从Midgastrula舞台果蝇胚胎神经文化的制备

这个视频演示midgastrula阶段果蝇胚胎的主要神经文化的准备。生活文化的意见表明电镀和后2天在碳酸氢盐为基础的定义中等的增长有区别的神经元细胞1小时后。神经元电兴奋，并形成突触连接。

我叫 Diana Dowd，是加州大学欧文分校发育与细胞生物学系以及解剖学和神经生物学系的教授。今天，我将演示从果蝇胚胎制备原代神经元培养物。这实际上需要从中消化阶段（果蝇胚胎）中取出所有细胞，并将它们放入细胞培养中。

我们使用这些培养物的目的是真正了解哪些基因和环境因素对于调节果蝇神经元之间的电兴奋性和突触传递很重要。要开始此过程，我们必须收集果蝇胚胎。为此，我们取鸡蛋收集板，在上面涂抹一点酵母糊。

它是成年果蝇产卵的有利基质。我们将这些盘子放在装有成蝇种群的瓶子上，通常为 100 到 200 只苍蝇。然后我们让苍蝇、成年苍蝇产卵大约两到三个小时。

然后我们取出鸡蛋收集板，这些是我们用于培养程序的胚胎。该程序的下一步是对胚胎进行 Dec 涂层，这意味着我们实际上会去除 corion。我们通过将胚胎洗到 Buechner 漏斗中来做到这一点，漏斗上有一张滤纸，以便它能捕捉胚胎。

我们允许它们放在 50% 漂白剂溶液中的 Buchner 漏斗中。这种 50% 的漂白剂溶液不仅可以溶解果酱，还可以作为我们灭菌程序的一部分。我们实际上不是在通风橱里做这个手术，而是在通风橱外面，所以胚胎一旦脱氯，我们就把它们洗到培养皿中。

实际上，当可丽耐消失时，viel 膜非常粘稠，它会很好地粘在培养皿上。然后，您可以将蒸馏水倒在它们上面，然后去除蒸馏水两到三次，实际上只需将水扔掉，胚胎就会粘在培养皿上。不要使用组织培养塑料培养皿。

他们不坚持这一点。我们通过取胚胎的培养皿并将其放入层流罩中来开始程序的无菌部分。这些是 bellco 封面单。

它们没有涂层，但它们已经被高压灭菌，没有被清洗。我们发现它们效果不佳。当它们被清洗时，我们通常会取出四个盖玻片，并将它们放入一个培养皿中。

因此，我们将在每个培养皿中制作四个胚胎培养物。好的，培养皿基本上已经准备好了，我们可以开始培养了，我通常做 12 个培养物，一次做 12 到 16 个培养物。好？我们使用的培养基是一种相对简单的定义培养基。

它是 A-D-M-E-M 基础，我们每两周配制一次这种液体培养基，这样它在冰箱中就可以保存两周了。这已经被消毒了。它经过 0.2 微米无菌过滤器，然后我们向培养基中添加五种补充剂。

它们每两个月制备一次，然后以等分试样冷冻，加入 10 密耳的液体培养基中。所以我们只是删除内容。最后一个，然后这只是，我们只需轻轻地反转这个媒体以混合它，然后我们就可以开始了。好。

一切都已准备就绪。我的培养皿已经准备好了，或者我的培养皿里有四个盖玻片，可以准备好了。现在我要拿我的带有胚胎的盘子，我要这样做，它们现在正放在蒸馏水中。

我要通过甩掉蒸馏水来去除它。这就是我直接进入垃圾桶的方法。现在我要将大约两研磨的培养基倒在这些胚胎上，现在它们已经准备好了，我可以将玻璃针插入单个胚胎中并去除内容物。

你必须让媒体在外面。显然，如果外面有水，那么你就会有渗透压休克。现在，为了在去除胚胎内容物之前准备培养物，我实际上将 5 微升滴剂滴在盖玻片上。

如果放置时间过长，则培养基的 pH 值会发生变化。好了，现在我要在四个盖玻片的中心滴一滴 5 微升。实际上，重要的是这些滴剂要尽可能保持完整。

如果培养基遍布盖玻片，则细胞被接种成一些，很难形成一层非常薄的液体。您希望 em 将细胞接种到一滴漂亮的圆形液体中。正如你所看到的，我们已经准备好了四滴漂亮的圆形液体。

现在，我将拿起我拉出的一根移液器，然后将其连接到这个口腔移液器管上。您可以使用任何您想要的管子，但这个管子的好处是，它实际上配备了 VWR 管校准的 100 微升移液器。在这些产品中，这里有一个小橡胶垫圈。

我可以将口腔移液器（我的意思是玻璃移液器）插入移液器的这一端。然后，当我吸吮胚胎的内容物时，我不会再往上走了，这个区域开始变窄了。所以有一个巨大的区域将我用鼠标抽吸将我和细胞所在的地方分开。

所以没有，没有污染的问题。如果你不小心把里面的东西吸到这个区域，那么你就会遇到巨大的污染问题。在我们的层流罩中，我们有基于显微镜的解剖显微镜。

这允许光线从胚胎下方进入，这使我们能够真正看到头部沟和中肠，以及当我们观察实际胚胎时会看到的想象力。这就是我们实际挑选出对培养以去除胚胎内容物很重要的胚胎阶段的方法。我们使用玻璃移液器，拉上一个普通的微电极拉拔器，我们用它来制作我们的膜片记录移液器。

我们并不真正关心设置是什么。我们拉出相当细的移液器，因为我们要在胚胎旁边的培养皿中以我们真正想要的大小折断移液器。然后，我们取这些玻璃移液器，将它们插入胚胎的 viel 膜，并使用连接到移液器背面背面的口腔吸管。

然后我们提取整个胚胎的内容物。然后，我们将其移走，取出移液管，移入另一个培养皿中，该培养皿有一个盖玻片，上面有一滴 5 微升的培养基。我们将胚胎的内容物排出到那 5 微升的液滴中。

我们上下移液数次以分散细胞，然后让盖玻片在培养皿中放置约 10 分钟，然后用两研磨的培养基淹没培养皿。将细胞铺板后的培养皿放入 5%CO2 培养箱中。这一点非常重要，因为我们使用的介质是碳酸氢盐缓冲介质。

我们那里有一些 HEP，但不足以在空气环境中缓冲。因此，您必须使用 5% CO2 培养箱。但是，它必须在 22 到 23 度左右的相对较低的温度下是理想的。

因此，我们采用哺乳动物培养物中使用的标准 CO2 培养箱，将其加热到 37 度。我们所做的是关闭加热器，将其放在实验室中，我们可以在培养箱底部放冰，从而将温度保持在 21 到 25 度左右。我们使用的另一种技术是，再次采用这些标准加热 CO2 培养箱之一，然后将培养箱放在冷藏室中。

然后，如果环境温度是寒冷的室温，您实际上可以非常有效地将培养箱加热到 23 度。所以这就是我们用来拥有标准海豹的两种方法，哺乳动物海豹孵化器让自己生存。好吧，这是一种 1 小时前以与我们电镀 1 小时后立即看到的相同放大倍

在这里，我们看到神经元已经分化了大约两天。在培养中，神经母细胞分裂了一次或多次，然后产生了神经元，神经元扩展了形成广泛重叠神经网络工作的过程。这里我们有两个头对头的细胞体。

顶部是 11 点钟位置的 extend a process，底部是 5 点钟位置的 extended a process off。这些是他们的主要扩展。然后你可以看到它们形成更细的分支。

这些过程非常紧密地粘附在玻璃基板上，并且您可以看到来自其他细胞的一些过程也与这些过程重叠。这些是潜在的突触连接的部位。我们会修补其中一个细胞，一般来说，通过这种级别的过程阐述，它们将具有突触功能性突触电流。

现在，我们的细胞在铺板 12 小时后在培养物中生长。他们将扩展相当不错的流程。我们的标准生理学，我们在培养后开始做大约 1 到 2 次。

你可以看到，他们实际上在接下来的四五天内继续生长过程。我们已经记录了细胞在培养中长达两周的时间，但我们的大部分记录是在使用这些培养物培养的 2 到 6 天之间，然后我们刚刚从中段胃阶段的果蝇胚胎中制备，我们有在培养中交流的神经元网络。我们能够实际观察这些细胞的放电特性。

它们具有不同的烧制特性。它们有，它们重复放电，一些细胞重复放电，其他细胞在出生时放电，这些细胞主要是胆碱能或 GABA 能的。我们观察，我们可以观察由这些介导的突触电流，包括烟碱、Aach、H 受体和 GABA 受体。