大规模基于斑马鱼的体内小分子筛选

以下实验的总体目标是发现能够特异性调控胚胎发育和生理关键环节的小分子。该目标通过将大量受精卵放入96孔筛选板中来实现，这是第二步操作。接下来，将小分子文库的等分试样加入到96孔板中的胚胎内。

通过培养板检测小分子诱导的表型。获得的结果可显示哪些小分子特异性地影响超级鱼的发育或生理。您好，我是范德堡大学医学院的 Charles Hong。

在我们的实验室中，我们使用斑马鱼胚胎进行高通量化学筛选。这是一种相对简单且可广泛适用的技术，可用于发现新的生物活性化合物。在进行化学筛选的前一天下午，设置 10 至 20 个斑马鱼繁殖缸。

在每个水箱中放入一个隔离板，使用渔网从水产养殖系统中取水，并将一条成年雄鱼和一至两条成年雌鱼转移到内层容器中。在每个繁殖水箱上做好标签，并在筛选当天早晨加盖。移除繁殖水箱中的隔离板，使斑马鱼进行交配。

在接下来的一个小时内，让受精卵通过每个内容器底部的网格落下。一小时后，将成年斑马鱼送回永久性储存水箱。

取出内层容器，通过塑料茶漏将每个繁殖罐中的水过滤，收集卵。将漏勺倒置在培养皿上方，轻轻冲洗漏勺，使卵冲入培养皿中。使用含有E3培养基的洗瓶，去除所有呈不透明状的未受精卵。

使用一次性塑料移液管，每次交配杂交应获得约 200 个胚胎。然后用玻璃巴斯德移液管将约五个胚胎转移至含有 E3 培养基的 96 孔板的每个孔中。一旦胚胎被排列至 96 孔板上。

使用12通道移液器尽可能吸出孔中的E three培养基，注意不要刺破胚胎。使用12通道移液器加入250微升E three培养基。

尽快向每个孔中加入含有 0.5 微克/毫升卡那霉素的培养基，以防止胚胎干燥。将 96 孔板放入 28.5 °C 的培养箱中，直至胚胎发育至需要添加化合物的阶段。在本方案中，我们寻找干扰早期胚胎模式形成的化合物，因此将胚胎孵育 3 小时，或直至超过 90% 的胚胎达到 1000 细胞期，此时通常提供小分子文库。

在96孔源板中，每种化合物以DMSO配制成10毫摩尔的储备液。在胚胎达到所需阶段前约60分钟，取出含有小分子化合物分装液的适当数量的96孔板进行解冻。记录源板的序列号或其他识别编号，以尽量减少板上的冷凝现象。将板放入含有干燥剂的干燥 chamber 中。

将微孔板放入配备多孔板转子的台式离心机中短暂离心。使用12通道移液器从源板上移除铝制封膜，并用DMSO将源板中的化合物稀释至所需浓度。在本方案中，我们使用0.5毫摩尔的终浓度，向10毫摩尔的储备板中加入4.75微升DMSO进行稀释。

当96孔板中的胚胎发育至所需阶段时，使用12通道移液器将2.5 µL化合物从源板转移至含有胚胎的受体板中。用盖子盖好现含有胚胎和化合物的板，并在胚胎板上记录源板的编号。轻轻摇晃混匀各孔溶液，随后将板置于28.5 °C培养箱中。

将含有未使用小分子的每个源板用铝箔封口膜覆盖并用胶带密封，然后置于负80摄氏度冰箱中长期保存。在进行视觉筛选之前，需制定明确的命中标准。例如，在针对四个脑区发育小分子抑制剂的筛选中，命中化合物可能是导致前脑缺失的化合物。

缺乏眼睛是前脑缺失的一个易于观察的视觉指标，无需荧光检测即可在发育的特定时间点进行评估。从培养箱中取出含有化合物处理胚胎的96孔板，在筛选影响前脑发育的小分子抑制剂时，使用体视显微镜在28小时时间点检查每个孔中是否出现眼睛缺失，以此作为前脑发育受抑制的标志。记录下任何至少有五个胚胎中三个表现出规定的眼缺失表型的孔板编号及孔位信息，并将该96孔板放回培养箱中继续培养。

在48小时时重新确认眼睛和前脑的缺失情况。尽管胚胎将无前脑，但其至少可存活至四天。通过在多个剂量下重复测试化合物的作用，以重新确认潜在的阳性结果；每个剂量测试10个胚胎，置于含0.5毫升E3培养基的48孔板中进行。

重新测试时，化合物添加的时间应与原始筛选时完全相同。当化合物在重新测试中以剂量依赖性方式重现所诱导的表型时，即可确认为高诱导性（HIIT）。最后，从化学文库的小分子数据库中鉴定出hi化合物。

利用基于斑马鱼的可视化化学筛选，我们发现了一种小分子 Hedgehog 信号通路抑制剂，其作用依据是影响胚胎体轴发育。该图像显示了暴露于 Hedgehog 抑制剂的胚胎，其尾部出现明显的腹侧弯曲。在 24 小时观察的同一胚胎，至 48 小时时仍表现出腹侧弯曲的表型。

该图像显示了经化合物处理的胚胎与刺猬信号通路突变体胚胎的对比。一旦掌握该技术，一个人每周仅需数小时即可筛选约400种化合物。该技术还为化学生物学家研究细胞发育、细胞信号通路以及胚胎发育等过程铺平了道路。

在处理未表征的小分子时，必须注意安全，使用实验服和手套，因为这些未表征的分子可能具有潜在危险性。