中，让它们平衡至室温。此外，准备所有其他必需的试剂，并确保所有培养基平衡至 37 摄氏度并适当充气。使人 IPC 适应无饲养层培养基 First culture。

IPSC 在冰毒饲养细胞上，直到它们达到 70% 至 80% 汇合。从每个 60 毫米培养皿中吸出培养基，并加入适量的 dispa 溶液，即 1 毫升。在这种情况下，将培养皿在 37 摄氏度下孵育 3 到 5 分钟。

从每个培养皿中吸出 dispa 溶液，并用 DPBS 轻轻洗去冰毒饲养细胞 2 到 3 次。接下来，向每个培养皿中加入适量的完全血清替代培养基。使用细胞刮刀，轻轻地从培养皿表面刮下细胞。

将每个培养皿中的细胞悬液收集到单独的 15 ml 锥形管中。用适量的完全血清替代培养基冲洗每个培养皿，并将冲洗培养基加入含有细胞悬浮离心机的 15 ml 锥形管中。将 15 mL 锥形管在 200 G 下室温下沉淀 5 分钟，以沉淀细胞。

离心后，小心吸出并丢弃上自然子，而不会干扰细胞沉淀。轻轻轻弹试管，使细胞沉淀从试管底部完全脱落。根据所需的分流比加入适量的完全血清替代物、无饲养层培养基。

然后轻轻地重悬沉淀。不要将细胞团块打碎成较小的尺寸，因为较小的团块不能很好地附着在表面上。从先前制备的凝胶 Rex 包被的培养皿中吸出任何残留的凝胶 TRE 溶液，并向每个培养皿中缓慢加入适量的细胞悬液。

来回和左右移动培养皿数次，以将细胞分散在培养皿的表面上。轻轻地将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中，空气湿度为 4% 至 6% CO2。此后每天更换用过的培养基，直到细胞达到大约 70% 至 80% 汇合。

当人诱导的多能干细胞生长出完全的血清替代物、无饲养层培养基 70% 至 80% 汇合时，它们就可以进行传代培养了。如果有任何分化的细胞，请在包装前将其去除。使用移液管从 60 毫米培养皿中吸出用过的培养基，并冲洗细胞两次。

使用 DPBS，向培养皿中轻轻加入 1 毫升基于预热圆盘的溶液。旋转培养皿以包被整个细胞表面。将培养物在 37 摄氏度下孵育 3 到 5 分钟。

接下来，吸出 dis space 溶液，用 DPBS 轻轻洗涤细胞两次，加入完全血清替代物、无饲养层培养基，然后轻轻地从培养皿表面刮下细胞。使用细胞刮刀，将细胞转移到无菌的 15 ml 离心管中。用完全血清替代物冲洗培养皿两次。

无饲养层培养基，轻轻喷洒掉任何未脱落的细胞。从两个冲洗液中取出培养基，并将细胞放入 15 ml 试管中。在室温下以 200 G 离心试管 5 分钟，以沉淀细胞而不干扰细胞沉淀。

小心吸出并丢弃上清液。轻轻轻弹试管，使细胞沉淀从试管底部完全脱落。轻轻重悬细胞以完全替代血清。

使用 5 mL 血清移液管的无饲养层培养基。不要三速。将细胞以所需的分流比转移到新鲜的 60 mm 凝胶 TRX 包被培养皿中。

来回和左右移动培养皿数次，以将细胞分散在其表面。第二天，将培养皿置于 37 摄氏度的培养箱中，空气中二氧化碳的加湿环境为 4% 至 6%。用完全血清替代物轻轻替换用过的培养基。

补料游离培养基以去除细胞碎片。此后每天更换用过的培养基。该相差图像显示了使用完全血清替代、无饲养层培养基在 gelt TRX 包被培养皿上生长的人诱导多能干细胞。

IPC 表现出类似于人胚胎干细胞的形态，其特征是细胞核大且细胞质免疫染色稀少，表明用敲除血清替代培养基和生长因子混合物培养的 IPC 表达多能标志物 OCT 4 和 SSEA 4。观看此视频后，您应该对如何适应和维持 IPC 和敲除血清替代物、无饲养层条件有很好的了解。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。