慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

我是Christine Beaton。我是加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。在接下来的几天里，我将向您展示如何在DA大鼠中诱导并监测慢性复发性EAE，即实验性自身免疫性脑脊髓炎。

这是一种多发性硬化症的动物模型，或者更准确地说，是多发性硬化症的动物模型之一。该模型的特征是动物出现进行性上升性弛缓性瘫痪，并具有与人类疾病相似的组织学特征。因此，该实验过程将需要数天时间。

首先，我将向您展示如何使用完全弗氏佐剂中的幼稚型红色脊髓匀浆制备基因乳剂。第二天，我将向您演示如何用UCAE对大鼠进行免疫接种，随后我们需等待7至15天，以观察这些动物中首次出现的临床症状。在此之后，我将向您展示不同动物中EAE疾病进展的各个阶段。首先，我将介绍制备乳剂所需的所有试剂和材料。

我所使用的是完全弗氏佐剂 H 37 Ra，但尽管其中已含有结核分枝杆菌，我仍会额外添加干燥的结核分枝杆菌 H 37 Ra，使其终浓度达到每毫升 4 毫克。为了制备这种干燥细菌，我需要将其放入研钵中，用研杵研磨成细粉。完成后，我将把这些细菌加入佐剂中。

此时佐剂已经准备好。下一步是制备我的抗原。我将取出保存在零下80摄氏度的D大鼠脊髓组织，为了保持其充分冷冻状态，我会将它们放置在盛有干冰的称量皿中，并逐一取出，使用普通的剃须刀片将脊髓组织切碎至称量皿中。

接下来，我将把添加了补充成分的佐剂放入漩涡振荡器中。在振荡的同时，我会将脊髓组织逐少量地加入佐剂中。待所有脊髓组织与佐剂在漩涡振荡器中充分混合后，继续振荡五分钟，随后将配制好的乳化液转移至五支玻璃注射器中。

我们将使用一个16 G的连接管将两个5 mL的玻璃注射器连接起来，并通过该连接管尽可能快速地将乳液从一个注射器推入另一个注射器。几分钟后，当乳液开始变稠时，我们将更换为更细的连接管，即18 G，这会使乳液变得更加粘稠。随后，将连接好该细管的注射器用铝箔包裹，置于冰箱中过夜。

我已经在称量纸上称取了30毫克结核分枝杆菌，并将其转移至研钵中。接着使用研杵将细菌聚集体研磨成细粉。

但使用研杵时不要用力过猛，以免破坏细菌。在实验开始时，当细菌聚集在一起，呈黄褐色。如果你研磨得足够细，最终会得到白色粉末，这正是所需的结果，但切忌用力过重而导致细菌破裂。

完成上述操作后，我取了10 mL的完全转移佐剂，并确保所有细菌均处于悬浮状态。我已打开该样品，将全部10 mL完全转移佐剂倒入研钵中，覆盖在已分散的结核分枝杆菌上。接下来，我将把添加了细菌的完全转移佐剂转移至一个50 mL离心管中。

现在，我将添加了补充成分的完全佐剂转移至离心管中。此时，细菌会沉淀在液体底部，我将尽量将其全部转移至管内。即使有少量残留在研钵中也无妨，因为接下来我将不清洗该研钵，直接用于制备脊髓乳剂。

这是脊髓组织，它们被保存在零下80摄氏度的环境中。我称取了10克组织，加入到10毫升的补充佐剂中。

因此，在尽可能保持这些脊髓组织冷冻状态的同时，我将使用剃刀在称重皿中将其切碎至非常细小的碎片。为了将这些脊髓组织充分切碎，你需要准备两把剃刀和一个称重皿。具体操作时，我取出一条脊髓，放入称重皿中开始切割。我会用手盖住称重皿，因为组织处于冷冻状态，质地较硬，切割过程中容易弹跳；同时，较大的组织块会首先被切下，而组织会迅速开始解冻，并粘附在剃刀的侧面。

因此，我使用另一把剃须刀片将其取下，并尽可能快速而细致地进行切碎，以防止其融化，因为一旦融化就很难再进行切割。因此，必须将脊髓彻底且非常精细地切碎，切得越细，浸润就越均匀，大鼠发病的情况就越一致，疾病表现也越均一。因此，将所有这些脊髓充分、彻底地切碎至关重要。

现在，我将继续以完全相同的方式切碎每一条脊髓，直到处理完全部10克脊髓组织。接下来，我将把脊髓组织在研钵中稍微混合一下，以确保收集到之前添加佐剂后仍残留在研钵中的所有结核分枝杆菌。下一步，我将把含有佐剂的混合物置于涡旋振荡器上。

在持续尽可能快速涡旋的同时，我将把我的脊髓匀浆逐滴加入此佐剂中。现在，我已将添加了成分的佐剂置于涡旋振荡器上，接下来将开始逐步加入我的脊髓组织匀浆。之所以要将抗原（A）非常缓慢地加入佐剂，是因为我们正在制备水包油型乳剂。

因此，佐剂主要是矿物油，而抗原是等体积的溶液。我们需要将抗原非常缓慢地加入油中，以便每次加入时油都能完全包裹抗原。如果一次性加入，油将无法完全包裹抗原。

现在，我已将全部的脊髓匀浆加入到涡旋振荡器上的佐剂中，并将试管固定在涡旋振荡器上，继续搅拌五分钟，以确保所有成分充分混匀。我调节转速，使涡旋达到尽可能高的速度，同时避免液体过多溅到管壁上。现在额外的五分钟涡旋已经结束，我将停止涡旋振荡，并将乳化后的混合物转移至玻璃注射器中。

我已经组装好完整的注射器。将其连接到直径较大的连接桥一端，而在连接桥的另一端，我只安装了一个注射器的筒身，现在我将把乳液加入该注射器中。现在，不行。

现在，我将把所有液体吸入下方的注射器中，断开上方的注射器，完成上方注射器的组装，并确保下方注射器和连接桥中没有气泡。接下来，我将重新连接两者。现在，两个注射器已通过这个连接桥连接在一起。

一个充满液体，另一个为空。现在我要尽可能快速地将一个注射器中的液体来回推入另一个注射器。接下来，我将把大直径的连接桥换成更细的，即18 G的连接桥。

较小的连接管会使乳液变得更稠。因此，在更换连接管时，我先将所有乳液收集到一个注射器中，取下空的注射器，确保连接管中没有液体损失，然后拆下旧连接管，装上新的连接管，排出所有气泡，再重新接上另一个注射器。

我重复该操作，此时乳液更难通过，因此我需小心避免破坏这一非常脆弱的液桥。只要试管中还有乳液，我就继续使用另一组注射器重复此操作。因此，我会根据需要使用尽可能多的注射器，直至耗尽全部乳液。

现在我已经将乳剂混合了数次，可能是10次或15次，但具体次数会因不同批次而有所变化。目前乳剂已经变得极难通过。我将再进行几次混合，或者，也许不再继续了。

现在非常卡住了，所以我先保持这样。否则，有损坏注射器或桥管的风险。因此，当它无法继续通过时，如果这种情况发生得很早，可能意味着桥管堵塞了。

但此时，由于我已经至少混合了10到15次，说明乳液已经制备完成。它非常浓稠，因此我应静置不动。现在我将用铝箔纸将其包裹起来，并放入冰箱过夜。

昨天，我们用红色的脊髓制备了乳剂，并将乳剂在冰箱中放置过夜。今天，我们将其取出，准备在大鼠尾根部每只注射200 µL。但在注射之前，我们必须确保乳剂状态良好。

因此它应该仍然是固态的，并且仍然是质地良好的固体。此处看到的裂纹甚至告诉我们，这是一个质地良好的固体，没有发生相分离，即没有分成两相，否则情况会不理想。所以该乳剂可以正常使用。

因此，每个兔笼将接种200 µL的乳剂。注射时我们使用3 mL的注射器，但必须确保选用鲁尔锁头式注射器，因为如果使用普通滑动式注射器，由于乳剂非常黏稠，在注射过程中针头可能会弹出。

因此，应始终使用鲁尔锁型注射器。至于针头，我们尽量选用尽可能细的针头，但由于乳剂较为黏稠，必须使用20号针头。由于需要在尾部基部进行非常精确的注射，我们会将大鼠麻醉几分钟，并利用其处于深度睡眠状态的时机对其进行标记。

我们使用耳缘打孔法，每只大鼠通过打孔的特定模式进行个体识别。现在我们准备对大鼠进行注射，每只大鼠在尾根部注射 200 µL 乳剂，同时进行耳标标记。我每次仅准备一只大鼠所需乳剂并装入注射器，因为注射过程通常较为困难，需要施加较大力度，为避免向一只大鼠注入过量乳剂，我采取逐只配制的方式。

因此，我每次只填充一胡的注射器。填充时，将塑料注射器连接到桥接装置上，该桥接装置已连接装有乳剂的玻璃注射器。我在塑料注射器中注入约 300 µL 的乳剂。

然后连接针头，将针头内的空气排出，以避免针头中残留的50微升空间造成损失。确保针筒内恰好保留200微升，随后将其注射到大鼠尾部基部。现在我们已完成所有心脏的注射，接下来将对其进行每日监测。

因此，我们将每天早晨对它们进行称重，并每日两次检查EAE的临床症状。最初的体征，正如我稍后展示的那样，将表现为尾巴无力下垂。我们预计，首批大鼠在注射后大约第7天到第8天开始出现这些症状。大多数大鼠将在第10至第12天左右发病，最晚的大鼠则在第15至第17天左右发病。

现在是我们用脊髓乳剂对动物进行免疫后的第13天，接下来我将监测这些动物以评估其临床评分。但在进行之前，让我先介绍一下我们饲养动物的方式。自身免疫性疾病具有这样一个特点：动物体内存在的任何病原体都会降低自身免疫反应。

为了最大限度地避免这种情况，我们将在特定条件下饲养大鼠。这些大鼠被安置在隔离小间内，小间内含有经过滤的空气，并处于正压环境；动物本身则饲养在经过高压灭菌的笼具中。因此，在放入大鼠之前，笼具内的所有物品均经过高压灭菌处理。

笼子上方设有过滤膜。食物为标准的啮齿类动物饲料，由我方提供。

我们还为大鼠提供酸化水。按照标准操作规程，我们在普通饮用水中添加盐酸，制备酸化水，以将肠道菌群维持在最低水平，从而降低干扰自身免疫反应的风险。现在，我已准备好对大鼠进行临床评分。

评分范围从0分到6分，0分表示无临床症状，6分表示濒死状态，此时需对动物实施安乐死。接下来，我将逐步为您展示在该模型中可能出现的每种临床评分的具体示例。目前我们处于大鼠经UCAE免疫后的第13天。

在这个笼子里有两只尚未生病的大鼠，它们完全没有表现出任何临床症状，因此两只大鼠目前仍然健康。

它们四处跑动，当移动时，会将尾巴从垫料中抬起。正如您所见，有时它们会让尾巴晾干，但大多数情况下会尝试将尾巴抬离垫料。如果有机会，它们还会爬出笼子，这表明它们能够完全控制四肢，并且在需要时可以站立起来。

因此，EA 的第一个临床症状是尾巴无力。例如，当我抓起一只大鼠并用手指按压其尾巴时，正常大鼠通常会用尾巴尖产生抓握反应。正如您刚才所见，这只大鼠没有无力的尾巴，我也可以用另一只来演示。

尾巴抓住了手指，这意味着这些大鼠具有完全反应性的尾巴。它们的临床评分为零，即实际上完全没有症状。这是一只临床评分为0.5的大鼠。

因此，如果你仅仅在笼子中观察它，它的行为完全正常，会四处跑动，会攀爬笼壁，但尾巴尖始终无法离开垫料。因此，这只大鼠可能存在部分性尾部肢体功能障碍。此时，我会抓住大鼠并进行相同的测试，尽管其尾巴具有一定的张力，但尾端无法完全缠绕在我的手指上。

因此，我将给这只大鼠评分为1.5分，表现为部分性尾部无力。临床评分为1分的特征是完全性尾松软，即尾部没有任何肌张力，但大鼠仍能正常使用后肢。正如您所见，这只大鼠正依靠笼壁站立，表明其后肢功能正常。

但如果我通过抓起这些大鼠来检查它们的尾巴，会发现它们的尾巴完全没有张力。另一个你可以进行的测试是：当大鼠位于笼子底部时，如果你用正常的力度提起它的尾巴，尾巴会缓慢下落，或者可能甚至不会触及地面，此时评分为1分。如果你提起尾巴，它会立即迅速垂落到地面。

这只实验动物四肢均可活动，但后肢力量过弱，无法支撑其站立。因此，我将该实验动物的临床评分定为2分。1分与2分的主要区别在于，1分仅表现为尾巴无力下垂。

后肢功能完全正常，评分为3分的大鼠会向一侧倾倒。2分为中间状态，即大鼠可以使用其后肢，但后肢力量远弱于正常大鼠。因此，该大鼠具有EAE的一种异常特征。

通常，EAE表现为一种进行性上升性弛缓性瘫痪，但在某些较为罕见的情况下（如此例所示），大鼠会先出现前肢瘫痪，随后才发生后肢瘫痪。这只大鼠即属于此种情况。因此，如果你仔细观察，会发现它的头部位置低于身体其他部分，因为其右侧前肢活动困难，无法攀爬至笼壁上方。

尽管它的后肢运动正常，但前肢无法用力推动。因此，我仍然会将这只大鼠评分为2分，对应轻度瘫痪，尽管我们通常在该品系中观察到的是后肢症状，而此处却表现为四肢受累。因此，该品系的表型比之前的品系更为严重。

其临床评分为3分。正如我将向您展示的，该动物的前肢功能完全正常，但两条后肢存在中度瘫痪。因此，实验动物可以利用两条后肢移动，但会向一侧倾倒，且无法完全控制这些腿部。

这些孢子的活力与未使用EE的情况相比明显减弱。到了这一阶段，我们不再关注尾巴的无力状态，因为许多大鼠过一段时间后尾巴会变得非常僵硬。这只大鼠的尾巴仍然非常无力，但有时你也能观察到一些肌张力障碍的表现，即尾巴开始出现不协调的运动。

因此，在这个评估层级，我们不再观察尾巴，而仅关注肢体的功能。我们将其评分定为3.5分，因为观察其后肢时可见一侧后肢能够活动，但另一侧则完全瘫痪，完全无法协助身体向前移动。这种情况被视为单侧后肢完全瘫痪，因此评分为3.5分。

这只大鼠的临床评分为4分，意味着完全性后肢瘫痪，表现为后肢完全无法活动。本笼中的大鼠临床评分为5分，对应于完全性后肢瘫痪并伴有额外的大小便失禁。该动物存在失禁情况，正如我们所见，该区域完全失去重量，而在其他未失禁的动物中则不会出现此现象。

当我们的溶血性尿毒综合征（HUS）大鼠评分达到三分或以上时，我们会为其提供带有长吸管的水瓶，以确保它们能够喝到水。同时，我们还会将食物放在笼子底部，并提供凝胶补给包。尽管采取了上述所有措施，但每次我们每天两次将大鼠取出进行监测时，仍会常规提供水，以防它们在白天未能摄入足够的水分。

这里有一只临床评分为4分的大鼠。在这个阶段，这些动物需要稍加鼓励才能进食。因此，我会将它们的食物弄湿，这样它们咀嚼起来会容易得多。

在过去两周中，我向您展示了如何在DA大鼠中诱导并监测慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。第一步，我向您演示了如何制备脊髓匀浆，然后如何将其注射到大鼠尾根部。今天，我向您展示了如何根据疾病的不同程度对这些大鼠进行评分。

当然，这是一种慢性复发模型，因此我们预计大鼠的评分将出现波动。疾病将在数天内进入缓解期，并随时间推移而复发。部分大鼠将进入更为慢性化的疾病阶段。

这会因动物而异。现在，在结束本视频之前，我想强调一下在这些模型中进行药物测试的一个重要问题：最关键的一点是尽可能对动物进行随机分组。

一个非常重要的注意事项是，动物发病越早，其病情就越严重。因此，你不应将所有对照组动物都集中在第一天处理，而将处理组动物安排在接下来的几天。我们的做法是，一旦动物发病并到达我们希望开始治疗的时间点，就立即将这些动物随机分配到两个不同的组别中。

例如，如果我们有一个对照组和一个处理组，第一个心脏将放入对照组，第二个放入处理组，依此类推，直到所有动物都被分配到各自的组别中。但我们确保这种随机化在实验方案的早期就尽快完成。希望本视频对您有所帮助，使您能够在中国台湾 D 型大鼠中成功诱导并监测慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。

祝您的实验顺利。