Name: 膜片钳和灌注技术研究离子通道的表达爪蟾卵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习膜片钳和灌注技术研究BK离子通道在Xenopus卵母细胞中的表达与激活。该方法通过mRNA注射表达通道蛋白，精确控制电压和钙离子浓度，为神经科学研究提供重要技术支持。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01-HL70393 和 R01-NS060706 的支持，资助对象为 J.C。J.C. 是斯宾塞·T·奥林教席资助下的生物医学工程教授。

1. 将 mRNA 注射到卵母细胞中
<ol>
	<li>注射0.05 - 50 ng体外转录的信使RNA 体外 进入 Xenopus laevis 使用 Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific Company，型号 3-000-204）对卵母细胞（V–VI 期）进行显微注射，每种 mRNA 重复注射约十二个卵母细胞。</li>
	<li>用ND-96溶液（96 mM氯化钠（NaCl，Mr 58.44 g/mol），2 mM氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），1.8 mM氯化钙（CaCl2•2H2O，Mr 147.02），1 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2.5 mM 丙酮酸钠（Mr 110.04 g/mol）和1×青霉素-链霉素，调pH至7.6，然后置于培养板中，在培养箱中孵育 18°C 超过 2 天。</li>
</ol>
2. 准备灌注系统
<img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="灌流系统示意图，包含氮气、溶液储液罐、电子阀门和灌流笔。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> Automate ValveLink 16 灌流系统的示意图。该灌流系统利用加压氮气将灌流液从溶液储液罐中推出，流经灌流管路，最终到达灌流笔和灌流尖端。每一路灌流液的流动均由一个储液罐阀门和一个电子阀门共同控制。在本实验方案中，其中一个储液罐未加压，同时作为废液收集器和泄压装置。（图片改编自厂商网站 http://www.autom8.com）
<ol>
	<li>将管路连接至灌流笔。打开电子阀控制器并开启电子阀。</li>
	<li>为确保管路和灌流笔无堵塞和气泡，使用装有去离子水的注射器将去离子水推过每根管路。</li>
	<li>将管路连接至溶液储液罐，并打开氮气瓶阀门以通入加压氮气。</li>
	<li>打开储液罐阀门，使储液溶液充满管路。如有需要，轻弹储液罐阀门以去除溶液中的气泡。管路充满溶液后，关闭阀门。</li>
	<li>用水填充灌注头，然后将其拧到灌注笔上。连接灌注头时注意避免产生气泡。</li>
	<li>使用油泥将灌流笔固定在浴槽台上，确保灌流尖端位于浴槽空间内。灌流系统现已安装完毕。</li>
	<li>向浴槽中加入去离子水，确保灌流尖端浸没在水中。</li>
	<li>测试每种灌流液是否从灌流尖端正常流出。关闭连接至废液收集管的电子阀，依次打开一种灌流液的阀门（140 mM 氢氧化钾（KOH, Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），1 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA，Mr 380.35 g/mol），使用甲基磺酸（MeSO₃H）调节 pH 至 7.1–7.23，Mr 96.1 g/mol），Ca2+ 或根据需要将 Mg²⁺ 添加至所需浓度）。在显微镜下观察灌流液从灌流尖端流出的液流。关闭灌流液阀门，打开废液收集器阀门，此时灌流液流应几乎消失。对所有灌流液重复此测试。</li>
	<li>当确认所有灌流液均能正常流动后，将浴槽中的去离子水替换为浴液（140 mM 氢氧化钾（KOH，Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），用甲磺酸（MeSO₃H）调节 pH 至 7.1–7.23，Mr 96.1 g/mol)</li>
</ol>
3. 膜片钳技术
<ol>
	<li>每次进行膜片钳实验前，需用氯化银重新涂覆银记录电极。首先，将电极导线从移液管支架中取出，并将电极导线的尖端一半浸入装有新鲜次氯酸钠溶液的小瓶中，至少浸泡15分钟。此步骤可在导线上沉积一层氯化银。</li>
	<li>用去离子水冲洗电极导线，然后用吸水纸轻轻吸干。随后将银/氯化银电极重新安装回移液管支架中。</li>
	<li>将浴槽（参考）电极连接至放大器探头，并将其放入浴液中。此操作为记录电极做好准备。</li>
	<li>现在准备数据采集。打开计算机，并将硬件密钥插入计算机的打印机端口。必须插入硬件密钥才能使用数据采集软件HEKA Pulse。</li>
	<li>打开放大器（Axon Instruments，AXOPATCH 200B），并启动HEKA Pulse软件。加载实验协议文件，并调整配置设置，例如刺激量程。调整配置设置的目标是确保测试电位与指令电位完全一致。此步骤为数据采集设备做好准备。</li>
	<li>准备卵母细胞。将卵母细胞浸入剥离溶液中（200 mM N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG，Mr 195.22 g/mol），200 mM 天冬氨酸（无K+）（Mr 133.1 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），10 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA，Mr 380.35 g/mol），1 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），用氢氧化钠（NaOH，Mr 40.0 g/mol）调节pH至7.4），处理5–10分钟。该剥离溶液可使卵黄膜与质膜分离，从而便于去除卵黄膜。</li>
	<li>使用两对镊子轻轻将卵黄膜从卵母细胞上剥离。去膜后的卵母细胞极为脆弱，因此应尽量减少移动。</li>
	<li>注意避免使去膜后的卵母细胞暴露于空气或气泡中，使用装有足够溶液的玻璃移液管将卵母细胞转移至浴槽中。此操作为记录做好准备。</li>
	<li>制备膜片移液管。将玻璃毛细管（VWR International，货号 # 53432-921）插入Sutter P-97 Flaming/Brown微管拉制仪中，拉制玻璃移液管。在显微镜下观察移液管，确定其尖端形状和开口直径。开口直径应为2–4微米。</li>
	<li>为减少记录过程中的电容电流并确保尖端光滑，需用石蜡涂覆尖端，然后进行火焰抛光。</li>
	<li>将移液管尖端浸入移液管溶液（140 mM 氢氧化钾（KOH，Mr 56.1 g/mol），20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，Mr 238.31 g/mol），2 mM 氯化钾（KCl，Mr 74.56 g/mol），2 mM 氯化镁（MgCl2•6H2O，Mr 203.31 g/mol），用甲磺酸（MeSO3，Mr 96.1 g/mol）调节pH至7.1–7.2）中，通过抽吸活塞使溶液进入尖端。此操作可润湿尖端。</li>
	<li>使用注射器将移液管溶液填充至移液管约三分之一处，并将移液管放入移液管支架中，确保内部的银/氯化银电极与移液管溶液接触。此操作完成膜片移液管的准备。</li>
	<li>为从已准备好的卵母细胞上切取内面向外膜片，需在显微镜下找到卵母细胞的清晰边缘。使用操纵器将膜片移液管移近卵母细胞。记录移液管的串联电阻。当移液管充满移液管溶液并浸入浴液中时，理想的串联电阻应在1–1.5 MΩ之间。</li>
	<li>缓慢将移液管推向卵母细胞，直至电阻大约增加一倍。</li>
	<li>通过连接至移液管支架的吸管用嘴施加轻微负压，直至形成吉欧姆级密封。通过在-30 mV电压下钳制数分钟使膜片稳定。</li>
	<li>为获得内面向外膜片，需快速将移液管进一步推入卵母细胞，然后轻轻拉出，以切下膜片。</li>
	<li>内面向外膜片现已准备好用于钳制。将持有该膜片的移液管移至灌流管尖端开口约100微米处。</li>
	<li>关闭废液收集的电子阀，打开所需灌流溶液的储液阀。</li>
	<li>开始记录跨膜电流。根据需要改变电压和灌流溶液。</li>
	<li>记录完成后，通过推动去离子水冲洗灌流管路、笔状电极和尖端，以防止堵塞。</li>
</ol>
4. 典型结果
在进行膜片钳实验的卵母细胞制备过程中，使用剥离液处理5-10分钟可使卵黄膜与质膜分离，从而实现卵黄膜的剥离。
当灌注电极内液并浸入浴液中时，膜片钳电极的理想串联电阻应在1-1.5 MΩ之间。
以下是卵母细胞膜片上野生型BK通道的代表性记录。左上方的方波表示施加于膜片的电压——第二个电压阶跃从50 mV增加至200 mV，增幅为50 mV。下方为灌流液中名义上无Ca2+（游离[Ca2+]约为0.5 nM）时相应的电流轨迹。电流幅度的增加表明BK通道的开放概率随电压升高而增大。右侧显示在相同电压刺激下，同一膜片在灌流1.0 μM Ca2+时的记录结果。在相同电压下电流幅度进一步增大，表明通道开放概率也随[Ca2+]升高而增加。 <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="不同钙离子浓度下钙离子电流的电压钳制图，显示电生理结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
<li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li>
<li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mg2%2B+enhances+the+function+of+BK-type+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li>
<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
<li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2%2B-dependent+activation+of+BK-type+mslo1%5BTitle%5D)+AND+%22K%2B+channels.+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li>
<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

卵母细胞表达系统因其内源性离子通道背景信号相对较低，是进行电压门控离子通道电生理学表征的理想选择。此外，由于该系统属于瞬时表达系统，因此为开展这些通道的突变研究提供了高效的方法。然而需要注意的是，卵母细胞表达系统与哺乳动物细胞系统存在差异，因此在翻译后修饰以及与不同亚基的结合方面可能存在区别。此外，两种细胞间的脂质浓度可能存在差异，从而影响离子通道的功能特性。
每次实验后，应使用去离子水清洗灌流管路、笔形电极和探头，以防止堵塞。务必使用新鲜的漂白剂处理银电极丝，确保其表面被氯化银覆盖，否则记录结果将不准确。调整数据采集的配置设置，使测试电位与指令电位完全相等。保持膜片钳电极清洁有助于实验，因此应使用盖子保护其免受污染，并仅在使用前进行火焰抛光。

<table><tbody><tr><td>Nanoject II 自动纳升级注射器</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>灌流系统及电子控制器</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>灌流尖端内径：100 微米</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>计算机接口</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>前置放大头级</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

膜片钳与灌流技术在研究离子通道表达中的应用 非洲爪蟾 卵母细胞

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

本文所述方案旨在研究大电导、电压门控及钙激活钾通道（BK通道）的激活机制。该方法通过膜片钳技术记录单个通道或全细胞电流，以分析通道在不同膜电位和胞内钙浓度条件下的开放特性。首先，将表达目标通道蛋白的细胞固定于记录槽中，并使用含适当离子成分的灌流液维持生理环境。随后，通过移液管形成高阻封接，并根据实验需求采用细胞贴附或全细胞记录模式。在记录过程中，施加阶梯式电压脉冲以评估电压依赖性激活，并同步调控灌流液中的Ca²⁺浓度，以探究钙离子对通道活性的调节作用。采集的电流信号经放大、滤波后由数据采集系统储存，并利用专用软件进行离线分析，包括电流-电压关系曲线绘制、激活曲线拟合及动力学参数计算。本方案可系统地揭示BK通道在电压与钙双重调控下的门控行为，适用于通道突变体功能研究及药理学评估。 

关键词：BK通道，膜片钳技术，电压门控，钙激活，离子通道功能分析，电生理记录，通道门控行为2+激活的K+ （BK）通道。该方案也可用于研究其他离子通道和神经递质受体的结构-功能关系1BK通道在不同组织中广泛表达，参与多种生理功能，包括调控平滑肌收缩、内毛细胞的频率调谐以及神经递质释放的调节2-6BK通道由膜去极化和细胞内Ca²⁺激活2+ 和 Mg2+ 6-9因此，本方案旨在同时控制膜电压和细胞内溶液。在本方案中，将编码BK通道的信使RNA注入 非洲爪蟾 V-VI期卵母细胞，随后在18°C下培养2-5天10-13采用膜片钳技术，以细胞内侧朝外构型分离出含有单个或多个BK通道的膜片10-13记录过程中，用所需溶液灌流膜片的胞内侧，以检测不同条件下通道的激活情况。综上所述，将BK通道的mRNA注入 非洲爪蟾 卵母细胞用于在卵母细胞膜上表达通道蛋白；采用膜片钳技术，在受控的电压和细胞内溶液条件下记录通过通道的电流。

使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus oocytes注射信使RNA来表达BK通道。膜片钳记录过程中，细胞内溶液由灌流系统控制。

本方案旨在研究大电导、电压和Ca2+激活的K+（BK）通道的激活机制。该方案可能……

本实验的总体目标是在控制电压的同时控制细胞内溶液的条件下，记录BK通道的激活情况。首先通过向非洲爪蟾卵母细胞注射BK通道mRNA来表达BK通道，以实现这一目标。实验的第二步是准备灌流系统。该实验步骤的第三步是在卵母细胞膜与膜片电极之间形成吉欧封接。实验的最后一步是分离膜片。最终，通过膜片钳技术结合灌流系统获得的结果表明，BK通道可被电压和钙离子浓度的变化所激活。大家好，我是来自华盛顿大学Jamie Zus博士实验室的Jin Cho Young。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，包括关于离子通道激活的分子机制的问题。现在，让我们开始吧。该实验步骤的第一步始于膜片钳记录前的几天，使用体外转录的BK通道mRNA。在获取非洲爪蟾（Xenopus Lavu Cytes）第五至第六阶段的卵母细胞后，向每个卵母细胞中注射0.05至50纳克的BK通道mRNA。使用Nanoject II自动纳升注射仪进行注射。每种mRNA注射后，需在十余个卵母细胞上重复注射操作。使用ND 96溶液将卵母细胞冲洗两次。随后将卵母细胞放入培养皿中，在18摄氏度条件下孵育两天或更长时间，以使卵母细胞充分表达BK通道。经过两到五天的孵育后，卵母细胞应已表达BK通道，因此已可进行膜片钳实验。在处理卵母细胞之前，需先准备好膜片钳所需的其他所有设备，首先设置灌流系统。此处展示的系统为自动阀连接装置。16 个灌注系统通过加压氮气将灌注液从溶液储液罐经灌注管路推入灌注笔和笔尖。每一路灌注液的流动均由一个储液罐阀门和一个电子阀门控制。在本方案中，其中一个储液罐未加压，用作废液收集器，同时也作为压力释放装置。可在实验前配制不同浓度钙或镁的灌流液。将灌流液加入储液瓶中，并对每个储液瓶进行标记，注明钙或镁的浓度。首先搭建灌流系统，将管路连接至灌流笔。然后打开电子阀门控制器，并开启电子阀门，确保管路和灌注笔无堵塞和气泡。使用装有去离子水的注射器将去离子水推过每根管路。此时，将管路连接至溶液储液瓶，并打开氮气钢瓶阀门，向系统施加氮气压力。打开一个储液阀，使储液溶液充满管路。如有需要，点击储液阀以去除溶液中的气泡。待管路充满溶液后关闭储液阀，用水填充灌流尖端，并将其旋紧到灌流笔上。注意不要引入气泡。连接尖端时，使用油灰将灌流笔固定在浴槽支架上，并确保灌流尖端位于浴槽空间内。灌流系统现已安装完毕。此时，向浴槽中加入去离子水。确保灌流尖端浸没在水中。测试每种灌流溶液是否均能从灌流尖端正常流出。关闭连接至废液收集管路的电子阀门，打开其中一种灌注液的阀门。在显微镜下观察从灌注尖端流出的灌注液射流。关闭该灌注液的阀门，打开废液收集器的阀门。灌流液流应几乎消失。对每种灌流溶液重复进行相同的测试。当确认所有灌流溶液均正常流动后，将浴槽中的去离子水替换为所需的浴液。现在开始设置记录装置。每次进行膜片钳实验前，应使用氯化银重新涂覆银制记录电极。首先，将电极丝从移液器支架中取出，并将电极丝尖端的一半浸入装有新鲜次氯酸钠溶液的小瓶中，至少浸泡15分钟。在导线上沉积一层氯化银。用去离子水冲洗电极导线，并用吸水纸吸干。然后将银/氯化银电极重新安装到移液管支架中。现在打开计算机。将硬件密钥插入计算机的打印机端口。必须插入硬件密钥才能使用数据采集软件，即 HEA 脉冲软件。打开放大器并启动数据采集软件。HEA 脉冲。加载协议文件，并调整配置设置，例如刺激量程。调整配置参数的目标是确保测试电位与指令电位完全相等。现在我们准备开始制备卵母细胞。从培养箱中取出卵母细胞。将卵母细胞浸入剥离液中5到10分钟。剥离液可使卵黄膜与质膜分离，从而能够去除卵黄膜。5到10分钟后，轻轻将卵黄膜从卵母细胞上剥离。使用两把镊子。受精卵分裂位点极为脆弱，因此应尽量减少移动。注意避免使受精卵暴露于空气或气泡中，使用装有足量溶液的玻璃移液管将卵细胞转移至浴液中。卵母细胞膜上的通道现已暴露，可进行膜片钳记录。将玻璃毛细管插入微电极拉制仪中，以拉制膜片钳电极。在显微镜下观察电极，确定其尖端形状和开口直径。开口直径应为2至4微米，以减少记录过程中的电容电流，并确保尖端光滑；用蜡涂覆尖端后进行灼烧。在显微镜下抛光。通过将移液管尖端置于移液管溶液中并拉动活塞来填充移液管尖端。这一步可润湿移液管的尖端。接下来，使用注射器将移液管溶液注入至移液管体积的三分之一处。然后将移液管连同内部的银/氯化银电极一起放入移液管架中。确保导线电极与移液管溶液接触。下一步是从制备好的卵母细胞上分离出内面向外的膜片。首先，在显微镜下找到卵母细胞清晰的边缘。使用操纵器将记录电极移至卵母细胞附近，确保其浸入溶液中。在灌流液中，记录电极的串联电阻。当电极内充满电极填充液并浸入灌流液中时，记录电极理想的串联电阻范围为1至1.5毫欧姆。现在缓慢推动移液管直至卵母细胞，使其阻力大约增加一倍。通过连接至移液管 holder 的吸管用嘴施加轻柔的负压，以获得吉欧姆封接。确认形成吉封后，在负30毫伏电压下保持数分钟，以稳定膜片。为了获得一个外翻式膜片，需将移液管快速推入OO位点后轻轻拉出，以切除膜片。此时外翻式膜片已准备好用于膜片钳记录。将持有外翻式膜片的移液管移至距离灌流管尖端开口约100微米的位置。关闭用于收集废液的电子阀门，打开所需灌流液的储液阀。开始记录膜片上的电流。根据需要改变电压和灌流液。记录完成后，通过推动去离子水冲洗灌流管路、笔式电极和尖端，以防止堵塞。此处获得的膜片钳记录显示，卵母细胞膜片上的野生型BK通道对电压和钙离子均有响应。该图显示了灌流液中钙离子浓度为名义零值时的膜片记录结果。电流轨迹上方的方波表示施加于膜片的电压。施加了四个电压，范围从50毫伏到200毫伏，以50毫伏为增量递增。在200毫伏的最大电压下获得最大电流，约为2纳安。随着电压的增加，电流幅度的上升表明BK通道的开放概率随电压升高而增加。该图显示了内面向外膜片在不同电压下的反应。当灌流液中含有1微摩尔钙离子时，施加了电压阶跃。与上图类似，在施加200毫伏电压阶跃时，当灌流液中含有钙离子时，上方的电流响应增加至约3纳安，而无钙离子时仅为约2纳安。这表明BK通道的开放概率在钙离子存在时升高。综上所述，该膜片钳实验结果表明，BK通道具有电压和钙离子依赖性。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用膜片钳技术结合推进燃料系统记录铁通道的激活。现在，感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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