Name: 含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 了解利用温度诱导型转基因秀丽隐杆线虫模型测定β-淀粉样蛋白毒性的体内实验方法。该方案通过肌肉特异性表达Aβ诱导瘫痪表型，为筛选遗传、环境或药理学调节因子提供快速、经济且可重复的高通量平台。

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我们感谢 Link 实验室现任和前任成员对本文所述实验方案的开发所提供的帮助，特别是 Gin Fonte，她开发了最初的实验流程。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：AG12423）和阿尔茨海默病协会（Zenith 奖）向 C.D.L. 提供的资助支持。

1) 为麻痹实验制备线虫生长培养基平板。
在用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）繁殖与遗传学研究的标准线虫生长培养基（NGM）平板上 routinely 进行麻痹表型分析实验（Stiernagle, 2006）。
<ol>
 <li>在锥形瓶中对含有 NaCl、琼脂和蛋白胨的 NGM 溶液进行高压灭菌，然后加入适量的无菌 CaCl2、尿嘧啶、胆固醇、1M MgSO4 和 1M KPO4。将 10 mL 液体 NGM 分装至每个 60 mm × 15 mm 的培养皿中。在室温下静置过夜，使 NGM 凝固。</li>
 <li>若需检测化合物/提取物的作用，将提取物分装至各平板表面，并使用涂布棒将提取物均匀涂布于平板表面。在室温下静置过夜使其干燥。若体积超过 1 mL，则需要更长的干燥时间。</li>
 <li>在每块平板上点加 250 μL 的 E. coli OP50 菌株，该菌株在 LB 培养基中过夜培养至光密度值为 0.4–0.6。在室温下静置过夜，使细菌干燥。</li>
</ol>
相关变量
培养皿的存放时间对瘫痪实验具有显著影响，因为存放时间较长的培养皿容易干燥。应使用在瘫痪实验前一周内制备的培养皿。为获得理想结果，建议在同步化线虫种群建立前3至4天制备培养皿[参见下文(2)]。对于任何实验，仅使用同一批次制备的培养皿。
改变细菌菌苔的大小（即点状接种与涂布接种）和/或细菌的种类也会影响线虫的行为。可使用其他大肠杆菌（E. coli）菌株作为食物来源进行麻痹实验（例如在饲喂RNAi实验中常用的HT115菌株），但这可能会改变麻痹发生的动力学过程，因此需要设置适当的内部对照。
2）制备年龄同步的线虫群体
品系 CL4176 (smg-1(cc546ts) I; dvIs27 [myo-3/ Aβ minigene + rol-6(su1006) marker gene] X) 最常用于检测 Aβ 诱导的麻痹。该品系及其他转基因模型可由学术研究人员以少量费用从 Caenorhabditis Genetics Center（http://www.cbs.umn.edu/CGC/）获取。
<ol>
 <li>为最大程度提高测试种群的年龄同步性，最好从同步化的亲代开始。在启动测试种群的麻痹实验前一周，使用铂金线虫挑取器将20-30只怀卵成虫转移至多个接种了OP50的大肠杆菌、直径为10 cm的NGM平板上，在16°C（CL4176菌株的允许温度）条件下进行为期2小时的产卵。移除怀卵成虫，让后代在该温度下生长7天，此时它们将发育为“第二天”的怀卵成虫。</li>
 <li>（第1天）使用第二天的怀卵成虫来制备年龄同步的测试种群。针对每个实验条件，目标是制备三个重复平板，每个平板含有50-75只年龄同步的线虫。使用铂金线虫挑取器，将10-12只第2天的怀卵成虫转移至接种有OP50的60 mm（10 mL体积）NGM平板上。在16°C下让线虫产卵2小时，随后移除成虫，并将卵继续在16°C下孵化和培养。此时最好由不参与后续评分的人员对平板进行编码，以确保评分者对实验条件保持盲法。</li>
</ol>
相关变量
卵产出时的胚胎发育阶段（在最佳条件下，野生型线虫约为26细胞期）取决于成虫的年龄和营养状况。如果用于制备测试种群的怀卵成虫年龄较大或处于饥饿状态，则会产出更晚期的卵，从而降低种群的年龄同步性以及麻痹动力学实验的可重复性。必须使用单菌性（即仅含OP50细菌）培养物（微生物污染会严重影响该实验），并且为获得最高可重复性，三个重复平板中的线虫数量应相近。
3）转基因诱导与麻痹实验
<ol>
 <li>（第3天）在同步产卵结束后的48小时，将培养板转移至25°C培养；此时线虫应处于三龄幼虫阶段（L3）。培养板应平放于25°C培养箱中，不得叠放，以确保所有培养板同时达到25°C。
</li>
 <li>（第4天）在升温开始后18–20小时，开始记录线虫（品系CL4176）的麻痹情况。此时，群体中所有线虫应均已发育至四龄幼虫（L4）阶段。此后每两小时记录一次，直至每块培养板上所有线虫均出现麻痹。由于未知原因，麻痹在体长方向上并不均匀：头部区域是线虫最后停止运动的部分。因此，刚出现麻痹的线虫无法在培养板上移动，但仍可摆动头部，从而清除口部前方的细菌，形成一圈无菌的“透明圈”（halo）。这些具有透明圈的线虫最终将完全麻痹，因此被归类为麻痹个体。部分线虫可能无透明圈，也无自发运动，需用线虫挑取工具轻触测试。若轻触后线虫无法产生完整的全身波动运动，则同样记为麻痹。为提高计分效率，可将已麻痹的线虫移至培养板上无菌斑的区域，避免在下一次计分时被重复计数。（此操作还可使误分类的线虫有机会表现出运动，从而进行计分校正）。</li>
 <li>为绘制麻痹曲线，在每个时间点，将每块培养板上未麻痹线虫的比例转换为百分比，以升温开始后的时间为横坐标，绘制平均“未麻痹”百分比随时间变化的曲线。（采用此种绘图方式的原因在于，所得曲线在形式上与生存曲线类似，因此可使用标准的非参数生存分析方法进行统计分析。）</li>
</ol>
相关变量
在转基因 myo-3/Aβ 蠕虫达到中晚期 L4 阶段之前，必须完成温度上调，以便启动瘫痪表型，因为 myo-3 启动子具有发育阶段调控特性，在晚期 L4 或成虫阶段其表达水平显著降低。同样，若蠕虫处于饥饿状态，该转基因的表达也会被抑制，因此在整个实验过程中必须确保蠕虫充分喂养。我们从未在任何条件下观察到瘫痪的蠕虫恢复活动能力，且在温度上调 12–16 小时后，CL4176 菌株的所有蠕虫均会瘫痪，即使将其重新降温至 16°C 也无法逆转。在 CL4176 菌株中，足以引发瘫痪的转基因表达上调可在较低温度（即 20–25°C）下发生，尽管瘫痪发生的时间会有所改变。瘫痪速率取决于所使用的特定转基因菌株（我们已构建出比 CL4176 瘫痪更快或更慢的 myo-3/Aβ 菌株），因此使用不同菌株时，可能需要调整评分观察的时间窗口。
4) 代表性结果
图1展示的是CL4176的麻痹曲线图，包括未经处理组和暴露于6.27 mM咖啡因（在NGM平板中的终浓度）的处理组。该处理使麻痹发生时间显著延迟约4小时，统计学差异极显著，我们将其解释为此模型中Aβ毒性的抑制表现。图2展示的是另一项独立实验，检测咖啡中另一种成分——咖啡醇（cafestol）的作用效果。该图代表了对Aβ毒性无影响的处理方式的典型结果。需注意，在这两项实验中，约半数未经处理的CL4176群体在24小时时已出现麻痹，至28小时时麻痹完全发生。这是对照组CL4176群体麻痹的典型时间范围。若出现对此时间模式的显著偏离，则提示环境条件改变或转基因拷贝发生自发性缺失。（CL4176含有一个染色体整合的多拷贝转基因阵列，包含myo-3/Aβ转基因。尽管该转基因阵列通常非常稳定，但在高温条件下传代该品系时） &gt;16°C 将筛选出发生转基因自发缺失的稀有蠕虫，从而获得Aβ表达降低且麻痹进程较慢的变异个体。
<img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="随时间变化的麻痹百分比曲线；咖啡因处理组与未处理组数据对比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 菌株CL4176线虫在未处理或暴露于6.27 mM咖啡因（Sigma）条件下的麻痹曲线。 所示时间点从升温处理开始时计起。误差棒 = 标准误（S.E.M）。
<img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="咖啡醇处理效果图表，未瘫痪百分比随时间变化，比较分析，数据可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. CL4176 蠕虫暴露于 0.48 mM 咖啡醇（Sigma）后的瘫痪曲线。 误差条 = 标准误（S.E.M）。

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们所描述的方案可有效用于检测化合物对Aβ毒性的效应。已发表的实例包括银杏叶提取物成分（Wu et al. 2006）和利血平（Arya et al. 2009）的作用。在其他系统中已被证明对Aβ毒性具有保护作用的化合物，在此模型中也显示出保护效应（例如，美金刚，我们的未发表结果）。建立该模型的一个重要依据是，秀丽隐杆线虫（C. elegans）中已成熟的遗传学和分子生物学工具可用于研究Aβ毒性的机制。因此，可利用该模型检测特定突变对Aβ毒性的效应（例如，通过引入daf-2功能缺失突变以降低类胰岛素信号通路活性的影响，Florez-McClure et al. 2007），也可用于考察过表达转基因的影响（Fonte et al. 2008）。我们近期已广泛使用该模型来研究Aβ中单个氨基酸替换对毒性的效应（未发表数据）。
本文所述的转基因模型用于检测急性Aβ表达对肌肉细胞功能的影响。在出现麻痹时，肌肉细胞及其肌节结构保持完整；该麻痹表型并非由肌肉细胞死亡所致。然而，在麻痹发生后（约初始升温后48小时），肌肉完整性逐渐破坏，最终导致线虫死亡。我们尚未研究Aβ表达的这一下游效应，也未将其用作毒性标志物。
此处描述的可诱导Aβ表达模型不适用于研究直接调节β-淀粉样蛋白形成的治疗方法。尽管组成型表达Aβ的转基因线虫可形成易于检测的淀粉样蛋白沉积（Fay et al. 1998；Link et al. 2001），但可诱导Aβ表达的转基因线虫极少出现淀粉样蛋白沉积，且瘫痪表型似乎与淀粉样蛋白沉积无关（Drake et al. 2003）。我们的结果支持以下观点：诱导Aβ表达所产生的急性毒性源于可溶性寡聚体Aβ的积累，而非淀粉样蛋白沉积。

<table><tbody><tr><td>氯化钠 (6g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>琼脂 (40g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨 (5g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2mL)</td><td></td><td></td><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 147.02mg/mL</td></tr><tr><td>尿嘧啶 (2mL)</td><td></td><td></td><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 2mg/mL</td></tr><tr><td>胆固醇 (2mL)</td><td></td><td></td><td>乙醇中 5mg/mL（勿高压灭菌）</td></tr><tr><td>1M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (2mL)</td><td></td><td></td><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 246.5mg/mL</td></tr><tr><td>1M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (50mL)</td><td></td><td></td><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中 98mg KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/mL，48mg K2HPO4/mL，pH</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用转基因 c. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

通常认为，β-淀粉样肽（Aβ）的积聚是阿尔茨海默病发生的核心因素，但其毒性作用的相关机制仍不明确。Aβ 也在包涵体肌炎（一种严重的人类肌病）中出现肌肉内沉积。广泛研究的线虫 Caenorhabditis elegans 可通过转基因技术表达人源 Aβ。根据 Aβ 表达的组织或时间不同，转基因线虫可表现出易于测量的表型，从而作为 Aβ 毒性的读出指标。例如，神经元广泛表达 Aβ 的转基因线虫在联合学习方面存在缺陷（Dosanjh 等. 2009），而组成性肌肉特异性表达 Aβ 的转基因线虫则表现出进行性、年龄依赖性的瘫痪表型（Link, 1995；Cohen 等. 2006）。一种特别有用的 C. elegans 模型利用 mRNA 监控系统中的温度敏感型突变，实现 Aβ 转基因的温度诱导性肌肉表达，升温后可产生可重复的瘫痪表型（Link 等. 2003）。在此模型中，能够拮抗 Aβ 毒性的处理方式（例如表达保护性转基因（Hassan 等. 2009）或暴露于银杏叶提取物（Wu 等. 2006））可重复性地改变这些转基因线虫在升温后所诱导的瘫痪速率。本文中，我们描述了在此转基因 C. elegans 模型中测量瘫痪速率的实验方案，特别关注可能影响该测量结果的实验变量。

被广泛研究的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可通过转基因技术表达人类β-淀粉样蛋白肽（Aβ）。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）肌肉中诱导表达Aβ会导致快速且可重复的麻痹表型，可用于监测调节Aβ毒性的治疗方法。

使用转基因 C. elegans 模型检测β-淀粉样蛋白毒性

β-淀粉样蛋白肽（Aβ）的积聚通常被认为是诱发阿尔茨海默病的核心因素，但相关……

以下实验的总体目标是在活体模型系统中检测β-淀粉样蛋白肽的毒性。该检测方法具有可重复性强和相对简便的特点，可快速测试药物、环境条件或遗传修饰对β-淀粉样蛋白毒性的影响。建立该检测方法的关键在于构建转基因秀丽隐杆线虫，使其在肌肉组织中温度诱导特异性表达β-淀粉样蛋白肽。这种温度敏感性表达是通过构建一个包含异常长的3'非翻译区的转基因来实现的，该3'非翻译区使转基因mRNA成为mRNA监控系统的靶标。因此，在具有功能性mRNA监控系统的野生型线虫中，由于转基因mRNA被降解，其表达水平较低。如果将该转基因引入到mRNA监控系统关键组分存在突变的遗传背景中，则转基因的表达水平将显著升高。若该遗传背景在mRNA监控系统中含有温度敏感性突变，则在非允许温度下培养该转基因品系时，可阻断转基因mRNA的降解，从而导致高水平的转基因表达。利用该系统调控体壁肌中β-淀粉样蛋白肽表达的转基因线虫，当温度从16摄氏度升高至25摄氏度时，会导致β-淀粉样蛋白肽大量积累、肌肉细胞功能障碍以及线虫瘫痪。对该过程的时间进行测量。需要一定数量的这种产沟道蠕虫在温度升高后才会出现瘫痪现象。温度上调后的瘫痪实验是检测β-淀粉样蛋白毒性的敏感方法。为此需制备新鲜的线虫生长培养基平板用于瘫痪实验，以尽量减少可能影响瘫痪率的环境变量。第二步，启动年龄同步的转基因线虫群体，以最大程度减少发育阶段对转基因表达的影响。随后，将同步化的三龄幼虫从16摄氏度升温至25摄氏度，以提高转基因mRNA的稳定性，并促进β-淀粉样肽的积累。通过测量每条线虫从升温到瘫痪的时间，可反映肌肉功能障碍的速率，从而评估β-淀粉样肽积累所产生的毒性效应，获得的结果可用于显示特定处理对内源性表达的β-淀粉样肽毒性的干预作用。因此，与使用转基因小鼠模型来检测药物活性相比，我们的技术主要优势在于操作更快速，且成本显著降低。该方法的可视化演示至关重要。在麻痹检测实验中，对L4期线虫进行评分非常难以掌握。因此，当你对一条L4期瘫痪的线虫进行评分时，需要观察的是线虫头部区域孤立的晕轮样运动。一旦观察到头部在运动而线虫整个身体处于瘫痪状态，就将该线虫记为瘫痪。瘫痪实验通常在标准线虫培养基（NGM）平板上进行，这种培养基常规用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的繁殖和遗传学研究。制备平板时，将含有氯化钠、琼脂和肽的NGM溶液置于锥形瓶中进行高压灭菌，然后加入适量的以下无菌溶液，这些溶液的详细信息见随附的书面实验方案。将10毫升液态NGM分装至每个60毫米×15毫米的培养皿中。于室温下静置过夜，使NGM完全凝固。若需检测化合物或提取物的效果，可将提取物等分试样加至每个平板上，并使用涂布棒将其均匀涂布于平板表面。将平板在室温下过夜干燥。超过一毫升的体积需要更长的干燥时间。接下来，在每个平板上点样250微升在LB培养基中过夜培养至光密度为0.4至0.6的大肠杆菌OP50菌株，于室温下静置过夜使细菌干燥。平板的存放时间对麻痹率有显著影响，存放时间较长的平板容易干燥。平板应在进行麻痹实验前一周内制备。理想情况下，应使用在同步产卵前 3 到 4 天制备的平板。任何实验中所用的同步产卵平板均应来自同一批次。改变菌苔的大小或细菌种类也会影响线虫的行为。麻痹实验可使用其他大肠杆菌菌株进行，例如 RNAi 实验中常用的 HT115 菌株。然而，这可能会改变麻痹实验的动力学过程。因此，必须使用合适品系的内参对照。CL 476 是最常用于检测 β-淀粉样蛋白诱导麻痹的品系。该品系及其他转基因模型可由圣阿哈迪遗传中心以少量费用向学术研究人员提供。为了最大程度地提高测试群体的年龄同步性，建议从经过同步化的亲代开始。在启动测试群体的麻痹实验前一周，使用铂金线虫挑取器将20至30只成年线虫转移到多个10厘米的NGM平板上。在16摄氏度（CL4176的允许温度）下，使用OP50平板进行两小时产卵。移除亲代成虫，让子代生长七天，此时它们将发育为第二日成虫。第二日成虫。使用成虫为每种实验条件制备年龄同步的测试种群。目的是使用铂金线虫挑取器，将10至12只产卵第二天的成年线虫转移到已接种OP50的大肠杆菌并直径为60毫米的NGM平板上，制备三个重复的平板，每个平板中含有50至75条年龄同步的线虫。将线虫在16°C条件下放置2小时，使其产卵，随后移除成虫，让卵在16°C下孵化并继续生长。此时，最好由不参与平板评分的人员对平板进行编码，以确保评分者对实验条件保持盲态。卵子产出时的胚胎发育阶段（在最佳条件下，野生型线虫约为26细胞期）取决于成虫的年龄和营养状况。如果用于产卵的重力成虫年龄较大或处于饥饿状态，则产出的卵发育阶段会较晚，无法获得同步化的群体，从而影响麻痹实验的动力学结果。必须使用单基因细菌培养物（如大肠杆菌 OP 50），因为任何形式的细菌污染都可能严重影响本实验。为诱导转基因并进行麻痹检测，若三个重复平板中的线虫数量相近，则实验可重复性最高。将平板转移至 25 摄氏度环境中。同步产卵结束后48小时，线虫应发育至第三幼虫阶段。培养板应置于25摄氏度培养箱中，避免叠放，以确保培养板充分达到该温度。同时，在温度上调开始后18至20小时，开始对线虫的麻痹表型进行评分。此时，种群中的所有线虫应已发育至第四幼虫阶段，继续以每两小时为间隔进行评分，直至每个培养皿上的所有线虫均出现麻痹。由于未知原因，麻痹现象在虫体长度方向上并不均匀，头部区域是线虫最后停止运动的部分。因此，刚出现麻痹症状的线虫无法在培养皿上移动，但仍能摆动头部，从而清除其身体前部周围的细菌，形成一圈无菌区域（透明圈）。这些线虫最终将不可避免地完全麻痹，因此具有透明圈的线虫被判定为已麻痹。部分线虫虽无透明圈，但也未表现出自发运动。通过使用线虫挑取工具轻触线虫进行检测。若轻触后线虫无法完成全身波浪式运动，则记为瘫痪，以实现高效评分。为避免在下一轮评分时被无意中重复评分，最简便的方法是将已瘫痪的线虫移至培养皿上无菌斑的区域。这还能使分类错误的线虫表现出运动，从而通过评分校正生成麻痹曲线。在每个时间点，将每块培养板上未发生麻痹的线虫比例转换为百分比，并将平均未麻痹百分比对升温开始后的时间作图。所得曲线在形式上类似于生存曲线，因此可采用标准的非参数生存统计方法进行分析。为了启动瘫痪表型，必须在转基因 myo three A beta 蠕虫发育至中期 L4 阶段前完成升温处理。myo three 启动子具有发育阶段特异性调控特性。一旦蠕虫进入晚期 L4 阶段或成虫阶段，其表达水平将显著下降。如果线虫处于饥饿状态，外源基因的表达会被抑制，因此在整个实验过程中必须确保线虫得到充分喂养。我们从未观察到任何瘫痪的线虫在任何条件下恢复活动。在升温处理12至16小时后，CL 41 76线虫将出现瘫痪，无论是否将其转移回16摄氏度的环境中；在CL 41 76菌株中，导致瘫痪的外源基因表达上调可在较低温度下发生。然而，请注意，麻痹发生率的时间进程会受到影响。麻痹发生率取决于所使用的特定转基因品系。我们已构建了 myo-3::Aβ 品系，其麻痹发生率快于或慢于 CL4176 品系；因此，您需要相应调整麻痹实验的观察时间窗口。此处显示的是 CL 4 1 76 的麻痹曲线图，包括未经处理和暴露于 6.27 毫摩尔咖啡因的条件。该处理导致麻痹时间显著延迟约四小时，且具有高度统计学意义，我们将其解释为表明 β 毒性受到抑制。在此模型中，本实验检测了咖啡中另一种化合物的影响。该曲线图是那些不影响β毒性的处理的典型表现。注意，在这两个实验中，约一半未经处理的CL 4 1 76种群在24小时时已出现瘫痪，到28小时时瘫痪达到完全。这些是对照组瘫痪的典型时间范围。CL 4 1 7 6 种群在此时间点上的显著偏差表明环境条件发生改变或转基因拷贝发生自发性缺失。有关 CL 4 1 7 6 品系的更多信息，请参见配套的实验方案。在进行该实验操作时，需注意培养板的使用时间、线虫种群的发育阶段，以及对线虫麻痹率进行准确评分的能力。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何利用这种海蜗牛系统来精确检测β-淀粉样蛋白的毒性。您将能够检测出多种环境因素或药物处理对该毒性产生的细微影响。我们讨论过的这些变量非常重要，需加以注意，因为这将使您能够高度可重复地进行检测，并获得一致的麻痹动力学结果。如果希望比较不同时间、不同人员在本实验室获得的结果，或比较使用该模型系统的其他研究人员的结果，这一点实际上非常重要。

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含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型

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