含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型

以下实验的总体目标是在 InVivo 模型系统中测定 β 淀粉样蛋白肽的毒性。该测定的可重复性和相对简单性允许快速测试药物、环境条件或 β 淀粉样蛋白毒性的基因修饰。开发该测定法的一个关键因素是产生具有肌肉特异性温度诱导表达 β 淀粉样蛋白肽的转基因 cl egan 蠕虫。

这种温度敏感表达是通过构建一个转基因来设计的，该转基因包含一个异常长的三个主要非翻译区，使转基因 mRNA 成为 mRNA 监视的靶标，因此由于转基因 mRNA 的降解，该转基因的表达在具有功能性 mRNA 监视系统的野生型蠕虫中很差。如果将该转基因引入包含 mRNA 监测系统重要组成部分突变的遗传背景中，则转基因表达将显着升高。如果遗传背景在 mRNA 监测系统中包含温度敏感突变，那么这种 trenchgenic 菌株在非允许的温度下的繁殖将阻止 trench 基因 mRNA 降解，并导致高 trench 基因表达 trenchgenic 蠕虫采用该系统来调节 β 淀粉样蛋白肽的体壁肌肉表达温度从 16 摄氏度上升到 25 摄氏度， 导致肌肉细胞的 β 淀粉样蛋白肽功能障碍和蠕虫麻痹测量的时间。

这些 trenchgenic 蠕虫种群在温度过后才会瘫痪。Upshift 是一种对 β 淀粉样蛋白毒性敏感的测定方法。这是通过制作用于麻痹测定的新鲜线虫生长培养基板来实现的，这有助于最大限度地减少可能影响麻痹率的环境变量。

作为第二步，年龄同步或启动的战壕蠕虫种群，这最大限度地减少了发育阶段对转基因表达的影响。接下来，同步的第三幼虫阶段从 16 摄氏度上升到 25 摄氏度，增加了转基因 mRNA 的稳定性并导致 β 淀粉样蛋白肽的积累。测量每条蠕虫从上移到麻痹的时间可以捕获肌肉功能障碍的发生率，从而测定 β 淀粉样蛋白肽积累的毒性作用，获得结果，显示特异性治疗对内源性表达的 β 淀粉样蛋白肽毒性的影响。

因此，与使用转基因小鼠模型来检测药物活性相比，我们技术的主要优势在于，我们可以更快、更便宜地完成我们的研究。这种方法的视觉演示至关重要。在麻痹试验中 L 4 蠕虫的评分非常难学。

因此，当您对瘫痪的 L 4 蠕虫进行评分时，您想要查看的是蠕虫头部区域的孤立光晕运动。一旦它开始移动并且蠕虫的整个身体都瘫痪了，我们就会给该蠕虫打分为瘫痪。麻痹论文是在标准线虫生长培养基或 NGM 平板上进行的，通常用于 CL egan 的繁殖和遗传学。

为了在锥形瓶中制备含有氯化钠、琼脂和肽的 NGM 溶液，请在锥形瓶中加入适量的以下无菌溶液，这些溶液可在随附的书面方案中找到。将 10 毫升液体 NGM 分装到每个 60 毫米 x 15 毫米培养皿中。让 NGM 在室温下凝固过夜。

如果测试化合物或提取物的效果，请将提取物分装到每个板上，并使用涂抹器将其均匀分布在板的表面上。让板在室温下干燥过夜。超过 1 毫升的体积需要更多时间来干燥。

接下来，用 250 微升大肠杆菌菌株 OP 50 在 LB 培养基中生长过夜至光密度为 0.4 至 0.6 的位置点每个板，让细菌在室温下干燥过夜。板的年龄对麻痹率有显着影响，因此较旧的板往往会变干。板应在麻痹试验后一周内倒入。

理想情况下，您希望使用在同步产蛋前三到四天倒入的板 任何实验中使用的板都应该来自同一批次，从而改变草坪的大小，或者细菌也会改变蠕虫的行为 麻痹测定可以使用替代的大肠杆菌菌株进行。例如，HT one 15 用于 RNAi 实验。然而，这可能会改变麻痹测定的动力学。

因此，您必须使用适当的 Sstrain 内部控制。CL 476 最常用于检测 β 诱导的麻痹。该菌株和其他转基因模型可供学术研究人员从 Saint Ahadi 遗传中心以象征性的费用获得。

为了最大化测试群体的年龄同步性，最好这样做。从同步的父代开始。在开始对测试人群进行麻痹试验前一周，使用铂蠕虫采摘器将 20 至 30 个坟墓成虫转移到几个 10 厘米的 NGM 平板上。

与 OP 50 一起撒布 2 小时，鸡蛋在 16 摄氏度下产卵，这是 CL 4 1 76 的允许温度。去除 GR 成虫，让后代生长 7 天，到那时它们将成为第二天的坟墓成虫。第二天重力。

成人用于为每种实验条件准备年龄同步测试人群。目标是使用铂蠕虫拾取器生成一式三份的板，其中包含 50 至 75 龄同步蠕虫，将一天中的 10 到 12 个，两个更刻碎的成虫转移到用 OP 50 点样的 60 毫米 NGM 板上。让蠕虫在 16 摄氏度下卵两个小时，然后摘下成虫，让卵在 16 摄氏度下孵化和生长。

此时，最好让不给板评分的人对它们进行编码，这样分数就会对实验条件视而不见。产卵时的胚胎发育阶段，大约是最佳条件下野生型蠕虫的 26 个细胞阶段，是成年年龄和营养的函数。如果用于产卵的重力成虫年龄较大或饥饿，则后期产卵将产下，并且不会达到同步种群，从而影响麻痹测定的动力学。

必须使用单基因细菌培养物，例如大肠杆菌、OP 50，因为任何类型的细菌污染都会严重影响该检测。如果您的一式三份板具有相似数量的蠕虫，则可重复性最高诱导转基因并进行麻痹测定。将板升至 25 摄氏度。

同步产卵结束后 48 小时，蠕虫应处于第三幼虫阶段。板应放置在 25 摄氏度的培养箱中，不要堆叠，以使板达到此温度。同时，在升级开始后 18 到 20 小时开始对蠕虫麻痹进行评分。

此时，种群中的所有蠕虫都应该已经达到第四幼虫阶段，以两小时为增量继续评分，直到每个板上的所有蠕虫都瘫痪。由于未知原因，瘫痪甚至没有超过身体长度。头部区域是蠕虫停止移动的最后一个部分。

因此，最近开始麻痹的蠕虫不能跨板翻译，但可以移动头部，从而清除前部周围的细菌并留下一圈清除的细菌。这些蠕虫总是会完全瘫痪，因此带有光晕的蠕虫被描述为瘫痪。有些蠕虫不会有光晕，但也不会表现出自发运动。

这些是通过用蠕虫选择器刺激它们来测试的。如果被刺激的蠕虫在被刺激时无法进行全身波传播，则它也会被评分为瘫痪，以便进行有效评分。最简单的方法是将麻痹的蠕虫移动到板的未斑点区域，这样它们就不会在下一个评分周期无意中被重新评分。

这也允许错误分类的蠕虫展示运动，从而允许评分校正生成麻痹曲线。在每个时间点，每个板上未瘫痪的蠕虫的比例被转换为百分比，并且从升档开始的时间开始，将平均无与伦比的百分比与时间作图。所得曲线在形式上类似于生存曲线，因此可以使用标准非参数生存统计进行分析。

转基因 myo three A β 蠕虫的上移必须在 L 中期 4 阶段进行，才能开始瘫痪。Myo 3 启动子受发育调节。一旦蠕虫达到 L 4 晚期或成年期，表达水平就显著降低。

如果蠕虫饿死，转基因的表达就会被阻断，因此在整个实验过程中对蠕虫进行良好的喂养非常重要。我们从未观察到瘫痪的蠕虫在任何情况下都能恢复。上移 12 到 16 小时后，CL 41 76 会瘫痪，无论你是否将其应变下移到 16 度，导致瘫痪的转基因表达的 CL 41 76 上调可以在较低温度下发生。

但是，请注意，麻痹率的时间会受到影响。麻痹率取决于所使用的特定转基因菌株。我们构建了 myo three A β 菌株，其麻痹率比 CL 41 76 更快和更慢，因此，您需要相应地调整麻痹测定的评分窗口。

此处显示了 CL 4 1 76 的麻痹曲线图，未经处理并暴露于 6.27 毫摩尔咖啡因。这种治疗导致瘫痪延迟约 4 小时，具有高度统计学意义，我们将其解释为表明抑制 β 毒性。在这个模型中，该实验分析了咖啡中发现的另一种化合物 ol 的影响。

该图是不影响 β 毒性的处理的典型图。请注意，在这两个实验中，大约一半的未经治疗的 CL 4 1 76 种群在 24 小时时瘫痪，在 28 小时时完全瘫痪。这些是控制瘫痪的典型时间框架。

CL 4 1 7 6 种群与该时间的显著偏差表明环境条件改变或转基因拷贝自发缺失。有关菌株 CL 4 1 76 的更多信息，请参阅随附的方案。在尝试此程序时，重要的是要记住板的年龄、蠕虫种群的阶段以及对蠕虫麻痹率进行评分的能力。

看完这个视频后，您应该对如何使用这个 sea elgan 系统仔细检测 β 淀粉样蛋白毒性有一个很好的了解。您应该能够检测到各种环境或药物治疗对这种毒性的非常微妙的影响。我们讨论的变量很重要，需要注意，因为这将使您能够非常可重复地进行检测，并且具有一致的麻痹动力学。

如果您想比较不同人在不同时间在实验室中完成的结果，或者将您的结果与使用此模型系统的其他研究人员进行比较，这实际上非常重要。