Name: 基因传递到产后大鼠脑非心室质粒注射和电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习利用非病毒活体电穿孔技术向新生大鼠脑组织进行基因递送的方法。该技术可高效靶向特定脑区，为神经科学研究提供低成本的基因功能研究手段。

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感谢 Ekaterina Karelina 协助完成视频音轨录制，Ivan Molotkov 提供 3D 动画，以及 Peter Blaesse 博士提供 CAG-EGFP 质粒制备。
本工作获得了芬兰国际流动中心、芬兰文化基金会以及芬兰科学院资助项目的资助。

1. 引言
创建转基因动物是研究基因在活体动物中功能的强有力方法1 并揭示疾病机制2,3 以及用于调控细胞的特性4然而，该过程相当繁琐，极为耗时且成本高昂，因此有必要采用病毒注射等替代性基因递送方法5，新生小鼠心室注射联合电穿孔6 和 在子宫内 电穿孔7,8出生后非脑室注射与电穿孔方法具有一系列独特的优点：可使用非病毒性基因构建体；能够在目标区域实现局部表达模式； 原位 非迁移性细胞类型的转染，例如皮层星形胶质细胞。
在本视频中，我们演示了使用携带鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子驱动的增强型绿色荧光蛋白编码质粒（pCAG-EGFP）9，对新生大鼠脑进行出生后基因递送的详细操作流程。我们介绍了含质粒注射液的制备、细玻璃移液管的制作，以及在立体定位仪上组装微量注射装置的过程。随后，我们讲解了使用异氟烷对幼鼠进行麻醉、手术操作、注射过程，以及使用镊形电极和in vivo电穿孔仪进行体内电穿孔的方法。最后，我们简要讨论了实验中预期的结果、研究前景以及可能遇到的困难。
2. 电穿孔用质粒的制备
<ol>
 <li>我们通常在200 μl薄壁管中制备10 μl质粒注射溶液。该溶液足以用于多次实验。</li>
 <li>将8 μl质粒溶液（参见材料与设备）与1 μl 10× PBS（参见材料与设备）以及1 μl 0.1% 快绿水溶液（参见材料与设备）混合。</li>
 <li>注射溶液中质粒的终浓度应在1至3 μg/μl之间。质粒DNA浓度过低会降低转染效率，而过高则会使溶液过于黏稠，难以通过玻璃毛细管的细尖端进行注射。</li>
</ol>
3. 玻璃针制备
<ol>
 <li>在制备玻璃移液管时，我们使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（参见材料与设备）和垂直电极玻璃拉制仪（参见材料与设备），并采用最大拉力和加热参数进行操作。</li>
 <li>随后，我们使用一张纸片折断移液管尖端，使其尖端直径达到 10–20 μm。</li>
 <li>我们在显微镜物镜下检查尖端的直径和形状。</li>
</ol>
4. 显微注射仪组装
<ol>
 <li>使用一根细的聚合物毛细管（参见材料与设备），将一个 10 μl Hamilton 注射器（参见材料与设备）的约三分之一体积填充矿物油（参见材料与设备）。避免产生气泡！</li>
 <li>然后用矿物油填充玻璃移液管，并将其插入 Hamilton 注射器中。避免产生气泡！</li>
 <li>将装有玻璃移液管的注射器固定在连接控制器的显微注射仪上（参见材料与设备）。</li>
 <li>将显微注射装置固定在立体定位仪上（参见材料与设备），使我们能够安全地将玻璃移液管的尖端浸入含有质粒注射溶液的管中。</li>
 <li>当尖端接触溶液表面时，再深入 1 或 2 mm，并通过显微注射控制器吸取约 1 μl 的注射混合液。</li>
</ol>
5. 动物麻醉
本文所述所有操作均按照赫尔辛基大学动物实验规定进行。
<ol>
 <li>每次实验时，我们使用一个气密注射器（见材料与设备）吸取约 2 ml 的异氟烷（见材料与设备）。</li>
 <li>然后将注射器固定在麻醉机（见材料与设备）上，该麻醉机连接气流源、动物箱以及固定在立体定位仪上的面罩。</li>
 <li>在麻醉机上，我们将气流速度调节至约 250 ml/min，异氟烷浓度调节至 4 %。</li>
 <li>将幼鼠放入动物箱中 2 至 5 分钟。</li>
 <li>当幼鼠停止活动时，将其放置在连接于立体定位仪的加热垫上。</li>
 <li>将幼鼠头部的前部放入麻醉面罩中。</li>
 <li>幼鼠进入深度麻醉状态通常需要 5 至 10 分钟。</li>
 <li>通过夹尾测试检查麻醉深度，并将异氟烷输入量降低至约 1.5 至 2.0 %。</li>
</ol>
6. 手术、显微注射与电穿孔
<ol>
 <li>用70%乙醇处理幼鼠头部皮肤。</li>
 <li>使用小剪刀（见材料与设备）和细镊子（见材料与设备），从幼鼠颈背部至前额切开皮肤。</li>
 <li>将皮肤向两侧弯折，并将耳杆轻轻插入颅骨的耳道以固定头部和皮肤。</li>
 <li>在双目显微镜下定位颅骨上的前囟点。</li>
 <li>利用立体定位坐标确定目标区域。</li>
 <li>将注射移液管置于该区域上方，并在颅骨表面滴加25–50 nl注射溶液以标记位置。</li>
 <li>在显微镜下，使用高速外科钻（见材料与设备）在标记点处轻柔、小心地钻孔，直至钻孔区域出现液体。</li>
 <li>将电穿孔镊电极（见材料与设备）固定在颅骨两侧，并使用导电胶（见材料与设备）以提高导电性。</li>
 <li>用小棉签（见材料与设备）吸除钻孔中的液体，并根据注射位点的坐标将玻璃针插入孔中。</li>
 <li>以5–20 nl/sec的速度注入25–100 nl注射溶液。</li>
 <li>迅速撤出移液管并立即进行电穿孔。电穿孔参数为：施加5次矩形脉冲，每次持续50 ms，电压99 V，频率1 Hz。</li>
 <li>移除电极和耳杆。</li>
 <li>使用钝镊（见材料与设备）和尖镊配合外科缝线（见材料与设备）缝合切开的皮肤。</li>
 <li>将幼鼠放入保温舱中15–30分钟，以促进其从麻醉中恢复。</li>
 <li>然后将幼鼠放回母鼠笼中。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在成功转染的细胞中，外源基因的表达将在电穿孔后约10小时出现，并可持续数周保持稳定。
我们将质粒显微注射至出生后第2天（P2）Wistar大鼠幼崽的深层皮质层或纹状体区域，并进行了 体内 电穿孔操作如上所述。脑切片（400 μm 在2至6天（P4-P8）期间，使用振动切片机在冰冷的切片液（HEPES缓冲的Earle平衡盐溶液）中切取脑片（厚度为...）10使用蔡司Axioplan 2 LSM5 Pascal共聚焦显微镜（Zeiss，德国）在室温下的切片介质中进行图像采集。
深层皮质层和纹状体的注射部位包含大量转染细胞，这些细胞表达EGFP，位于直径约200-300 μm的紧凑区域内（图1A、B）。在转染细胞中，EGFP表达水平足够高，可对细小的细胞突起进行成像（图1C），包括具有不同形态棘突的树突（图1D）以及轴突束（图1E）。由于EGFP的强稳定性以及电穿孔后细胞仍保持良好的活性，因此能够追踪轴突的远端部分（距离胞体最远达1.5-2 mm），例如皮质终末（图1F）。
<img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="神经元成像；荧光显微镜、神经元结构、荧光分布、显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. （A）P4 大鼠脑纹状体区域成功转染的细胞，显示质粒注射位点。（B）P5 大鼠脑深层皮质层（皮质表面下约 1000 μm）中转染的细胞。（C）P8 大鼠脑纹状体区域的一个转染细胞。（D）P8 大鼠脑纹状体区域转染细胞的树突突起；箭头指示不同类型的树突棘和丝状伪足。（E）转染细胞在侧支通路中的轴突。（F）转染细胞的轴突终止于 P8 大鼠皮质的软脑膜表面（箭头）。标尺：A、B、E 和 F 为 100 μm；C 和 D 为 10 μm。

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
<li>Cryan, J. F., Holmes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+mouse%3A+advances+in+modeling+human+depression+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).</li>
<li>Wells, T., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+neural+function+in+transgenic+rodents%3A+towards+a+comprehensive+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Boutin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Walantus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

将基因递送至活体啮齿类动物大脑的方法已较为成熟 在子宫内 电穿孔7,8,11,12 以及最近用于出生后电穿孔6然而，这些方法依赖于将质粒DNA注射到脑室内，这在某些应用中可能存在局限性。例如，这些方法无法靶向海马等特定脑区的细胞，也不能转染皮层星形胶质细胞等非迁移性细胞类型。非脑室注射联合电穿孔技术最初被用于向小脑神经元递送基因13我们的方案展示了非脑室注射法在大鼠脑其他区域的应用扩展。我们提出，本方法可作为向出生后大鼠脑特定目标区域递送基因的病毒方法的一种有效替代方案。5.
尽管本方法具有优势，但仍可能遇到一些困难，如下所述。
1. 动物的最佳年龄
在条件允许的情况下，应使用较年幼的新生大鼠幼崽，以提高转染效率和手术后的存活率。据我们经验，P0 天的幼崽体型过小，难以根据该年龄段可用脑图谱中的立体定位坐标，稳定地靶向大脑特定区域14。此外，P0...

<table><tbody><tr><td>2A-sa 型直头镊子，115毫米</td><td>设备</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>使用前用70%乙醇处理以进行消毒</td></tr><tr><td>带有不锈钢加热垫的生物温度控制器</td><td>设备</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>带灯丝的硼硅酸盐玻璃管</td><td>材料</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>玻璃针</td></tr><tr><td>一次性钻头</td><td>材料</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，110 mm</td><td>设备</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>手术操作前，使用70%乙醇进行消毒处理</td></tr><tr><td>伊灵微流控&amp;#8211;电极拉制仪</td><td>设备</td><td>伊灵</td><td>50-2013</td><td>垂直电极玻璃拉制仪</td></tr><tr><td>Ethilon 单丝聚酰胺 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>材料</td><td>约翰逊 &amp;安普和约翰逊</td><td>EH7177H</td><td>手术缝线</td></tr><tr><td>Exmire 微量注射器 10.0 ml</td><td>设备</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>气密注射器</td></tr><tr><td>快绿</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>镊形电极</td><td>设备</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>使用前用70%乙醇进行消毒处理</td></tr><tr><td>Foredom 钻机控制器</td><td>设备</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>外科钻头电源及控制系统。目前可用的类似产品为 Foredom 公司的微电机套件 K.1070 </td></tr><tr><td>Foredom 微型电机手柄</td><td>设备</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>目前可获取的类似产品为微电机套件 K.1070（Foredom）</td></tr><tr><td>小鼠气体麻醉平台</td><td>设备</td><td>Stoelting 公司</td><td>50264</td><td>在立体定位仪上组装</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>试剂</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>微型敷料镊，105 mm</td><td>设备</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>手术操作前用70%乙醇进行消毒处理</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>微注射器填充毛细管</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 注射器 10 微升</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>汉密尔顿注射器</td></tr><tr><td>质粒 CAG-EGFP</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>使用内毒素去除型质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit，Qiagen）提取并纯化，溶于无核酸酶水中，浓度为1.5 mg/ml</td></tr><tr><td>脉冲发生器 CUY21Vivo-SQ</td><td>设备</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller 电极凝胶</td><td>试剂</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>导电凝胶</td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>设备</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;小鼠和新生大鼠适配器</td><td>设备</td><td>Stoelting 公司</td><td>51625</td><td>在立体定位仪上组装。手术操作前，用70%乙醇处理耳杆以消毒。</td></tr><tr><td>学生用虹膜剪，直型，11.5 cm</td><td>设备</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>手术操作前用70%乙醇进行消毒处理</td></tr><tr><td>Sugi 吸收性棉签 17 x 8 mm</td><td>材料</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>手术棉垫</td></tr><tr><td>UMP3 微量注射泵和 Micro 4 微量注射泵控制器</td><td>设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>显微注射仪和控制器</td></tr><tr><td>Univentor 400 麻醉机</td><td>设备</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

通过非脑室途径质粒注射与电穿孔法向新生大鼠脑组织递送基因

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

创建转基因动物是研究目的基因功能的常用方法 体内然而，在基因于整个生物体中表达或被敲除的情况下，许多基因敲除或转基因动物无法存活。此外，多种补偿机制常常使得实验结果难以解释。通过控制基因表达的时间或限制转染细胞的数量，可以减轻这些补偿效应。
产后非脑室微量注射结合体内电穿孔技术可将基因、siRNA 或染料分子直接靶向递送至新生啮齿类动物大脑的特定小区域。与传统的脑室注射技术相比，该方法能够转染非迁移性的细胞类型。通过本方法转染的动物可用于例如双光子体内成像，或急性脑切片的电生理实验。

本方案描述了一种非病毒性方法，用于将遗传载体递送至活体啮齿类动物大脑的特定区域。该方法包括质粒制备、微移液管制作、新生大鼠幼崽手术、载体的微量注射以及 体内 电穿孔

创建转基因动物是体内研究目的基因功能的标准方法。然而，许多基因敲除或转基因动物……

大家好，我是RI Ov，这位是Alexia Ying。我们是中国大学的研究生。在本视频中，我们将介绍一种体内电穿孔方法，用于将目的基因递送至大脑特定区域的脑组织。那么让我们来看一下。体内电穿孔法为将目的基因或小干扰RNA递送至活体脑组织提供了一种快速且高效的方法。它为转基因动物的制备和病毒介导的基因递送方法提供了一种低成本的替代方案。在本视频中，我们将演示一种针对新生小鼠放射状神经胶质细胞进行出生后基因递送的详细操作流程。我们将使用编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒，并采用带有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子。我们在层流柜中进行所有外科操作，以保持无菌状态，并将动物受到细菌或真菌污染的风险降至最低。为了将质粒递送至大脑皮层，我们使用WPI微量注射器（配备电子控制器）和连接至立体定位仪的10微升Hamilton注射器。使用麻醉机（包括麻醉箱和面罩）对红色幼鼠进行麻醉。然后使用立体定位仪上连接的加热台上的耳杆固定幼鼠。对于手术操作和显微注射的监测，我们使用双目显微镜。对于电穿孔，我们使用带有镊子形状电极的 CYV 21 体内电穿孔仪。用于幼鼠复苏。麻醉后，使用加热舱。我们通常在200 µL薄壁管中配制10 µL质粒注射溶液。该溶液足以进行多次实验。将8微升质粒溶液与1微升10倍浓度的磷酸盐缓冲液（XPBS）以及1微升0.1%的快绿水溶液混合。注射液中质粒的终浓度应为每微升1至3微克。质粒DNA浓度过低会降低转染效率，而DNA浓度过高则会导致溶液黏度过大，难以通过玻璃毛细管的细尖端进行注射。在制备玻璃移液管时，我们使用带细丝的博奥硅酸盐玻璃毛细管，并在垂直电极玻璃拉制仪上采用最大拉伸和加热参数进行拉制。随后，使用一张纸片折断移液管尖端，使其尖端直径达到10至20微米。我们通过显微镜物镜检查尖端的直径和形状。使用一根细的聚合物毛细管，将约三分之一体积的矿物油注入一支10微升的Hamilton注射器中。注入时需确保避免产生气泡。然后用矿物油填充玻璃移液管，并将该移液管插入Hamilton注射器中。再次注意避免产生气泡。将带有玻璃移液管的注射器固定在连接控制器的显微注射仪上。将显微注射装置固定在立体定位仪上，可安全地将玻璃移液管的尖端浸入含有质粒注射溶液的管中。当移液尖接触溶液表面时，再将其深入1至2毫米。然后使用显微注射控制器向移液管中注入约1微升的注射混合液。本文所展示的所有实验均按照赫尔辛基大学动物实验规定进行。每次实验时，我们使用气密注射器抽取异氟烷。将注射器固定在麻醉机上，麻醉机连接气流源、动物呼吸管路以及固定于立体定位仪上的面罩。在麻醉机上，调节气流速度至约 250 毫升/分钟，异氟烷浓度调节至 4%。将动物放入红色诱导箱中 2 至 5 分钟。当幼鼠停止活动后，将其放置在与立体定位仪相连的加热垫上。将幼鼠头部的吻端部分放入面罩中。通常需要5到10分钟，幼鼠即可进入深度麻醉状态。达到该状态后，我们将异氟烷的流量降低至约1.5%至2%。使用小剪刀和细镊子，以70%乙醇处理幼鼠头部皮肤。从幼鼠颈背部至前额切开皮肤，将皮肤向两侧翻开，并将耳杆轻轻插入颅骨的耳道开口，以固定头部和皮肤。使用双目显微镜定位颅骨上的前囟点，根据立体定位坐标确定目标区域，将注射移液管置于该区域上方，并通过在颅骨表面滴加25至50纳升注射溶液进行标记。我们在显微镜下使用高速外科钻头，在标记的位置轻柔而仔细地钻开颅骨，直至钻孔区域出现液体。将电穿孔镊子的电极固定在颅骨两侧，并涂抹导电凝胶以获得更好的导电性。使用小棉签将钻孔区域的液滴吸除，然后将玻璃针插入孔中。根据注射位点的坐标，以每秒5至20纳升的速度注入25至100纳升的注射溶液。随后迅速移出移液管，并立即进行电穿孔操作。电穿孔通过施加五个脉冲完成，每个脉冲持续时间为50毫秒，脉冲振幅为99伏特，频率为1赫兹。随后移除电极和耳杆，使用钝头和尖头镊子结合手术缝线缝合切开的皮肤。我们将幼鼠放入温暖的培养箱中15至30分钟，以帮助其从麻醉中恢复。随后将幼鼠放回母鼠的笼中。成功转染的细胞中转基因的表达将在电穿孔后约10小时出现，并可持续数周。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。再见。

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神经科学

基因传递到产后大鼠脑非心室质粒注射和电穿孔

子宫内活体注射与电穿孔技术应用于胚胎大鼠新皮质，为操控单个前体细胞提供了强大工具……...

E16 大鼠胚胎的宫内脑室内注射与电穿孔

在子宫内 电穿孔是一种用于转染神经前体细胞的有效方法 体内根据电极的位置和电穿孔的发育时间点，可以选择性地靶向特定的皮层细胞亚群。随后可对这些靶向细胞进行分析 体内 或 体外...

在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

可通过在 E16 时期对大鼠的皮层或海马体进行子宫内电穿孔（IUE），在发育过程中操控基因，从而实现对成年动物神经元连接的快速且靶向的修饰，以用于后续的行为学或神经病理学研究。通过共转染的荧光素酶的生物发光，对 IUE...

通过局部转基因技术制备转基因大鼠 在子宫内 电穿孔和 在体 生物发光筛选

我们展示了一种被称为新生鼠侧脑室下区电穿孔的微创技术。该技术包括将质粒DNA注射到新生幼鼠的侧脑室内，并施加电流以递送并遗传操控神经干细胞...

新生小鼠侧脑室下区电穿孔技术

软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。...

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

我们介绍一种将DNA质粒递送至小鼠膀胱尿路上皮细胞的新方法 体内...

通过电穿孔法将质粒DNA递送至小鼠膀胱尿路上皮的新方法

本文介绍了一种用于在成年斑马鱼端脑中递送质粒DNA并标记室管膜胶质细胞的电穿孔方法。该方案是一种快速高效地观察和示踪单个室管膜胶质细胞的技术，为将电穿孔技术应用于广泛的遗传操作提供了新的可能性。...

成年斑马鱼端脑内质粒DNA体内递送的电穿孔方法

本方案详细介绍了在新生小鼠中进行鞘内注射以实现基因编辑和药物递送的逐步操作步骤。...

新生小鼠鞘内注射用于基因组编辑与药物递送

学习利用非病毒活体电穿孔技术向新生大鼠脑组织进行基因递送的方法。该技术可高效靶向特定脑区，为神经科学研究提供低成本的基因功能研究手段。

通过非脑室途径质粒注射与电穿孔法向新生大鼠脑组织递送基因

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