量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

神经科学中最重要的目标之一是理解指导突触形成的早期阶段的分子信号。因此，开发出客观的方法来量化突触连接性的变化变得至关重要。为了在多种实验条件下定量突触数量，通常对培养的神经元或冰冻切片脑组织样本进行染色，使用特异性的突触前和突触后标记物来标记神经元之间的突触接触位点。

随后在荧光显微镜下对细胞或组织进行成像，并针对两种免疫组织化学标记物对应的通道分别获取8位图像。使用ImageJ 1.29软件结合puncta analyzer插件对图像进行分析。为了确定突触前和突触后标记物之间的共定位程度，可通过共定位点来确定样本中突触的数量。

与电子显微镜等现有方法相比，此处所述技术的主要优势在于突触检测能够实现更高通量的分析，并对突触数量进行更高效的定量。该技术的重要意义在于其可应用于阿尔茨海默病、癫痫或自闭症等临床疾病的诊断与治疗，这些疾病中突触异常和突触连接障碍已被认为是其潜在病理机制的基础。该技术可用于识别某些干预手段，以减少或改善病变神经元之间形成突触能力所存在的缺陷。

尽管该方法可用于研究大脑发育，但它也可应用于其他感兴趣的模式生物或器官系统，只要能够选择性地标记每个接触位点相对两侧的细胞接触面，即可用于研究或量化细胞间接触的数量。通过将从出生后5至7天的大鼠视网膜中分离纯化的大鼠视网膜神经节细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，制备神经元培养物。在24孔板中，细胞在转染前于37摄氏度培养3至5天。

转染后，继续培养细胞7到8天，使共培养的细胞充分成熟并形成突触。吸去孔中的培养基，每孔加入500 µL预热的4%多聚甲醛，室温固定7分钟。固定完成后，在室温下用磷酸盐缓冲液清洗细胞三次。

必须确保细胞在孔板中始终不被干燥。一旦移除孔板中的缓冲液，应立即加入下一种缓冲液。配制含50%正常山羊血清和0.2%Triton X-100的封闭缓冲液。

从每个孔中移除 PBS 后，向每个孔中加入 200 微升封闭缓冲液，在室温下封闭 30 分钟。移除封闭缓冲液，并用 PBS 洗涤三次。用 90% 抗体缓冲液和 10% NGS 溶液配制一抗稀释液，其中包含所选的突触前和突触后抗体组合。

此处使用兔抗 synapsin 抗体（一种突触前标志物）和鼠抗 homer 抗体（一种突触后标志物）。将一抗稀释液在台式离心机中以最大速度离心五分钟，以去除任何沉淀的抗体，然后向每个孔中加入 200 微升一抗溶液。将板置于湿盒中，以防止一抗溶液干燥。

在与一抗孵育后，于4°C下过夜孵育。用PBS将每孔洗涤三次。每孔加入200 µL适当稀释的二抗（按1:1000比例稀释于含10% NGS的抗体缓冲液中）。

同前，将培养皿放入湿盒中，避光，室温孵育2小时，此步骤在二抗孵育后进行。用PBS洗涤每个孔3至4次。在载玻片上滴加一滴含DPI的Vector Shield封片剂。

然后将带有细胞的盖玻片倒置，覆盖在液滴上进行封片。最后，在盖玻片边缘涂抹透明指甲油。涂抹时需小心，避免触碰或移动盖玻片。

由于这将共享细胞，请将载玻片置于干燥、避光处至少干燥30分钟。此处使用配备适当滤光片组和63倍油浸物镜的Zeiss Axio Imager荧光显微镜进行成像。将含有未转染细胞的载玻片放置在显微镜载物台上。

使用DPI滤光片组观察细胞核，选择距离最近邻细胞至少两个细胞直径以上的细胞。在此步骤中使用DPI有助于避免偏差，确保细胞选择的随机性。针对每个选定的细胞，使用相应的滤光片组（此处为GFP和Texas Red）获取8位图像。

叠加的伪彩色图像应分别以红色和绿色显示突触前和突触后标记物。接下来，将载有转染细胞的载玻片置于显微镜载物台上。此处细胞已转染了TD番茄表达载体。

使用此标记物像之前一样选择细胞。针对每个选定的细胞，使用相应的滤光片组（此处为 GFP、Texas Red 和 Sci five）获取八张凹坑图像。叠加的伪彩色图像中，突触后标记物应分别显示为红色、绿色和蓝色。

此处使用突触共定位分析程序对共定位的突触斑点进行定量分析。该斑点分析插件由 Barry Walk 编写，可在 ImageJ 1.26 中根据请求获取。打开一张采集的图像。

使用圆形选择工具，在目标 SOR 周围径向约一个细胞直径的范围内选择区域。选定感兴趣区域后，进入插件菜单，在出现的分析选项窗口中选择“Puncture Analyzer”，然后选择红色通道和绿色通道。首先进行背景减除，并设置结果文件。

单击“确定”。然后定义保存结果的位置。在弹出的窗口中，可将这些结果导出至 Excel 以进行进一步分析。

接下来，确保选择的滚球半径为 50，并取消勾选白色背景选项。此修改并非必需，但通常更受应用程序用户青睐。为了便于可视化，单击“确定”。

将出现一个新窗口，旁边是与红色通道图像对应的掩膜。调整阈值，直到红色掩膜尽可能与各个独立的穿孔区域吻合，同时避免引入过多噪声，然后单击“完成”。

将最小斑点大小设置为四个像素。不要修改其他任何设置。单击确定。

此次对绿色通道重复上一步操作。在对绿色通道重复操作后，该插件将分别提供每个通道中 puncta 的定量结果，以及两个通道之间的共定位 puncta 结果。此处展示的突触检测方法可应用于脑组织的冷冻切片，也可用于其他任何神经系统组织，如脊髓或视网膜。

在具备合适的突触前和突触后标记物配对的前提下，首先取经放血并用 PBS 灌注处死的小鼠脑组织。将完整脑组织置于含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中，4°C 条件下固定过夜，次日继续后续操作。

用 PBS 冲洗脑组织三次。将脑组织置于含 30% 蔗糖的 PBS 中进行冷冻保护。

组织最初会漂浮，需在4°C条件下保持，直至组织沉至底部。此时，冷冻保护即已完成。接下来，使用20%蔗糖与OCT和PBS按2:1比例配制的溶液，将脑组织按所需切片方向包埋。

例如矢状面或冠状面。接下来，将一块平整的金属表面置于装有干冰的容器顶部，将包埋好的脑组织放在金属表面上进行速冻。待脑组织完全冻结后，将其转移至冷冻袋中，并于零下80摄氏度保存，最长可保存一年，之后再进行切片。

使用冷冻切片机将组织切成12至16微米的切片，并贴附于玻璃载玻片上。接着，将载玻片置于37°C的烘箱中干燥。然后用PBS冲洗三次，以去除残留的OCT包埋剂。

使用石蜡笔在载玻片周围创建疏水屏障，阻止封闭缓冲液从载玻片上流出。将载玻片置于含20%正常山羊血清的PBS中，在室温下孵育1小时以进行封闭。随后将组织切片放入用PBS稀释的一抗溶液中，该溶液含有0.3%吐温-20和10%正常山羊血清。

此处使用兔抗 PSD 95 抗体标记谷氨酸能突触后区室，使用豚鼠抗 vGluT2 抗体标记谷氨酸能突触前终末。将切片置于 4°C 条件下，孵育 36 至 60 小时。孵育结束后，将切片浸入 PBS 缓冲液中，每次 15 分钟，重复 3 次，以洗去一抗。

此步骤之后，务必避免载玻片暴露于直射光线下。加入用含0.3%吐温和10%正常山羊血清的PBS按1:200稀释的二抗。此处使用山羊抗豚鼠二抗。

Alexa 488 和羊抗兔抗体，以及 Alexa 594 进行孵育，在室温避光条件下孵育两小时。

将切片浸入PBS中，每次15分钟，共洗涤4次，以进行封片。在切片上滴加少量含DAPI的Vector Shield封片剂，并用盖玻片覆盖。使用指甲油封固盖玻片，防止其移动。

应使用配备适当激光器的共聚焦显微镜，对每个组织切片采用63倍油镜物镜进行成像，以0.33微米的间隔在总共5微米的深度范围内连续采集15层光学切片。每只动物至少需成像三个切片，且每个特定实验条件下至少需包括三只动物。从每组连续的三层光学切片生成最大强度投影，共获得五个投影图像，每个投影代表1微米深度的信息。

使用 Image J 对突触数量进行定量分析，方法与 RG 细胞相同，但采用修改后的 ROI，以确定在无星形胶质细胞条件下形成的突触数量。对分离的 RG 细胞进行免疫染色，使用基础生长培养基处理，并以抗 bassoon 抗体（红色显示）和抗 homer 抗体（绿色显示）进行染色，结果符合预期。观察到极少的突触共定位信号。为确定星形胶质细胞分泌分子对体外分离的 RG 细胞突触形成数量的影响，在染色前每隔三天用小鼠星形胶质细胞条件培养基处理细胞，共处理 12 天。

该神经元中可见大量突触，但很快显示为红色。Homer 以绿色显示，转染了细胞质 Lee 表达的 TD 番茄的分离 RDC 细胞仅用基础生长培养基处理。未观察到突触。

TD 番茄呈蓝色，突触呈红色。突触后标志物homer（绿色显示）的信号非常微弱。当相同细胞经大鼠星形胶质细胞条件培养基长期处理后，可见大量突触。

此处TD番茄呈蓝色，synapsin呈红色，homer呈绿色。图中显示了一个经过星形胶质细胞条件培养基处理的纯化RGC，其轴突前突触标记为红色，树突后突触homer标记为绿色。使用Puncta Analyzer生成的阈值掩膜对应于这两个通道的信号。在识别出共定位点后，Puncta Analyzer会输出这些共定位点的图形化表示。

斑点分析工具提供一个数值输出，表示在两个通道中识别出的独立斑点数量以及共定位点的数量。对该神经元的分析结果展示了星形胶质细胞分泌分子促进突触形成的能力，此处表现为一种突触检测实验，通过量化突触前和突触后免疫组织化学标记的共定位，证明了过表达重要星形胶质细胞分泌的突触生成分子——血栓粘素（thrombospondin）——的神经元受体，可增强星形胶质细胞诱导的突触形成。本图显示了长期接受基础生长培养基（gm）或星形胶质细胞条件培养基处理的每名神经元平均突触数量。

A-C-M-A-C-M 在过表达血小板反应蛋白受体的视网膜神经节细胞中促进突触形成的程度显著强于过表达空载体的细胞。为了定量小鼠上丘中的突触密度，分别使用特定区室的免疫组织化学标记物对突触前和突触后区室进行标记。如图所示，从出生后第7天到第14天（P14），突触数量有所增加。

这说明了在此发育时间窗内，上丘中突触数量的增加。一旦掌握该方案，分离神经元培养物的实验约需两天完成，而从动物体内取材制备脑切片则约需五天。其他方法如电生理学和电子显微镜技术可用于验证突触数量的变化，分别反映功能性突触和超微结构正常突触的变化。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在实验样本中应用免疫组织化学技术来定量突触数量。本方案详细介绍了如何使用特定于亚细胞区室的抗体，选择性地标记突触前和突触后区室。在此背景下，我们将突触定义为来自这两种标记物信号共定位的位点。