Name: 为控制植物组织分解好氧菌的琼脂块缩影 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学习使用琼脂块缩影技术控制木材水分和外源底物，研究好氧真菌对木质纤维素植物组织的生物降解过程。该方法通过精确控制环境变量，提高生物降解研究的可重复性，适用于微生物生态学和真菌生物学领域。

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<ol><li>ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Annual+Book+of+ASTM+Standards%22">Annual Book of ASTM Standards</a>. , 185-192 (2007).</li>
<li>Bravery, A. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBravery%2C+AF+%22A+miniaturized+wood+block+for+the+rapid+evaluation+of+wood+preservative+fungicides%22">A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides</a>. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).</li>
<li>Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+relationship+between+the+dry+rot+fungus+Serpula+lacrymans+and+selected+forms+of+masonry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Biodeterior.+Biodegrad%22%5BJournal%5D)">Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry.</a> Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).</li>
<li>Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicolas%2C+D+%22Wood+Deterioration+and+Its+Prevention+by+Preservative+Treatments%22">Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments</a>. , Syracuse University Press. (1973).</li>
<li>Schilling, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+calcium-based+materials+and+iron+impurities+on+wood+degradation+by+the+brown+rot+fungus+Serpula+lacrymans%5BTitle%5D)+AND+%22Holzforschung%22%5BJournal%5D)">Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans.</a> Holzforschung. 64, 93-99 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

利用我们的琼脂块实验装置（图1），Serpula lacrymans 能够直接与石膏表面接触生长，并侵入木材块中（图2），导致对照组褐腐松木块的重量损失超过60%（图3）。该结果轻松满足ASTM标准中&gt;50%的腐朽要求，且在第16周时腐朽程度的平均变异系数（CV）为0.055。此数据已发表于Schilling7的研究中。需要注意的是，其他真菌在琼脂块中的培养时间通常需长于土壤块中的培养时间。作为参考，我们在以往的多个实验中已成功应用类似设计，研究了多种其他真菌种类，并常结合扫描电子显微镜-能谱分析（SEM-EDS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）来验证真菌与外源基质的连接性，以及钙和其他元素向木材内部的迁移8,9。
 除了变异性较低之外，我们的琼脂块设计还揭示了另外两个结果。首先，存在处理效应（图3），即无论以CaCl2形式还是纯石膏形式向琼脂中添加钙，均会抑制该真菌的降解作用。这一结果具有重要意义，因为其他研究者曾基于对砂浆和灰泥等实际材料的研究，提出钙可...

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>4014</td><td>25 × 150 mm</td></tr><tr><td>琼脂，A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4550</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铵，NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Millinckrodt</td><td>3436-12</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁，MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>右旋糖</td></tr><tr><td>硼酸，H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌，ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8880-12</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰，MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>2540-04</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)，CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>四水合钼酸铵，(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431346</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙，CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4160-12</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，NaCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁，FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5056-12</td><td></td></tr><tr><td>移液辅助器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-110</td><td>无线&lt;br/&gt;用乙醇擦拭表面</td></tr><tr><td>10 ml 无菌聚苯乙烯移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>滤网盖</td><td>Thermwell Products Co.</td><td>VX620</td><td>预先用肥皂清洗&lt;br/&gt;五金店</td></tr><tr><td>半水合硫酸钙，CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;0.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Acros Organics</td><td>385355000</td><td></td></tr><tr><td>4号软木钻孔器</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td></td></tr></tbody></table>

用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

研究真菌降解木质纤维素植物组织的两种主要方法最初是为木材防腐剂测试而开发的（土块法；琼脂块法）。普遍认为，土块法微宇宙系统能产生更高的降解速率，水分问题更少，不同研究间的变异性更低，且对防腐剂毒性的耐受阈值更高。因此，土块法是更常用的技术，并已被美国材料与试验协会（ASTM）标准化（方法 D 1413-07）。然而，土块法设计存在缺点，例如使用具有地域差异的土壤来源，以及难以控制降解组织外部（外源性）的营养条件。这些缺点在将该方法应用于其他日益热门的研究目标时日益凸显。这些现代研究目标包括：为生物能源研究降解木质纤维素材料、测试共代谢有毒物质的生物修复、评估氧化机制，以及追踪沿菌丝网络转移的元素。土块法在这些应用中无法提供足够的控制能力，因此有必要采用一种改进的琼脂块方法。
本研究采用褐腐木材降解真菌Serpula lacrymans，在低钙琼脂块微宇宙系统中降解木材，使用深型培养皿和低钙琼脂。我们通过时间序列实验检测外源石膏对木材降解的影响，以展示该方法的实用性及预期的变异性。取自同一块木材纵向切割条的样品经调湿、称重、高压灭菌后，无菌地放置于塑料网格上方。真菌接种于每个木块的各个表面，外源石膏则添加在界面处。收获过程保持无菌操作，直至最终的破坏性取样。这些微宇宙系统的设计旨在避免木块与琼脂或培养皿壁接触。在倒平板和培养过程中尽量减少冷凝水的产生。此外，接种物、石膏与木材之间的间距尽可能小，但不发生直接接触。琼脂块实验设计中这些看似技术性较低的环节，恰恰是实验失败最常见的原因，也是不同研究之间变异性的主要来源。因此，视频发表在此类研究中具有重要价值，本文展示了低变异性和高质量的实验结果。

本视频展示了一种在受控环境下研究好氧真菌降解木质纤维素植物组织的方法。琼脂块微环境系统能够控制营养来源和湿度，这是其主要优势，但该方法常出现结果不一致的问题。本文针对关键的实验陷阱进行探讨，以获得可重复、变异度低的实验结果。

研究真菌对木质纤维素植物组织降解的两种主要方法最初是为木材防腐剂测试而开发的（土壤块法；...

本实验的总体目标是在培养皿微宇宙系统中接种一种好氧性木材降解真菌，并严格控制木材含水量及外源底物。该目标通过以下步骤实现：首先，制备含有精确体积已知培养基的微宇宙系统；随后，将待降解的木材以及任何外源性固体底物放置在培养基表面的塑料网格上，确保各底物之间不发生接触。随后将微宇宙接种并用测试真菌进行培养。培养结束后，收获木块以测定质量损失，并制备组织用于后续分析。最终可通过质量损失测定、菌丝形态观察以及靶向元素分析（如电感耦合等离子体光谱法）获得结果，从而揭示木材生物降解的程度以及外源性元素来源的作用。您好，我叫 Brooke Jacobson，来自明尼苏达大学生物产品与生物系统工程系 Jonathan Schilling 博士的实验室。今天我们将向您展示一种利用培养皿作为微环境，用于好氧真菌分解植物组织的实验方法。我们实验室使用该方法研究真菌降解木质纤维素的机制。木质纤维素是由木质素、纤维素和半纤维素组成的植物组织。我们最常研究的组织是木材。在螺旋钻块设计中，与技术性较低的方面相关的错误是最常见的失败原因，也是不同研究之间变异性的主要来源，因此通过视频形式发表我们的螺旋钻块装置设置具有重要价值。根据经验，我们知道该方法能够获得高质量且变异度低的结果。那么我们开始吧。进行这些实验时，使用比普通培养皿深1厘米的培养皿，以增加微宇宙中木块上方的顶空空间。开始微宇宙制备，为每个培养皿准备足量的培养基，每培养皿使用20毫升无钙无铁的培养基。在500毫升容量瓶中加入约400毫升去离子水，并添加补充成分，然后加入15克琼脂。使用预先配制的储备液向混合物中添加微量元素。加入营养物质后，将容量瓶加水定容至500毫升刻度线。接着，将培养基转移至1000毫升锥形瓶中。在121摄氏度、16 PSI条件下高压灭菌20分钟。注意每个烧瓶中的体积不要超过 500 毫升，以免在测试平板接种前琼脂凝固。高压灭菌后，让培养基冷却至触感不烫，以尽量减少冷凝。在这些实验中，控制水分至关重要，即水分含量（mc）。超过80%将导致组织缺氧。通过抑制好氧真菌的降解作用并减少变异性来加以限制。冷却。使用便携式移液器辅助装置和10毫升无菌聚苯乙烯移液管进行无菌操作。在生物安全柜中，将琼脂转移至一叠较高的培养皿中。接着，大量裁剪塑料网状格栅，使其能够贴合培养皿底部。裁剪后，用肥皂和水彻底清洗格栅，然后将格栅准备好进行干燥和高压灭菌，以用于本次演示。南方黄松（SYP）因其是重要的木材来源而被采用。在美国的住宅建筑中，使用未经处理的木材，沿纹理方向进行单次纵向切割，制备19毫米×19毫米、无节的木块，再将该长度切割成19毫米见方的立方体木块。使用凿子和锤子沿纹理将19立方毫米的木块一分为二，而不是使用锯子。这样可使木块形成一个粗糙的底面，用于朝下放置在农业区微宇宙系统的塑料网筛上，同时保留一个光滑的顶面用于标记。用铅笔在木块的光滑边缘进行标记，根据处理组需求切割足够数量的木块，同时包括未接种的对照组样本，这些对照组将用于污染监测，并作为与烘干样品平行处理的基线数据样本。将样本放入铝制沥水盘中，置于100°C的对流烘箱中干燥48小时。将样品从烘箱转移至干燥器中冷却。冷却后，预先称量样品以确定初始烘干重量。最后，将样品（包括塑料网格和木材）用铝箔紧密包裹，以尽量减少湿气进入，为高压灭菌做准备。这并不要求每个样品都单独包裹，但需确保蒸汽暴露程度低且一致。将标记好的样品在121摄氏度、16 PSI条件下高压灭菌1小时。在无菌生物安全柜中，准备好空的AEs、用于接种物的网状植物基质外源材料源板、记号笔、对苯二甲醛试纸条、镊子以及转移工具。接种的下一步是将物品添加到培养基中，并用培养皿盛装以尽量减少污染风险。使用95%乙醇对转移工具和镊子进行火焰灭菌。首先，将塑料网格放入培养皿中。然后在此处添加木基质。沿网格长度方向放置两块木块，以便配对早期和晚期收获的数据。这两块木块并排放置，木纹方向一致，并朝向真菌接种源的一端。接下来，添加外源物质。此处旨在测试石膏对丝状真菌降解作用的影响。因此，真菌在接触到木材之前应先接触这些石膏圆片。在网格上方的每个方块与接种点之间放置一片石膏圆片。操作时需注意避免木材中的圆片相互接触，同时保持它们彼此靠近。对于真菌接种物，使用直径为七毫米的4号打孔器，从在20毫升琼脂中培养两周的菌落上切取菌块。这有助于控制接种量。对于未接种的对照组，最好添加来自无菌平板的菌块。注意不要让接种物与外源基质或木材接触，但应将它们放置在相近的位置。每个方块使用一个接种块。用剃刀切割的封口膜将培养皿密封，保持培养皿水平，并以平滑连续的动作包裹封口膜。最后，使用耐酒精标记笔在培养皿盖上标记方块编号，直接对应各自的底物。同时在石膏圆盘上画出圆圈。将培养皿小心转移至生物培养箱中，避免晃动内容物，并减少因温度波动而产生的冷凝。此处使用的培养条件为20摄氏度、避光培养，除最后一次收获外，其余时间点的系列收获均需无菌操作。在第五周收获时，取出全部处理组样本。用70%乙醇喷洒每个培养皿的底部和顶部，并使用火焰灭菌的镊子在生物安全柜内取出材料。在销毁种植板之前拍照，重点拍摄任何形态F或甜瓜样本。然后取出待处理的样品块。卷走多余的pha，但需小心避免丢失任何腐烂的材料。将样品块置于铝制舟皿中烘干，并利用对照组的新鲜重量和干重来测定质量损失，以监测是否存在过度毛细吸水现象。质量损失数据有助于评估降解进程，是重要的实验数据。若需以克重为基础计算元素浓度，则必须对百分比数据进行归一化处理。进行统计时，应标记并追踪任何深棕色块状物，这些块状物明显处于水浸状态。最后，将培养物置于可高压灭菌的袋中彻底销毁，保留塑料支撑网及其他可回收部件，以供未来实验重复使用。在农用块微环境装置中，松木块放置在塑料网上，使其高于农用基质表面。圆形克拉因氏菌直接在石膏表面生长，并侵入木块内部。该菌丝体代表了木材与外源营养元素来源之间的重要连接。通过在琼脂或固体材料中控制这些外源物质来源，是农业块设计相较于土壤块设计的一个关键优势，以五周和十五周后松木在农业块微环境中的平均重量损失百分比作为衡量丝状真菌降解木材程度的指标。未进行任何处理。在每次收获时，向琼脂中添加5毫摩尔氯化钙，并使用纯度大于99%的石膏或含1%铁的改良石膏。相同字母标注的柱状图之间无显著差异。误差线表示标准偏差，在对照组褐腐松木块中观察到超过60%的重量损失，符合美国材料与试验协会（ASTM）对腐朽程度大于50%的标准要求。在第16周时，腐烂的变异系数平均为0.055。除了变异性较低外，还观察到了处理效应。无论以氯化钙形式添加至琼脂，还是以纯石膏形式添加，钙的加入均抑制了真菌腐烂。有趣的是，在石膏中添加铁后，降解速率出现回升。这表明在第15周观察降解的五个重复样本时，起关键作用的是铁而非钙。在相同的褐腐试验真菌和环状层板条件下，菌丝的颜色揭示了其特征。不同处理间外部菌丝的差异，移除区组并向上干燥。结果显示无钙处理中主要成分的缺失。纯钙处理中出现的黄化现象，以及添加铁处理中呈现的锈色外观。对照组为未接种的样本块，用于比较。有趣的是，在高铁培养基中，主要效应消失。综合来看，这表明该真菌利用的是铁，而非钙。在这些材料中，我们刚刚向您展示了如何使用螺旋钻块装置成功测试好氧丝状真菌对植物组织的生物降解。进行此操作时，重要的是要记住避免底物相互接触，尤其是植物组织与螺旋钻；应尽量减少螺旋钻和血小板中的水分含量，并在培养前仔细检查每个培养皿中的内容物是否发生位移。考虑到这些变量后，您对降解环境的控制将远优于使用土壤块装置时的情况。您可以生成具有足够统计功效的数据，以回答您的研究问题。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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为控制植物组织分解好氧菌的琼脂块缩影

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