Name: 斑马鱼为基础的大型在体内小分子屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习利用斑马鱼胚胎进行大规模小分子筛选的方法，通过96孔板高通量筛选技术识别调控胚胎发育与生理的活性化合物，为药物发现和发育生物学研究提供可靠的体内筛选平台。

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1）斑马鱼卵收集
<ol>
	<li>在化学筛选前一天下午，准备10至20个斑马鱼繁殖缸。每个缸中加入养殖系统中的水。使用鱼网将一条成年雄鱼和一至两条成年雌鱼转移到每个繁殖缸的内槽中。用隔板将雄鱼和雌鱼分隔开。标记各个繁殖缸，并盖上盖子。</li>
	<li>在筛选当天早晨，移除繁殖缸中的隔板，使斑马鱼交配。在接下来的1小时内，让受精卵通过每个内槽底部的网格自然落下。</li>
	<li>1小时后，将成年斑马鱼放回永久饲养缸，取出内槽，并通过塑料茶滤网过滤每个繁殖缸中的水来收集卵。</li>
	<li>将滤网倒置在培养皿上方，使用装有E3培养基的洗瓶轻轻冲洗滤网，使卵被冲入培养皿中。</li>
	<li>应使用一次性塑料移液器去除所有不透明的未受精卵。每次交配组合应获得约200个胚胎。</li>
</ol>
2）将胚胎排列在96孔板中
<ol>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管将约5个胚胎转移至96孔板的每个孔中，孔内预先加入E3培养基。</li>
	<li>当胚胎排列至96孔板后，使用12通道移液器（30 - 300 μL）尽可能吸除各孔中的E3培养基，注意避免刺破胚胎。随后立即使用同一12通道移液器向每孔快速加入250 μL含有0.5 μg/mL卡那霉素的E3培养基，以防止胚胎干燥。</li>
	<li>将96孔板放入28.5°C培养箱中孵育，直至胚胎发育至需要添加化合物的特定阶段。</li>
</ol>
3）小分子文库的转移
尽管化合物转移可通过机器人转移方法实现自动化，但本文将描述手动转移方法。
<ol>
	<li>小分子文库通常以96孔板形式提供，每种化合物以10 mM的母液浓度溶于DMSO中。在胚胎达到需添加化合物的发育阶段前约60分钟，取出含有小分子分装液（来源板）的所需数量的96孔板进行解冻。记录来源板的序列号或其他识别编号。为尽量减少板上产生冷凝，可在含有干燥剂Drierite（W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH）的干燥箱中进行解冻。</li>
	<li>使用配备多孔板适配器的台式离心机，短暂离心收集板内液体。</li>
	<li>移除来源板上的铝封膜。使用12通道移液器，将来源板中的化合物用DMSO稀释至0.5 mM浓度（例如，若起始为10 mM母液的250 nL分装量，则每孔加入4.75 μL DMSO）。</li>
	<li>当96孔板中的胚胎（受体板）达到目标发育阶段时，使用12通道（2–20 μL）移液器，从来源板向含有胚胎的受体板中每孔转移2.5 μL的化合物溶液（0.5 mM）。</li>
	<li>在受体胚胎板上记录来源板的识别编号。用盖子盖好现已含有胚胎和化合物的受体板，轻轻晃动混匀，并将其置于28.5°C培养箱中孵育。</li>
	<li>将含有未使用小分子（0.5 mM）的每个来源板重新用铝封膜密封，置于-80°C冰箱中长期保存。</li>
</ol>
4) 通过表型的肉眼观察筛选小分子的作用效果
<ol>
	<li>在进行筛选之前，需制定明确的标准，以界定何种结果可被视为“阳性结果”（“hit”）。</li>
	<li>在发育过程中的预定时间点，从培养箱中取出含有化合物处理胚胎的96孔板，并在体视显微镜下逐孔观察。为更清晰地观察细微变化（例如循环模式的改变），可使用相差倒置显微镜。荧光显微镜可用于检测在组织特异性启动子驱动下GFP或DsRed蛋白表达的扰动情况。</li>
	<li>快速扫描96孔板，寻找至少有5个胚胎中3个以上表现出预设“阳性结果”表型的孔。记录每个潜在阳性结果所在的板编号及孔位位置。</li>
	<li>通过在多个浓度（1 μM、5 μM、10 μM 和 50 μM）下重新测试化合物的作用，以验证潜在阳性结果。每个浓度下，在48孔板中以0.5 mL E3培养基处理10个胚胎。复测时化合物添加的时间应与原始筛选一致。当复测中能够重现目标表型时，即可确认为阳性结果。</li>
	<li>从化学文库的小分子数据库中鉴定出阳性化合物。</li>
</ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在规划基于斑马鱼的化学筛选实验时，必须特别关注所考察表型的稳健性及其背景发生率。这一点对于筛选能够抑制诱导性表型的化学物质尤为重要。例如，若表型由热激诱导转基因表达引起，则必须在启动筛选前精确确定能够稳定诱导该表型的实验条件，以避免假阳性率过高。通过周密的规划，斑马鱼化学筛选实验（所需资金投入适中）有望发现新的细胞信号转导和生理功能调节剂，以及可用于逆转人类疾病模型的先导化合物。最后，类比经典的正向遗传学筛选，基于斑马鱼的化学筛选在化学遗传学解析基本生物学过程方面也具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>材料名称</td><td>类型</td><td>公司</td><td>目录编号</td></tr><tr><td>至少20对具有目标基因型的成年斑马鱼。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鱼网、繁殖缸（带可拆卸内槽和隔板，Aquatic Habitats）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿（10 cm）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料茶漏。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>装有胚胎用水的洗瓶。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性聚乙烯移液管。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯96孔圆底检测板（Corning COSTAR；Lowell，MA）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管（Fisher Scientific）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手动移液器泵，10 mL（Bel-Art Products，Pequannock，NJ）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3胚胎培养基：5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，含0.003% PTU（苯硫脲，Sigma；St. Louis，MO）。PTU可配制成10倍浓度溶液，即将0.3 g PTU溶解于1 L E3胚胎培养基中。含PTU的溶液应使用铝箔包裹以避光保存。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12通道移液器，2–20 &amp;#956;L（Eppendorf）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12通道移液器，3–300 &amp;#956;L（Eppendorf）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯移液管接液槽，50 mL（Fisher Scientific）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>结构多样小分子化合物库，以96孔板形式排列，DMSO中储存浓度为10 mM。每块母板分装至96孔聚丙烯储存板（Corning）中，并于-80&amp;#x00B0;C保存直至使用。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板用铝封膜（Nunc，Rochester，NY）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO（Sigma，St. Louis，MO）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基础培养箱，28.5&amp;#x00B0;C（Fisher Scientific）。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备透射光源底座的体视显微镜（Leica Microsystems，Bannockburn，IL）。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大规模基于斑马鱼的体内小分子筛选

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

鉴于其胚胎体积小、发育迅速、身体透明、繁殖力强，以及在分子、形态和生理方面与哺乳动物存在诸多相似性，斑马鱼已成为一种强大的in vivo基于表型的药物筛选和化学遗传学分析平台。在此，我们展示了一种利用斑马鱼胚胎进行小分子大规模筛选的简单且实用的方法。

斑马鱼已成为基于表型的药物筛选和化学遗传学分析的强大体内研究平台。本文中，我们展示了一种利用斑马鱼胚胎进行小分子大规模筛选的简单、实用的方法。

鉴于其胚胎体积小、发育迅速、通体透明、繁殖力强，以及在分子、形态和生理方面与……存在诸多相似性

以下实验的总体目标是发现能够特异性调控胚胎发育和生理关键环节的小分子。该目标通过将大量受精卵放入96孔筛选板中来实现，这是第二步操作。随后，将小分子文库的等分试样加入到96孔板中的胚胎内。通过培养板检测小分子诱导的表型。获得的结果可显示哪些小分子特异性影响超级鱼的发育或生理。您好，我是范德堡大学医学院的 Charles Hong。在我们的实验室中，我们使用斑马鱼胚胎进行高通量化学筛选。这是一种相对简单且可广泛适用的技术，可用于发现新的生物活性化合物。在进行化学筛选的前一天下午，设置10至20个斑马鱼繁殖缸。在每个水箱中放入一个隔离板，使用渔网从养殖系统中取水并转移一条成年雄鱼和一至两条成年雌鱼至内层容器中。在每个繁殖水箱上做好标签，并在筛选当天早晨加盖。移除繁殖水箱中的隔离板，让斑马鱼进行交配。在接下来的一个小时内，让受精卵通过每个内容器底部的网格落下。一小时后，将成年斑马鱼放回永久性储存水箱中。取出内层容器，将每个繁殖罐中的水通过塑料茶漏过滤，收集卵。将茶漏倒置在培养皿上方，轻轻冲洗茶漏，使卵冲入培养皿中。使用装有E3培养基的洗瓶，去除所有呈不透明状的未受精卵。使用一次性塑料移液管，每次交配杂交应获得约 200 个胚胎。然后用玻璃巴斯德移液管将约五个胚胎转移至含有 E3 培养基的 96 孔板的每个孔中。一旦胚胎被排列至 96 孔板上。使用12通道移液器尽可能吸出孔中的E three培养基，注意不要刺破胚胎。使用12通道移液器加入250 µL的E three培养基。尽快向每个孔中加入含有 0.5 微克/毫升卡那霉素的培养基，以防止胚胎干燥。将 96 孔板放入 28.5 摄氏度的培养箱中，直至胚胎发育至需要添加化合物的特定阶段。在本实验方案中，我们寻找能够干扰早期胚胎模式形成的化合物，因此将胚胎孵育三小时，或直至超过 90% 的胚胎达到 1000 细胞期，此时通常提供小分子文库。在96孔源板中，每种化合物以DMSO配制的10毫摩尔浓度储备液形式储存，在胚胎达到所需阶段前约60分钟，取出适量含有小分子分装液的96孔板进行解冻。记录源板的序列号或其他识别编号，以尽量减少孔板上的冷凝现象。将板放入含有干燥剂的干燥室中。将微孔板放入配备多孔板转子的台式离心机中短暂离心。使用12通道移液器从源板上移除铝制封膜，并用DMSO将源板中的化合物稀释至所需浓度。在本方案中，我们使用0.5毫摩尔的终浓度，向10毫摩尔的母液板中加入4.75微升DMSO进行稀释。当96孔板中的胚胎发育至所需阶段时，使用12通道移液器将2.5微升化合物从源板转移至含有胚胎的受体板中。用盖子盖好现含有胚胎和化合物的板，并在胚胎板上记录源板的编号。轻轻摇晃混匀后，将板置于28.5°C的培养箱中。将含有未使用小分子的每块源板用铝箔封盖，再用胶带密封，并置于–80 °C冰箱中长期保存。在进行视觉筛选之前，需制定明确的阳性命中标准。例如，在针对四个小分子抑制剂影响脑发育的筛选中，阳性命中可能是指导致前脑缺失的化合物。眼睛缺失是前脑发育缺失的一个直观视觉指标，可在发育过程中的指定时间点通过肉眼观察进行检测，无需荧光标记。从培养箱中取出含有化合物处理胚胎的96孔板，在筛选抑制前脑发育的小分子抑制剂时，使用体视显微镜检查每个孔；为观察眼睛缺失作为前脑发育受抑制的标志，应在处理28小时后进行观察。记录其中至少五个胚胎中有三个或以上表现出规定表型的孔所在的96孔板编号及孔位位置。将96孔板放回培养箱中继续培养。在48小时时再次确认眼睛和前脑的缺失。尽管胚胎将没有前脑，但它们仍可存活至少四天。通过在多个剂量下重复测试化合物的作用来重新确认潜在的有效结果，每个剂量使用48孔板格式，在0.5毫升E3培养基中测试10个胚胎。重新测试化合物时，加样时间应与原始筛选时完全相同。当化合物在重新测试中以剂量依赖性方式重现所诱导的表型时，即可确认为高诱导性化合物（HIIT）。最后，从化学文库的小分子数据库中鉴定出高诱导性（hi）化合物。利用基于斑马鱼的可视化化学筛选，我们发现了一种小分子 Hedgehog 信号通路抑制剂，其作用依据是其对体轴的影响。该图像显示了暴露于 Hedgehog 抑制剂的胚胎，其尾部出现明显的腹侧弯曲。在 24 小时时，与 48 小时观察的相同胚胎相比，仍表现出腹侧弯曲的表型。该图像显示了经化合物处理的胚胎与刺猬信号通路突变体胚胎的对比。掌握该技术后，一人每周仅需数小时即可筛选约400种化合物。该技术还为化学生物学家研究细胞发育、细胞信号通路以及胚胎发育等过程开辟了道路。在处理未表征的小分子时，必须注意安全，穿戴实验服和手套，因为这些未表征的分子可能具有潜在危害性。

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科研

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Biology

生物学

斑马鱼为基础的大型在体内小分子屏幕

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斑马鱼化学筛选的自动化成像与分析方法开发

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