Cryopreserving和恢复人类iPS细胞血清替代馈线中使用完整的基因敲除
2010年7月15日
这一协议描述为cryopreserving淘汰赛SR冻存介质的人类iPS细胞，这些细胞恢复完整的基因敲除SR直属免费（KSR - FF）介质或进纸器为基础的基因敲除的SR介质的详细过程。
该程序的总体目标是在基于饲养层或无饲养层的培养条件下冻存和回收 IPS 细胞。这是通过首先像往常一样开始打包 IPC 来实现的。该程序的第二步是将细胞转移到无血清冻存培养基中。
该程序的第三步是像往常一样冷冻保存。该程序的最后一步是解冻细胞并开始维护。最终，可以获得结果，表明 IPS 细胞在无血清冻存培养基中通过健康的形态和解冻后的恢复成功冻融。
大家好，我是 Life Technologies GCO 现场的 Kate Wagner。该协议的视觉演示至关重要，因为 IPC 对冻结和 T 精细非常敏感。使该方案更简单的是，敲除血清替代物可以用于您的整个工作流程。
如今，KSR 系列产品包括用于胚胎干细胞和诱导多能干细胞的基于饲养层的无补料和无异种成分培养的培养基和试剂的完整清单。KSR 可用于衍生生长、冷冻保存、扩增和分化的最初初始步骤。以下视频将向您展示在 Peter Free 机器中使用 KSR 解冻和冻结自己。
开始此过程。首先在适量的完全无饲养层培养基中加热至 37 摄氏度，在水浴中吸出用过的培养基，这是一个 60 毫米的培养皿。在这种情况下，用 DPBS 冲洗人诱导的多能干细胞两次。
然后在盘中加入 1 毫升 dispa。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。之后，吸出 dispa 溶液并用 DPBS 轻轻洗涤细胞。
接下来，添加完全无饲养层培养基以覆盖培养皿，并使用细胞刮刀轻轻刮擦细胞转移细胞到无菌 15 mL 离心管中。用完全补液的游离培养基冲洗培养皿，轻轻喷洒掉任何未分离的细胞。将冲洗液转移到含有细胞的同一 15 ml 试管中。
用培养基再次冲洗培养皿，并在室温下以 1000 RPM 离心 3 分钟，拉出带有细胞沉淀的冲洗液和细胞沉淀细胞。离心后，小心吸出并丢弃上清液，不要干扰细胞沉淀。轻轻弹动试管，使细胞沉淀从试管底部完全脱落。
然后加入 1 毫升冷冻培养基 A，使用 5 mL 血清学移液管，轻轻上下移液重悬细胞。在均匀的团块悬浮液之后，以逐滴方式向试管中加入 1 毫升冷冻培养基 B，同时轻轻旋转细胞悬液以混合。将 1 毫升细胞悬液分配到每个低温中，在零下 80 摄氏度下在异丙醇室中冷冻细胞过夜。
第二天，将小瓶细胞转移到液氮罐中进行长期储存。将冷冻的细胞瓶置于 37 摄氏度的水浴中约 3 到 4 分钟，直到冻存液瓶中只剩下一小块冷冻细胞，从而快速解冻。从水浴中取出样品瓶后，用 70% 异丙醇喷雾进行消毒，然后使用 5 毫升移液器将样品瓶中的全部内容物无菌转移到 15 毫升锥形管中。
下一步可能是手术中最困难的方面。必须缓慢、小心地将无饲养层培养基添加到细胞中。为了减少渗透压休克：向 15 mL 锥形管中的细胞中缓慢滴加 4 mL 完全无饲养层培养基。
添加培养基时，轻轻地来回移动试管以混合细胞。这将减少对细胞的渗透压休克。完全无饲养层培养基可以用含有甲基条件培养基的敲除血清替代培养基或用于饲养层的敲除血清替代培养基代替，请参阅实验方案文本了解培养基制备说明。
加入所有 4 mL 培养基后，在室温下以 1000 RPM 离心细胞 5 分钟。离心后，小心吸出并丢弃 sane 而不干扰细胞沉淀。将细胞沉淀轻轻重悬于 4 mL 完全无饲养层培养基中。
使用 5 毫升移液器，将细胞悬液轻轻滴加到凝胶卡车包被的 60 毫米培养皿中。将培养皿置于 36 至 38 摄氏度的培养箱中，空气中二氧化碳的加湿气氛为 4% 至 6%。小心地以北到南、东到西的模式旋转培养皿，以均匀分布细胞。
解冻后 24 小时。用新鲜培养基更换培养皿中的培养基。此后每天更换用过的培养基，直到细胞达到大约 70% 至 80% 的汇合度。
该对比图像显示了使用完全血清替代物、无饲养层培养基在 gelt TRX 包被培养皿上生长的人诱导多能干细胞。IPC 表现出类似于人类胚胎干细胞的形态，其特征是细胞核大和细胞质稀少。解冻和敲除血清替代后细胞的示例。
gelt TrackX 上的无饲养层培养基如下所示。执行此程序时，请务必记住保持所有细胞集落大小相同。冷冻保存时，这可以提高细胞回收率。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本协议概述了使用KnockOut SR冷冻保存培养基进行人类诱导多能干细胞（iPS）冷冻保存的程序，以及在完全KnockOut SR无饲养细胞（KSR-FF）培养基或基于饲养细胞的KnockOut SR培养基中恢复它们的步骤。由于iPS细胞在冷冻和解冻过程中的敏感性，该方法强调了视觉演示的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 干细胞研究
- 冷冻保存技术
背景
- 人类iPS细胞对冷冻和解冻过程敏感。
- KnockOut SR产品促进干细胞培养的各个阶段。
- 适当的冷冻保存对于维持细胞活力至关重要。
- 无饲养细胞和基于饲养细胞的培养条件可用于iPS细胞。
研究目的
- 提供一种可靠的iPS细胞冷冻保存协议。
- 确保解冻后细胞的成功恢复。
- 展示整个工作流程中KSR产品的使用。
所用方法
- 为冷冻保存准备iPS细胞。
- 使用无血清冷冻培养基进行细胞保存。
- 在-80摄氏度下进行冷冻保存，然后在液氮中存储。
- 在完全无饲养细胞培养基中解冻和重新悬浮细胞。
主要结果
- 通过健康的形态证明了iPS细胞的成功冷冻和解冻。
- 细胞在无饲养细胞和基于饲养细胞的条件下均保持了活力和生长。
- 通过视觉评估细胞恢复确认了协议的有效性。
- 保持细胞集落大小的均匀性提高了恢复率。
结论
- 该协议提供了一种系统的iPS细胞冷冻保存方法。
- KnockOut SR产品在整个过程中有效维持细胞健康。
- 视觉演示增强了对协议的理解和执行。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
