Name: Cryopreserving和恢复人类iPS细胞血清替代馈线中使用完整的基因敲除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用KnockOut SR无血清冻存液对人类诱导多能干细胞进行冷冻保存与复苏的技术方法。该方案涵盖细胞准备、冻存、液氮储存及复苏后培养等关键步骤，确保细胞存活率与形态完整性。

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注意：为保持无菌培养条件，本方案中的所有操作均需采用无菌实验室技术，并在超净工作台内进行。
开始之前，确保所有培养基已平衡至37°C并适当充气。
制备Geltrex包被的培养皿
注意：有关 CELLstart 包被培养皿的使用，请参见附录。
<ol>
 <li>在 2-8°C 条件下缓慢解冻一管 Geltrex（1 mL），并用 99 mL Knockout D-MEM/F-12 以 1:100 的比例稀释。轻轻混匀溶液。 
 
 注意：某些 iPS 细胞系可能需要不同的 Geltrex 稀释比例以获得最佳生长效果。替代稀释比例请参见附录。</li>
 <li>用 Geltrex 溶液覆盖每块培养皿的整个表面（35 mm 培养皿使用 1 mL，60 mm 培养皿使用 1.5 mL）。</li>
 <li>用封口膜密封每块培养皿以防止干燥，并在 37°C 下孵育 1 小时。 
 
 注意：此时可将 Geltrex 包被的培养皿密封后于 4°C 保存最多 1 个月。请用封口膜密封每块培养皿，以防止 Geltrex 干燥。</li>
 <li>使用前，将 Geltrex 包被的培养皿转移至超净工作台，并使其平衡至室温（约 1 小时）。</li>
</ol>
配制完全 KnockOut SR 无饲养层培养基
<ol>
 <li> 配制1 mL浓度为10 μg/mL的碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）溶液时，无菌混合下表所列组分。分装溶液，于-20°C保存，可稳定长达6个月。 
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>碱性成纤维细胞生长因子</td>
 <td>10 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>990μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% BSA</td>
 <td>10 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 注意：BSA 可以在相同浓度下用 HSA 或 Knockout SR 替代。</li>
 <li>配制50 mL浓度为2 mg/mL的Dispase溶液，无菌混合下表所列组分。过滤除菌后，4°C保存，可使用长达2周。
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>100 mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>50 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>无菌条件下，将下表所列组分混合，制备 100 mL 完全型无饲养层KnockOut SR（KSR-FF）。 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>储存浓度</td>
 <td>终浓度</td>
 <td>体积 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Knockout DMEM/F12（货号：12660-012）</td>
 <td>-</td>
 <td>1X</td>
 <td>76.8 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GlutaMAX™-I（货号：35050-061）</td>
 <td>200 mM</td>
 <td>2 mM</td>
 <td>1 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR（货号：10828-028）</td>
 <td>-</td>
 <td>20%</td>
 <td>20 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR-GFC（货号：A10580-01）</td>
 <td>50X</td>
 <td>1X</td>
 <td>2 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF（货号：PHG0024）</td>
 <td>10 μg/mL</td>
 <td>20 ng/mL</td>
 <td>200 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 KSR-FF 培养基可在 2–8°C 下保存最多一周。</li>
 <li>在将完全培养基预平衡至相应温度和气体环境之前，无菌地 加入所需体积的2-巯基乙醇 （55 mM 储存浓度）以达到 0.1 mM 的终浓度。例如，配制 100 mL KSR-FF 培养基时，加入 182 μL 的 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）。或者，可将 2-巯基乙醇直接加入已配制好的 1× 完全培养基中，于 2–8°C 保存，最多可稳定一周。</li>
</ol>
配制冷冻/冻存培养基
冷冻保存培养基由两种培养基组成：冷冻培养基A和冷冻培养基B。它们需在不同时间加入细胞，且必须保持分离。每种培养基各占所需冷冻保存培养基总体积的50%。每个待冻存的冻存管需要1 mL的冷冻保存培养基总体积。一个汇合度为90%的60 mm培养皿的hESC可用于在冷冻保存培养基中建立2个冻存管的细胞库。
配制足量的每种冷冻培养基，额外多准备2-5 mL，以确保有足够的余量。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>冻存液 A（终体积的 50%）：</td>
 <td>50% DMEM/F12</td>
 <td>50% KSR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>冻存液 B（终体积的 50%）：</td>
 <td>80% DMEM/F12</td>
 <td>20% DMSO</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
示例：
如果要冻存20管细胞，您将需要20 mL冻存液。额外加入4 mL作为损耗补偿，总共需要24 mL冻存液。这意味着您需要12 mL冻存液A（24 mL的50%）和12 mL冻存液B（24 mL的50%）。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>冻存液 A (12 mL)：</td>
 <td>6 mL DMEM/F12</td>
 <td>6 mL KSR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>冻存液 B (12 mL)：</td>
 <td>9.6 mL DMEM/F12</td>
 <td>2.4 mL DMSO</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
冷冻保存液的最终成分为65% DMEM/F12、25% KSR和10% DMSO。
iPSC 的冷冻保存
<ol>
 <li>将所需体积的 Dispase 置于 37 °C 水浴中预热。所需体积的详细信息请参见下表 1。</li>
 <li>将所需体积的 KSR-FF 置于 37 °C 水浴中预平衡 15 分钟。所需体积的详细信息请参见下表 1。</li>
 <li>使用移液器吸除培养容器中的废弃培养基，并用 D-PBS 清洗细胞两次。</li>
 <li>向培养容器中轻柔加入预热的 Dispase 溶液（例如，每 60 mm 培养皿加入 1 mL Dispase 溶液）。轻轻摇晃培养容器，使溶液覆盖整个细胞表面。</li>
 <li>将培养容器在 37 °C 条件下孵育 3 分钟。</li>
 <li>从培养箱中取出容器，吸除 Dispase 溶液，并用 D-PBS 轻柔清洗细胞。</li>
 <li>使用细胞刮棒轻柔地将细胞从培养皿表面刮下，并将细胞转移至无菌的 15 mL 离心管中。</li>
 <li>用 KSR-FF 对培养皿清洗两次，轻柔“冲下”未脱落的细胞。将清洗液与离心管中的细胞合并。</li>
 <li>在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并弃去上清。</li>
 <li>准备足量的冻存管。一旦细胞与 DMSO 接触，应在 2–3 分钟内完成分装和冷冻。</li>
 <li>轻弹离心管，使细胞沉淀完全脱离管底，并用 Freezing Medium A 重悬细胞［使用 5 mL 血清移液器轻柔吹打混匀］。待细胞团块均匀悬浮后，逐滴加入等体积的 Freezing Medium B，同时轻柔摇晃细胞悬液以混匀。 
 
 注意：此时细胞已接触 DMSO，操作必须迅速高效。一旦细胞与 DMSO 接触，应在 2–3 分钟内完成分装和冷冻。</li>
 <li>将 1 mL 细胞悬液分装至每个冻存管中。</li>
 <li>迅速将冻存管放入 Mr. Frosty 冻存盒［以实现快速冷冻］，并转移至 -80 °C 过夜。</li>
 <li>在 -80 °C 过夜保存后，将细胞转移至液氮罐中进行长期保存。</li>
</ol>
iPSC 冻存管解冻与细胞复苏
注意：KSR-FF 可替换为含 KSR 的 MEF 条件培养基，或用于饲养层的含 KSR 培养基。有关培养基制备说明，请参见附录。
在50 mL离心管中预热10 mL KSR-FF培养基。
<ol>
 <li>将适量的Geltrex包被培养皿平衡至室温，并在接种细胞前吸除培养皿中的任何液体。</li>
 <li>小心地从液氮储存罐中取出人胚胎干细胞（或诱导多能干细胞）冻存管。</li>
 <li>在37°C水浴中快速融化冻存管中的细胞，直至管内仅剩少量冰晶。</li>
 <li>用70%异丙醇喷洒冻存管表面以消毒，并将其转移至无菌细胞培养超净台中。</li>
 <li>使用5 mL移液器，在无菌条件下将冻存管内的全部内容物转移至15 mL锥形离心管中。</li>
 <li>用1 mL KSR-FF冲洗冻存管，并将冲洗液加入15 mL离心管中。</li>
 <li>缓慢地以逐滴方式向15 mL锥形离心管中的细胞悬液加入4 mL KSR-FF。在添加培养基的同时，轻轻前后晃动离心管以混匀细胞。（此举可减少细胞的渗透压冲击。）</li>
 <li>将含有细胞悬液的15 mL离心管在室温下以1000 rpm（200 × g）离心2分钟。</li>
 <li>小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动管底的细胞沉淀。</li>
 <li>使用5 mL移液器将细胞沉淀重悬于预热的KSR-FF培养基中（例如，每60 mm培养皿使用4 mL），并轻轻吹打细胞，直至细胞沉淀完全分散。预期细胞活力应高于70%；然而，若细胞活力低于70%，则细胞达到汇合所需时间可能更长。</li>
 <li>使用同一支移液器，将细胞悬液逐滴加入已平衡至室温的Geltrex包被培养皿中。</li>
 <li>将培养皿置于37°C、含4%至6% CO2的湿化培养箱中。轻轻以南北、东西方向摇晃培养容器，使细胞均匀分布。</li>
 <li>复苏后24小时进行轻柔换液，之后每日换液一次，以清除细胞碎片并提供新鲜营养，直至培养皿中细胞汇合度达到约70–80%。如需继续培养和传代您的iPS细胞，请参考我们题为“使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基进行人iPS细胞的无饲养层培养与传代”的实验方案。</li>
</ol>
预期结果
细胞在冷冻保存前应达到约70-80%的融合度。Dispase消化会导致菌落边缘卷曲和折叠。收集细胞后，将其以小细胞团的形式悬浮于冻存培养基中进行冷冻。待冻存管解冻后，细胞会以小细胞团的形式恢复并贴附于预先包被的培养皿上。细胞生长迅速，5-6天内即可达到完全融合状态。
表1 - 推荐体积
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>35 mm 培养皿</td>
 <td>60 mm 培养皿</td>
 <td>100 mm 培养皿</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>完全 KnockOut SR 培养基</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Geltrex 溶液</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1.5 mL</td>
 <td>4–5 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>3–4 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>用于洗涤的 D-PBS</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">点击此处查看附录</a>。

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

本文作者受雇于 Life Technologies，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

<table><tbody><tr><td>敲除DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>注：有关替代 DMEM 产品 GlutaMAX-I（货号 35050-061）的使用，请参见附录</td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物生长因子混合物</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic，人重组蛋白，10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>注：替代的bFGF包装规格参见附录。</td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>注：替代的传代方法见附录</td></tr><tr><td>Geltrex hESC认证低生长因子基底膜基质，1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS）</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，500 mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>无菌组织培养罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃培养箱&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃水浴&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌刻度吸管（5 mL，10 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养处理培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮储存罐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇冻存容器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 冻存管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用完全型knockout血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人ips细胞

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

2006年发现人类和小鼠成纤维细胞可被重编程以生成诱导多能干细胞（iPS细胞）1-3，其特性与胚胎干细胞极为相似，这一发现为药物研发、细胞治疗和基础研究提供了宝贵的新型多能细胞来源。
多年来，GIBCO 培养基和试剂一直处于多能干细胞研究的前沿。添加 Knockout 血清替代物的 Knockout DMEM 是胚胎干细胞生长以及当前诱导多能干细胞（iPS 细胞）培养的首选培养基3-9。通过添加 Knockout SR 生长因子混合物，这一黄金标准培养基系统现在可用于无饲养层培养。
传统的人类胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）培养方法需要使用小鼠或人类成纤维细胞饲养层，或饲养层条件培养基。这些培养方法耗时耗力，难以扩大规模，且由于培养条件未明确定义，难以维持hiPS细胞的未分化状态。Invitrogen开发了Knockout SR生长因子混合物，可帮助您轻松将hiPS和hES细胞培养转为无饲养层体系，同时继续使用Knockout SR培养基。

本方案详细描述了使用KnockOut SR冻存液对人iPS细胞进行低温冻存，并在完全KnockOut SR无饲养层（KSR-FF）培养基或含饲养层的KnockOut SR培养基中复苏这些细胞的实验步骤。

使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

2006年发现，人和小鼠的成纤维细胞可被重编程生成诱导性多能干细胞（iPS细胞）¹⁻³，其特性与胚胎干细胞极为相似……

本实验的总体目标是在饲养层依赖或无饲养层的培养条件下，对诱导多能干细胞（IPS细胞）进行冷冻保存和复苏。首先，按照常规方法开始对IPS细胞进行包装。实验的第二步是将细胞转移至无血清冷冻保存培养基中。该操作流程的第三步是按照常规方法进行细胞冻存。流程的最后一步是复苏细胞并开始常规培养。最终可获得相关结果，通过冻融后细胞健康的形态学特征和良好的复苏状态，证明在无血清冻存液中成功实现了诱导多能干细胞（IPS细胞）的冷冻与复苏。大家好，我是 Life Technologies 公司 GCO 站点的 Kate Wagner。本实验方案的可视化演示至关重要，因为诱导性多能干细胞（IPCs）对冻存和温度变化（T 细节）非常敏感。本方案的便利之处在于，您可以在整个操作流程中使用无血清替代物（knockout serum replacement）。目前，KSR 系列产品包含一系列完整的培养基和试剂，可用于饲养层依赖、无饲养层及无异源成分培养您的胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。KSR 可用于细胞系建立、生长、冷冻保存、扩增以及分化的最初步骤。以下视频将向您展示如何使用 KSR 在无菌操作台中进行细胞的冻存与复苏操作。开始此操作时，首先将适量的完全无饲养层培养基在水浴中预热至37摄氏度，然后从培养容器（本例中为60毫米培养皿）中吸除用过的培养基，并用DPBS冲洗人诱导多能干细胞两次。然后向培养皿中加入1毫升dispa。将培养皿在37摄氏度下孵育3分钟。随后吸除dispa溶液，并用DPBS轻轻洗涤细胞。接着，加入完全无饲养层培养基覆盖培养皿，并使用细胞刮轻轻刮取细胞，将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。用完全无饲养层培养基冲洗培养皿，轻轻喷洗未脱落的细胞。将冲洗液转移至含有细胞的同一15毫升离心管中。用培养基再次冲洗培养皿，并将冲洗液与细胞一同在室温下以1000 RPM离心3分钟，使细胞形成沉淀。离心后，小心吸除并弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。轻轻弹击离心管管底，使细胞沉淀完全悬浮。 然后使用5 mL血清学移液管加入1 mL冻存液A，通过轻轻吹打使细胞重悬。待细胞团块均匀悬浮后，以滴加方式向离心管中加入1 mL冻存液B，同时轻轻旋转细胞悬液以混匀。将1 mL细胞悬液分装至每个冻存管中，在异丙醇 chamber 中于-80°C过夜冷冻细胞。次日，将细胞冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。将冻存的细胞管放入37摄氏度水浴中，快速解冻约三到四分钟，直至管内仅剩微小冰块。从水浴中取出冻存管后，用70%异丙醇喷洒以消毒，然后使用5毫升移液器将管内全部内容物无菌转移至15毫升锥形管中。下一步可能是该操作过程中最困难的部分。必须缓慢而小心地将无饲养层培养基加入细胞中。为减少渗透压冲击，需将4毫升完全无饲养层培养基逐滴缓慢加入15毫升锥形管中的细胞内。加入培养基时，轻轻前后移动离心管以混匀细胞，以减少细胞的渗透压冲击。完全无饲养层培养基可替换为含甲硫氨酸条件培养基的敲除血清替代物培养基，或含敲除血清替代物的饲养层用培养基；具体培养基制备方法请参见实验方案文本。加入全部四毫升培养基后，在室温下以1000转/分钟离心五分钟。离心后，小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞沉淀轻轻重悬于四毫升完全型无饲养层培养基中。使用5 mL移液管，将细胞悬液逐滴轻柔地加入已包被明胶的60 mm培养皿中。将培养皿置于36至38°C、含4%至6%二氧化碳的湿润空气培养箱中。轻轻以南北、东西方向摇晃培养皿，使细胞均匀分布。解冻后24小时。将培养皿中的培养基更换为新鲜培养基。此后每天更换一次用过的培养基，直至细胞融合度达到约70%至80%。此对比图像显示了在涂有Gelt TRX的培养皿中，使用完全血清替代物、无饲养层培养基培养的人诱导性多能干细胞。这些诱导性多能干细胞表现出类似于人胚胎干细胞的形态特征，具有较大的细胞核和较少的细胞质。图中展示了细胞解冻后及使用knockout血清替代物的培养示例。此处显示的是在 gelt TrackX 上的无饲养层培养基。按照本实验步骤操作时，需注意保持所有细胞克隆大小一致。在进行冷冻保存时，这有助于提高细胞复苏效率。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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本研究提供了一种高效冻存人干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的详细方案。...

人类胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在最佳阶段的冷冻保存

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。...

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

学习使用KnockOut SR无血清冻存液对人类诱导多能干细胞进行冷冻保存与复苏的技术方法。该方案涵盖细胞准备、冻存、液氮储存及复苏后培养等关键步骤，确保细胞存活率与形态完整性。

使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

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