突触量化:基于一个免疫细胞化学检测，以量化突触数量

神经科学最重要的目标之一是了解指导突触形成早期阶段的分子线索。因此，开发客观的方法来量化突触连接的变化变得势在必行。为了量化各种实验制剂中的突触数，用选择性突触前和突触后标志物对培养的神经元或冷冻切片脑组织制剂进行染色，以标记神经元之间突触接触的点。

然后在荧光显微镜上对细胞或组织进行成像，并且对应于两个免疫组织化学标志物的每个通道所需的 8 位图像。使用带有 puncta analyzer 的图像 J 1.29 分析图像。为了确定突触前和突触后标志物之间的共定位程度，可以使用共定位点来确定制剂中存在的突触数量。

与现有方法（如电子显微镜）相比，此处描述的技术的主要优点是突触测定允许对突触数进行更高的通量分析和定量。该技术的主要含义延伸到临床疾病的诊断和治疗，例如阿尔茨海默病、癫痫或自闭症，其中异常和突触连接被认为是潜在病理的基础。该技术可用于确定可以减少或改善我们在受影响神经元彼此形成突触能力中看到的缺陷的干预形式。

虽然这种方法对研究大脑发育很有用，但它也可以应用于您感兴趣的其他模式生物或器官系统，在这些系统中，您有兴趣研究或量化细胞间接触的数量，您有能力选择性地标记每个接触位点的每个相对面。通过铺板从大鼠视网膜中纯化的大鼠视网膜神经节细胞来制备神经元培养物，从 P 5 至 7 动物中收获在涂有 poly de lycine 的玻璃盖玻片上。在 24 孔板中，转染前让细胞在 37 摄氏度下生长 3 到 5 天。

转染后，将细胞再孵育 7 到 8 天，以便在铺板的细胞充分成熟时形成突触。从孔中取出培养基，向每个孔中加入 500 微升预热的 4% 对甲醛，固定 7 分钟。固定后，在室温下，用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞 3 次。

重要的是要确保细胞永远不会在孔中干燥。一旦缓冲液从孔中取出，应立即将其替换为下一个缓冲液。制备含有 50% 正常山羊血清和 0.2%Triton X 100 的封闭缓冲液。

从每个孔中去除 PBS 后，向每个孔中加入 200 μL 封闭缓冲液并封闭 30 分钟。在室温下，去除封闭缓冲液并冲洗 3 次。使用 PBS，在 90% 抗体缓冲液、10% NGS 溶液中制备一抗稀释液，其中包含所选的突触前和突触后抗体对。

这里有一个兔子抗突触蛋白、一个突触前标志物和一个小鼠抗 homer。使用突触后标志物离心，在台式离心机中以最大速度将一抗稀释 5 分钟以去除任何沉淀的抗体，然后向每个溶液中加入 200 μL 一抗溶液。将板放入加湿容器中，以防止初级溶液干燥。

与一抗孵育后，在 4 摄氏度下孵育过夜。将每个孔冲洗 3 次。使用 PBS，加入 200 μL 适当的二抗，在制备的含有 10% NGS 的抗体缓冲液中稀释 1 至 1000

和以前一样，将培养皿放入加湿室中，在室温下在黑暗中孵育两个小时，然后与二抗孵育。用 PBS 冲洗每个孔 3 到 4 次。将一滴带有 DPI 的矢量屏蔽封固剂放在载玻片上。

然后将带有细胞的盖玻片倒置到液滴上进行安装。最后，在盖玻片的边缘涂抹透明指甲油。注意避免在应用过程中轻推或移动盖玻片。

由于这将共享细胞，因此请让玻片在干燥、黑暗的地方干燥至少 30 分钟。在这里，使用配备适当滤光片组和 63 倍油浸物镜的 zes axio 成像仪荧光显微镜进行成像。将含有未转染细胞的载玻片放在显微镜载物台上。

使用 DPI 过滤器集来可视化细胞核，选择与其最近的相邻细胞直径至少相距两个细胞直径的细胞。在此步骤中使用 DPI 将有助于避免偏倚并确保细胞选择的随机性。对于每个选定的单元格，使用适当的过滤器集（在本例中为 GFP 和 Texas Red）获取八位图像。

叠加的伪彩色图像应分别以红色和绿色显示突触前和突触后标记。接下来，将含有转染细胞的载玻片放在显微镜载物台上。此处使用 TD 番茄表达载体转染细胞。

使用此标记可像以前一样选择单元格。对于每个选定的细胞，使用适当的过滤器集获得 8 个凹坑图像，在本例中为 GFP、Texas Red 和 Sci 5。叠加的伪彩色图像应具有红色、绿色和蓝色的突触后标记。

在这里，穿刺分析仪程序用于量化共定位突触穿刺。Puncta 分析器插件由 Barry Walk 编写，可根据要求在图 J 1.26 中使用。打开其中一个收集的图像。

使用圆形选择工具选择在目标 SOR 周围径向上大约一个单元直径的区域。选择感兴趣区域后，转到插件菜单，然后在出现的分析选项窗口中选择 puncture analyzer Select Red Channel Green Channel。第一个 Subtract background 和 set results 文件。

单击 确定。然后定义保存结果的位置。这些结果可以导出到 Excel，以便在出现的窗口中进行进一步分析。

接下来，确保选择了 50 的滚动球半径，并取消选中白色背景选项。此修改不是必需的，但通常是应用程序用户的首选。为了便于可视化，请单击 Ok （确定）。

一个新窗口将出现在与红色通道图像对应的蒙版旁边。调整阈值，直到红色面罩与尽可能多的谨慎的单独穿刺相对应。在不引入太多噪音的情况下，单击 完成。

将最小标点大小设置为 4 个像素。请勿修改任何其他内容。单击 确定。

这次对绿色通道重复上一步。使用绿色通道重复此作后，插件将分别提供对应于每个通道中的 puncta 的量化，并在两个通道之间提供共定位的 puncta。此处显示的突触测定可应用于大脑的冷冻切片以及任何其他神经系统组织，例如脊髓或视网膜。

前提是有合适的突触前和突触后标记对。首先从通过放血和大量 PBS 安乐死的小鼠身上收获脑组织。第二天将整个大脑置于 4 摄氏度的 PBS 中的 4% 异构醛中过夜。

用 PBS 冲洗大脑 3 次。Cryo 通过将大脑放入 30% 蔗糖中来保护大脑。在 PBS 中。

组织最初会漂浮在 4 摄氏度，直到组织沉到底部。在那个阶段，低温保护已经完成。接下来，在 20% 蔗糖与 OCT 和 PBS 的二比一溶液中，将 brainin 嵌入所需的切片方向。

例如，矢状或冠状。接下来，将一个平坦的金属表面放在一桶干冰上。将嵌入的大脑放在上面冷冻，冷冻后将大脑转移到冷冻袋中，并在零下 80 摄氏度下放置长达一年，然后再切片。

使用低温恒温器冷冻切片将组织切成 12 至 16 微米的切片，并安装在载玻片上。接下来，将载玻片放入 37 摄氏度的烤箱中干燥。然后用 PBS 冲洗 3 次以去除残留的 OCT。

石蜡笔用于在玻片周围形成疏水屏障，并在玻片中添加封闭缓冲液，以防止石蜡边界从玻片上流出。将载玻片置于 PBS 中的 20% 正常山羊血清中，在室温下放置 1 小时以封闭下一个位置。在含有 0.3% triton 和 10% 正常山羊血清的 PBS 中稀释的一抗切片。

在这里，兔抗体 PSD 95 用于标记谷氨酸能突触后区室，豚鼠抗 v glu 2 用于标记谷氨酸能突触前末端。将玻片置于 4 摄氏度下，并在孵育后孵育 36 至 60 小时。将玻片浸入 PBS 中 3 次，每次 15 分钟，洗去一抗。

完成此步骤后，请确保保护载玻片免受阳光直射。使用在 PBS 中稀释 1 至 200 的二抗，加入 0.3% triton 和 10% 正常山羊血清。这里，山羊抗豚鼠。

Alexa 4 8 8 和山羊抗兔。Alexa 5 9 4 的调用。在室温下避光孵育 2 小时。

载玻片浸入 PBS 中 4 次，每次 15 分钟，以固定载玻片。加入小滴带有 dappy 的矢量盾封固剂，并用盖玻片盖住载玻片。涂抹指甲油以抑制盖玻片的移动。

组织切片的成像应使用带有适当激光器的共聚焦显微镜进行，每个切片图像使用 63 倍油浸物镜，以 0.33 微米的间隔在总深度为 5 微米的总深度上连续光学切片，总共 15 个光学切片。必须对每只动物的至少三个切片进行成像，并且必须包括来自给定实验条件的至少三只动物。从三个连续截面的组中生成最大强度投影，生成五个投影，每个投影代表 1 微米的深度。

这些使用图像 J 进行量化，如具有修改后的 ROI 的 RG C 所述，以确定在没有星形胶质细胞的情况下形成的突触数量。如预期的那样，使用红色显示的巴松管抗体和绿色显示的针对巴松管的抗体，对用基础生长培养基处理的解离 rgc 进行免疫化学。观察到极少的突触共定位点以确定星形胶质细胞分泌分子对体外形成的突触数量的影响 RG Cs 每三天用小鼠星形胶质细胞条件培养基处理一次，染色后总共 12 天。

在这个神经元中有许多突触很明显，但很快就显示为红色。Homer 显示在绿色解离的 RDC 中，转染细胞质 Lee 表达的 TD 番茄仅用基础生长处理。看不到中等突触。

TD 番茄为蓝色，突触为红色。突触后标记 homer 的信号非常少，显示为绿色。当用大鼠星形胶质细胞条件培养基长期处理相同的细胞时，可以看到许多突触。

TD 番茄在这里是蓝色的，synapsin 是红色的，Homer 是绿色的。显示纯化的 RGC 已用星形胶质细胞条件培养基处理，并已对突触前进行红色和突触后荷马绿色标记物的染色使用穿刺分析仪生成的阈值掩码对应于存在的两个通道。在识别出共定位点后，Puncta 分析器会输出这些点的图形表示。

点分析仪提供一个数字输出，指示在两个通道中和共定位点中识别的离散点的数量。通过分析该神经元产生的数据说明了星形胶质细胞分泌分子促进突触形成的能力，此处显示为突触测定，其中突触前和突触后免疫组织化学标记的共定位被量化，以证明星形胶质细胞诱导的突触形成的增强通过过表达重要的星形胶质细胞分泌的突触生成分子血栓形成的神经元受体。该图中显示的是用基础生长培养基 gm 或星形胶质细胞条件培养基长期处理的每个神经元的平均突触数。

与表达空载体的细胞相比，A-C-M-A-C-M 比表达血栓形成 spon 受体更强烈地促进视网膜神经节细胞中的突触形成。为了量化小鼠上丘中的突触密度，使用区室特异性免疫组织化学标志物分别标记突触前和突触后区室。如图所示，从出生后第 7 天到 P 14 的突触数量增加。

这说明了在这个发育时间窗口内上 ulus 中突触数量的增加。一旦掌握，对于解离的神经元培养物，该方案可以在大约两天内完成，对于按照此程序从动物中收获的脑切片，可以在大约五天内完成。其他方法，如电生理学和电子显微镜，用于验证突触数量的变化分别反映了功能性突触和超结构正常突触的变化。

观看此视频后，您应该对如何将免疫组化应用于实验制备以量化突触数有一个很好的了解。该方案详细介绍了如何使用区室特异性抗体选择性地标记突触前和突触后区室。在这种情况下，我们将突触定义为从这些标记物中获得的信号之间的共定位点。