Name: 归纳和慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的临床评分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 48 s
Description: 学习在DA大鼠中诱导和临床评分慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该动物模型模拟多发性硬化症，通过免疫脊髓组织与佐剂混合物建立，并使用标准化评分系统评估疾病进展。

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慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与监测
乳剂是将水溶液中的抗原与添加了补充物的完全弗氏佐剂按1:1比例混合而成。必须将抗原加入佐剂中，而不能反向操作！！！
制备和注射乳剂时会存在较多损耗。务必准备超出实际需求量1.5至2倍的量。
使用已灭菌的研钵、研杵、玻璃注射器和桥状工具。所有塑料制品应为无菌。该操作可在普通实验台上进行。
1.&nbsp;补充佐剂的制备
称取 30 mg 的 结核分枝杆菌 （Difco 目录号 #231141）放入研钵中，研磨成细粉，注意不要用力过猛，以免破坏细菌。加入 10 ml 完全弗氏佐剂 H37Ra（Difco 目录号 #231131），混匀。此添加后的佐剂现含有 4 mg/ml 结核分枝杆菌转移至离心管中。
2. 脊髓匀浆的制备
取DA大鼠（年龄和性别不限）的脊髓，于-80°C冷冻保存。称取冷冻脊髓，确保有足够的量与添加佐剂按1:1（重量:体积）的比例混合。用剃刀将脊髓尽可能切碎，转移至第1节中使用的研钵中，用研杵研磨成糊状。
3.&nbsp;乳液的制备
<ol>
<li>将添加佐剂的完全弗氏佐剂放入试管中，高速涡旋振荡。在持续涡旋的同时，逐滴加入脊髓匀浆液。当全部脊髓匀浆液加完后，继续涡旋5分钟。混合物应变为淡粉色。 </li>
<li>将乳剂装入一支5 ml玻璃注射器中，并使用18G连接桥（Fisher目录号# 14-825-17L）连接另一支5 ml玻璃注射器。将乳剂在两支注射器之间反复推注，直至乳剂变稠（5–10分钟）。若制备的乳剂量超过5 ml，应使用多个5 ml注射器，切勿使用更大容量的注射器。 </li>
<li>乳剂可在注射器中于4°C保存3周。建议至少提前12小时制备，以检查其是否发生分层。乳剂应保持浓稠状态，不分离为两相。颜色将在过夜后变为浅黄色或米色。</li>
</ol>
4.&nbsp;大鼠的免疫
<ol>
<li>将乳剂在注射器中混合几分钟后，转移至用于注射的注射器中。使用23G针头和3 ml鲁尔锁型注射器，在短效麻醉下，于尾根部皮下注射200 µl。 </li>
<li>受体为7–9周龄的雌性DA大鼠。我们的大鼠购自Harlan-Sprague Dawley。 </li>
<li>应每天观察大鼠两次，并每日称重。注射乳剂后7–15天内可能出现临床症状。 </li>
</ol>
临床评分：
0：无疾病
0.5：尾部远端松弛
1：尾巴无力
2：轻度截瘫，共济失调
3：轻度截瘫，大鼠偶尔会绊倒
3.5：一只后肢瘫痪，另一只后肢可以活动
4：完全性后肢瘫痪
5：完全性后肢瘫痪及大小便失禁
6：濒死状态，呼吸困难，不进食也不饮水。应立即实施安乐死。

CB 和 KGC 是 Airmid 公司的联合创始人及顾问。

本方案有几个重要的注意事项。
DA 大鼠的遗传背景会因购买的供应商不同而略有差异。这些差异可能增加或降低大鼠对 EAE 诱导的易感性。如果您的大鼠对 EAE 更为易感，您可以通过使用未添加佐剂的完全弗氏佐剂，甚至不完全弗氏佐剂，来降低免疫强度。您也可以考虑减少注射乳剂的用量，或在制备乳剂前用生理盐水稀释脊髓匀浆。如果使用全效免疫乳剂后大鼠仍未出现 EAE 的临床症状，请检查饲养环境的清洁程度。感染寄生虫（如蛲虫）的大鼠将不会发生 EAE。您可以考虑在更洁净的条件下饲养动物，例如使用高压灭菌的笼具并配备滤帽，并自由提供酸化水（酸化水的制备方案附后）。
乳剂必须是水包油型，以便佐剂中的油能够完全包裹住逐滴加入的抗原。相反方式制备的乳剂（油包水型）虽然也会变得很粘稠，但不会引起脑炎反应。
如果大鼠已适应操作者，它们通常是温顺的动物，因此在注射致脑炎性乳剂前，每天温和地接触它们是一个很好的做法。这将减少大鼠的应激反应和咬伤风险。
<p class="jove_co...

<table><tbody><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;rsquo;佐剂</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF 311-360-5</td><td>由 Difco 生产</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF3114-33-8</td><td>由 Difco 生产</td></tr><tr><td>DA 大鼠</td><td>动物</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>雌性，7–9 周龄。</td></tr><tr><td>5 ml玻璃注射器</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-10 B</td><td></td></tr><tr><td>金属桥 - 18G</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-17L</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 鲁尔锁塑料注射器</td><td>工具</td><td>BD 生物科学</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>针头 - 20G 1 1/2</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5C</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）慢性炎症性疾病，多发于青壮年。其特征是在脑和脊髓中广泛分布的脱髓鞘区域及胶质细胞瘢痕形成。这些病灶会改变神经传导功能，导致不同程度的神经功能障碍，具体症状取决于中枢神经系统内脱髓鞘斑块的位置（例如轻瘫、瘫痪、失明、尿失禁）。
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症（MS）的一种动物模型。EAE最初在人类中意外诱发，当时使用在兔脊髓上培养的病毒接种狂犬病疫苗，其中残留的脊髓组织与灭活病毒一同注射，从而引发了中枢神经系统疾病。基于这些观察，Rivers和Schwenther于1935年首次报道了用中枢神经系统匀浆免疫非人灵长类动物所建立的EAE模型。此后，EAE已在多种物种中成功建立，其病程表现因物种/品系及所使用的免疫原性抗原不同而有所差异。例如，用髓鞘碱性蛋白与佐剂乳化后免疫Lewis大鼠，可诱导出EAE的急性模型；而相同抗原在豚鼠中则引起慢性疾病。
本文所述的EAE模型是通过将DA大鼠脊髓在完全弗氏佐剂乳液中免疫DA大鼠而诱导产生的。免疫后7-14天内，大鼠会出现上升性弛缓性瘫痪。临床症状在数周内表现为复发-缓解病程。病理学显示中枢神经系统内存在大量免疫细胞浸润以及脱髓鞘斑块。视频末尾描述了EAE动物护理的特殊注意事项。

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。

多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）慢性炎症性疾病，多发于青壮年。其特征是……

我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的几天里，我将向您展示如何在DA大鼠中诱导并监测慢性复发性EAE，即实验性自身免疫性脑脊髓炎。这是一种多发性硬化症的动物模型，或者更准确地说，是多发性硬化症的动物模型之一。该模型的特征是动物出现进行性上升性弛缓性瘫痪，并具有与人类疾病相似的组织学特征。因此，该实验过程将需要数天时间。首先，我将向您展示如何使用完全弗氏佐剂中的幼稚型红色脊髓匀浆制备基因乳剂。第二天，我将向您演示如何用UCAE对大鼠进行免疫接种，随后我们需等待7至15天，以观察这些动物中首次出现的临床症状。在此之后，我将向您展示不同动物中EAE疾病进展的各个阶段。首先，我将介绍制备乳剂所需的所有试剂和材料。我所使用的是完全弗氏佐剂 H 37 Ra，但尽管其中已含有结核分枝杆菌，我仍会额外添加干燥的结核分枝杆菌 H 37 Ra，使其终浓度达到每毫升 4 毫克。为了制备这种干燥细菌，我需要将其放入研钵中，用研杵研磨成细粉。完成后，我将把这些细菌加入佐剂中。此时佐剂已经准备好。下一步是制备我的抗原。我将取出保存在零下80摄氏度的D大鼠脊髓组织，为了保持其充分冷冻状态，我会将它们放置在盛有干冰的称量皿中，并逐一取出，使用普通的剃须刀片将脊髓组织切碎至称量皿中。接下来，我将把添加了补充成分的佐剂放入漩涡振荡器中。在振荡的同时，我会将脊髓组织逐少量地加入佐剂中。待所有脊髓组织与佐剂在漩涡振荡器中充分混合后，继续振荡五分钟，随后将配制好的乳化液转移至五支玻璃注射器中。我们将使用一个16 G的连接管将两个5 mL的玻璃注射器连接起来，并通过该连接管尽可能快速地将乳液从一个注射器推入另一个注射器。几分钟后，当乳液开始变稠时，我们将更换为更细的连接管，即18 G，这会使乳液变得更加粘稠。随后，将连接好该细管的注射器用铝箔包裹，置于冰箱中过夜。我已经在称量纸上称取了30毫克结核分枝杆菌，并将其转移至研钵中。接着使用研杵将细菌聚集体研磨成细粉。但使用研杵时不要用力过猛，以免破坏细菌。在实验开始时，当细菌聚集在一起，呈黄褐色。如果你研磨得足够细，最终会得到白色粉末，这正是所需的结果，但切忌用力过重而导致细菌破裂。完成上述操作后，我取了10 mL的完全转移佐剂，并确保所有细菌均处于悬浮状态。我已打开该样品，将全部10 mL完全转移佐剂倒入研钵中，覆盖在已分散的结核分枝杆菌上。接下来，我将把添加了细菌的完全转移佐剂转移至一个50 mL离心管中。现在，我将添加了补充成分的完全佐剂转移至离心管中。此时，细菌会沉淀在液体底部，我将尽量将其全部转移至管内。即使有少量残留在研钵中也无妨，因为接下来我将不清洗该研钵，直接用于制备脊髓乳剂。这是脊髓组织，它们被保存在零下80摄氏度的环境中。我称取了10克组织，

induction-clinical-scoring-chronic-relapsing-experimental-autoimmune

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

归纳和慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的临床评分

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。...

从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

学习在DA大鼠中诱导和临床评分慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法。该动物模型模拟多发性硬化症，通过免疫脊髓组织与佐剂混合物建立，并使用标准化评分系统评估疾病进展。

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

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