Name: 突触量化:基于一个免疫细胞化学检测，以量化突触数量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: 学习使用免疫细胞化学技术定量分析突触数量的方法。通过突触前和突触后标记物的共定位，在神经元培养物和脑组织切片中实现高通量突触计数，为神经科学研究提供可靠工具。

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Image J 的 Puncta Analyzer 插件由 Barry Wark（现任职单位：Physion Consulting）在 Ben A. Barres（斯坦福大学）实验室编写。
资金；
<ul>
<li>艾尔弗·斯隆基金会</li>
<li>艾斯特·A·和约瑟夫·克林斯坦基金公司</li>
<li>布罗德生物医学研究基金会</li>
<li>亨廷顿病治疗倡议</li>
</ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

上述突触检测方法基于我们的实验目标，主要关注视网膜神经节细胞（RGCs）的兴奋性投射，无论是在纯化培养中还是在脑切片中。我们提供了一个参考表格，列出了适用于标记兴奋性突触且效果良好的抗体（表1）。
该突触检测方法可进行调整，用于量化任何神经元群体或任何其他突触亚型的突触数量，前提是存在特异性的突触前和突触后标记物。例如，通过选用适当的突触前和突触后标记物，此处所述的突触检测方法可用于研究GABA能（而非谷氨酸能）突触10,11。
该突触检测方法是研究神经元之间突触连接变化的重要工具。尽管有必要通过电子显微镜和电生理学技术来验证本检测的结果，但它仍为回答有关调控神经元形成突触能力的分子信号的重要问题提供了相对简便的方法。

<table><tbody><tr><td>突触前</td><td>Synapsin</td><td>兔</td><td>多克隆</td></tr><tr><td>Synapsin</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Bassoon</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Assay Designs</td></tr><tr><td>Bassoon</td><td>豚鼠</td><td>多克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptotagmin 1</td><td>兔</td><td>多克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptobrevin 2 (C1.69.1)</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptophysin (C1.7.2)</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>VGlut1</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>VGlut1</td><td>豚鼠</td><td>多克隆</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>VGlut2</td><td>豚鼠</td><td>多克隆</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>突触后</td><td>PSD-95 (6G6-1C9 克隆)</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>兔</td><td>多克隆</td><td>Zymed</td></tr><tr><td>Homer</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Homer</td><td>大鼠</td><td>多克隆</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Gephyrin</td><td>兔</td><td>多克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Gephyrin</td><td>小鼠</td><td>单克隆</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1：&lt;/strong&gt; 列出了我们在突触检测中成功使用的一些良好的突触前和突触后标记物示例。请注意，此列表并未穷尽所有可用标记物。Y = 是，N = 否，N.D. = 未确定。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Cultrex</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roche Diagnostics Gmbh</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base (50 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1137</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15711</td><td></td></tr><tr><td>颗粒状 PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Falcon BD</td><td>35-3047</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa 荧光标记抗体</td><td>Invitrogen</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>12 mm，0号玻璃盖玻片</td><td>Karl Hecht Gmbh</td><td>1105209</td><td></td></tr><tr><td>1.5号玻璃盖玻片（用于脑片）</td><td>VWR international</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR international</td><td>48311-703</td><td></td></tr></tbody></table>

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，开发出客观的方法来量化突触连接的变化已成为当务之急。本实验方案从样本固定开始，详细描述了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物以及脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记出突触前终末以及突触后特化结构的位点。我们将突触定义为这些标记物所产生的信号之间共定位的点。这些共定位点的数量通过ImageJ分析软件平台下的Puncta Analyzer插件（由Bary Wark编写，可应要求获取，c.eroglu@cellbio.duke.edu）进行量化。本方案中描述的突触检测方法可应用于任何具有选择性突触前和突触后标记物的神经组织或培养样本。该突触检测技术是一种有价值的工具，可在突触发育研究中广泛使用。

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。

神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，这一领域已逐渐……

神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，开发出客观的方法来量化突触连接性的变化变得至关重要。为了在多种实验条件下定量突触数量，通常对培养的神经元或冰冻切片脑组织样本进行染色，使用特异性的突触前和突触后标记物来标记神经元之间的突触接触位点。随后在荧光显微镜下对细胞或组织进行成像，并针对两种免疫组织化学标记物对应的通道分别获取8位图像。使用ImageJ 1.29软件结合puncta analyzer插件对图像进行分析。为了确定突触前和突触后标记物之间的共定位程度，可通过共定位点来确定样本中突触的数量。与电子显微镜等现有方法相比，此处所述技术的主要优势在于突触检测能够实现更高通量的分析，并对突触数量进行更高效的定量。该技术的重要意义在于其可应用于阿尔茨海默病、癫痫或自闭症等临床疾病的诊断与治疗，这些疾病中突触异常和突触连接障碍已被认为是其潜在病理机制的基础。该技术可用于识别某些干预手段，以减少或改善病变神经元之间形成突触能力所存在的缺陷。尽管该方法可用于研究大脑发育，但它也可应用于其他感兴趣的模式生物或器官系统，只要能够选择性地标记每个接触位点相对两侧的细胞接触面，即可用于研究或量化细胞间接触的数量。通过将从出生后5至7天的大鼠视网膜中分离纯化的大鼠视网膜神经节细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，制备神经元培养物。在24孔板中，细胞在转染前于37摄氏度培养3至5天。转染后，继续培养细胞7到8天，使共培养的细胞充分成熟并形成突触。吸去孔中的培养基，每孔加入500 µL预热的4%多聚甲醛，室温固定7分钟。固定完成后，在室温下用磷酸盐缓冲液清洗细胞三次。必须确保细胞在孔板中始终不被干燥。一旦移除孔板中的缓冲液，应立即加入下一种缓冲液。配制含50%正常山羊血清和0.2%Triton X-100的封闭缓冲液。从每个孔中移除 PBS 后，向每个孔中加入 200 微升封闭缓冲液，在室温下封闭 30 分钟。移除封闭缓冲液，并用 PBS 洗涤三次。用 90% 抗体缓冲液和 10% NGS 溶液配制一抗稀释液，其中包含所选的突触前和突触后抗体组合。此处使用兔抗 synapsin 抗体（一种突触前标志物）和鼠抗 homer 抗体（一种突触后标志物）。将一抗稀释液在台式离心机中以最大速度离心五分钟，以去除任何沉淀的抗体，然后向每个孔中加入 200 微升一抗溶液。将板置于湿盒中，以防止一抗溶液干燥。在与一抗孵育后，于4°C下过夜孵育。用PBS将每孔洗涤三次。每孔加入200 µL适当稀释的二抗（按1:1000比例稀释于含10% NGS的抗体缓冲液中）。同前，将培养皿放入湿盒中，避光，室温孵育2小时，此步骤在二抗孵育后进行。用PBS洗涤每个孔3至4次。在载玻片上滴加一滴含DPI的Vector Shield封片剂。然后将带有细胞的盖玻片倒置，覆盖在液滴上进行封

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科研

JoVE Journal

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神经科学

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突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

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