Name: 为控制植物组织分解好氧菌的琼脂块缩影 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学习使用琼脂块缩影技术控制木材水分和外源底物，研究好氧真菌对木质纤维素植物组织的生物降解过程。该方法通过精确控制环境变量，提高生物降解研究的可重复性，适用于微生物生态学和真菌生物学领域。

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<ol><li>ASTM D1413-07. Standard test method for testing wood preservatives by laboratory soil-block cultures. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Annual+Book+of+ASTM+Standards%22">Annual Book of ASTM Standards</a>. , 185-192 (2007).</li>
<li>Bravery, A. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBravery%2C+AF+%22A+miniaturized+wood+block+for+the+rapid+evaluation+of+wood+preservative+fungicides%22">A miniaturized wood block for the rapid evaluation of wood preservative fungicides</a>. , International Research Group on Wood Protection (IRG/WP 2113). (1978).</li>
<li>Low, G. A., Young, M. E., Martin, P., Palfreyman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+relationship+between+the+dry+rot+fungus+Serpula+lacrymans+and+selected+forms+of+masonry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Biodeterior.+Biodegrad%22%5BJournal%5D)">Assessing the relationship between the dry rot fungus Serpula lacrymans and selected forms of masonry.</a> Int. Biodeterior. Biodegrad. 46, 141-150 (2000).</li>
<li>Nicolas, D. Volume I (One/1) - Degradation and Protection of Wood (Syracuse Wood Science Series #5). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicolas%2C+D+%22Wood+Deterioration+and+Its+Prevention+by+Preservative+Treatments%22">Wood Deterioration and Its Prevention by Preservative Treatments</a>. , Syracuse University Press. (1973).</li>
<li>Schilling, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+calcium-based+materials+and+iron+impurities+on+wood+degradation+by+the+brown+rot+fungus+Serpula+lacrymans%5BTitle%5D)+AND+%22Holzforschung%22%5BJournal%5D)">Effects of calcium-based materials and iron impurities on wood degradation by the brown rot fungus Serpula lacrymans.</a> Holzforschung. 64, 93-99 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

利用我们的琼脂块实验装置（图1），Serpula lacrymans 能够直接与石膏表面接触生长，并侵入木材块中（图2），导致对照组褐腐松木块的重量损失超过60%（图3）。该结果轻松满足ASTM标准中&gt;50%的腐朽要求，且在第16周时腐朽程度的平均变异系数（CV）为0.055。此数据已发表于Schilling7的研究中。需要注意的是，其他真菌在琼脂块中的培养时间通常需长于土壤块中的培养时间。作为参考，我们在以往的多个实验中已成功应用类似设计，研究了多种其他真菌种类，并常结合扫描电子显微镜-能谱分析（SEM-EDS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）来验证真菌与外源基质的连接性，以及钙和其他元素向木材内部的迁移8,9。
 除了变异性较低之外，我们的琼脂块设计还揭示了另外两个结果。首先，存在处理效应（图3），即无论以CaCl2形式还是纯石膏形式向琼脂中添加钙，均会抑制该真菌的降解作用。这一结果具有重要意义，因为其他研究者曾基于对砂浆和灰泥等实际材料的研究，提出钙可...

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>4014</td><td>25 × 150 mm</td></tr><tr><td>琼脂，A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4550</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铵，NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Millinckrodt</td><td>3436-12</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁，MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>右旋糖</td></tr><tr><td>硼酸，H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>2549-04</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌，ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8880-12</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰，MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>JT Baker</td><td>2540-04</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)，CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>四水合钼酸铵，(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431346</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙，CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4160-12</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，NaCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7581-12</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁，FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5056-12</td><td></td></tr><tr><td>移液辅助器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-110</td><td>无线&lt;br/&gt;用乙醇擦拭表面</td></tr><tr><td>10 ml 无菌聚苯乙烯移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>滤网盖</td><td>Thermwell Products Co.</td><td>VX620</td><td>预先用肥皂清洗&lt;br/&gt;五金店</td></tr><tr><td>半水合硫酸钙，CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;0.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Acros Organics</td><td>385355000</td><td></td></tr><tr><td>4号软木钻孔器</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td></td></tr></tbody></table>

用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

研究真菌降解木质纤维素植物组织的两种主要方法最初是为木材防腐剂测试而开发的（土块法；琼脂块法）。普遍认为，土块法微宇宙系统能产生更高的降解速率，水分问题更少，不同研究间的变异性更低，且对防腐剂毒性的耐受阈值更高。因此，土块法是更常用的技术，并已被美国材料与试验协会（ASTM）标准化（方法 D 1413-07）。然而，土块法设计存在缺点，例如使用具有地域差异的土壤来源，以及难以控制降解组织外部（外源性）的营养条件。这些缺点在将该方法应用于其他日益热门的研究目标时日益凸显。这些现代研究目标包括：为生物能源研究降解木质纤维素材料、测试共代谢有毒物质的生物修复、评估氧化机制，以及追踪沿菌丝网络转移的元素。土块法在这些应用中无法提供足够的控制能力，因此有必要采用一种改进的琼脂块方法。
本研究采用褐腐木材降解真菌Serpula lacrymans，在低钙琼脂块微宇宙系统中降解木材，使用深型培养皿和低钙琼脂。我们通过时间序列实验检测外源石膏对木材降解的影响，以展示该方法的实用性及预期的变异性。取自同一块木材纵向切割条的样品经调湿、称重、高压灭菌后，无菌地放置于塑料网格上方。真菌接种于每个木块的各个表面，外源石膏则添加在界面处。收获过程保持无菌操作，直至最终的破坏性取样。这些微宇宙系统的设计旨在避免木块与琼脂或培养皿壁接触。在倒平板和培养过程中尽量减少冷凝水的产生。此外，接种物、石膏与木材之间的间距尽可能小，但不发生直接接触。琼脂块实验设计中这些看似技术性较低的环节，恰恰是实验失败最常见的原因，也是不同研究之间变异性的主要来源。因此，视频发表在此类研究中具有重要价值，本文展示了低变异性和高质量的实验结果。

本视频展示了一种在受控环境下研究好氧真菌降解木质纤维素植物组织的方法。琼脂块微环境系统能够控制营养来源和湿度，这是其主要优势，但该方法常出现结果不一致的问题。本文针对关键的实验陷阱进行探讨，以获得可重复、变异度低的实验结果。

研究真菌对木质纤维素植物组织降解的两种主要方法最初是为木材防腐剂测试而开发的（土壤块法；...

本实验的总体目标是在培养皿微宇宙系统中接种一种好氧性木材降解真菌，并严格控制木材含水量及外源底物。该目标通过以下步骤实现：首先，制备含有精确体积已知培养基的微宇宙系统；随后，将待降解的木材以及任何外源性固体底物放置在培养基表面的塑料网格上，确保各底物之间不发生接触。随后将微宇宙接种并用测试真菌进行培养。培养结束后，收获木块以测定质量损失，并制备组织用于后续分析。最终可通过质量损失测定、菌丝形态观察以及靶向元素分析（如电感耦合等离子体光谱法）获得结果，从而揭示木材生物降解的程度以及外源性元素来源的作用。您好，我叫 Brooke Jacobson，来自明尼苏达大学生物产品与生物系统工程系 Jonathan Schilling 博士的实验室。今天我们将向您展示一种利用培养皿作为微环境，用于好氧真菌分解植物组织的实验方法。我们实验室使用该方法研究真菌降解木质纤维素的机制。木质纤维素是由木质素、纤维素和半纤维素组成的植物组织。我们最常研究的组织是木材。在螺旋钻块设计中，与技术性较低的方面相关的错误是最常见的失败原因，也是不同研究之间变异性的主要来源，因此通过视频形式发表我们的螺旋钻块装置设置具有重要价值。根据经验，我们知道该方法能够获得高质量且变异度低的结果。那么我们开始吧。进行这些实验时，使用比普通培养皿深1厘米的培养皿，以增加微宇宙中木块上方的顶空空间。开始微宇宙制备，为每个培养皿准备足量的培养基，每培养皿使用20毫升无钙无铁的培养基。在500毫升容量瓶中加入约400毫升去离子水，并添加补充成分，然后加入15克琼脂。使用预先配制的储备液向混合物中添加微量元素。加入营养物质后，将容量瓶加水定容至500毫升刻度线。接着，将培养基转移至1000毫升锥形瓶中。在121摄氏度、16 PSI条件下高压灭菌20分钟。注意每个烧瓶中的体积不要超过 500 毫升，以免在测试平板接种前琼脂凝固。高压灭菌后，让培养基冷却至触感不烫，以尽量减少冷凝。在这些实验中，控制水分至关重要，即水分含量（mc）。超过80%将导致组织缺氧。通过抑制好氧真菌的降解作用并减少变异性来加以限制。冷却。使用便携式移液器辅助装置和10毫升无菌聚苯乙烯移液管进行无菌操作。在生物安全柜中，将琼脂转移至一叠较高的培养皿中。接着，大量裁剪塑料网状格栅，使其能够贴合培养皿底部。裁剪后，用肥皂和水彻底清洗格栅，然后将格栅准备好进行干燥和高压灭菌，以用于本次演示。南方黄松（SYP）因其是重要的木材来源而被采用。在美国的住宅建筑中，使用未经处理的木材，沿纹理方向进行单次纵向切割，制备19毫米×19毫米、无节的木块，再将该长度切割成19毫米见方的立方体木块。使用凿子和锤子沿纹理将19立方毫米的木块一分为二，而不是使用锯子。这样可使木块形成一个粗糙的底面，用于朝下放置在农业区微宇宙系统的塑料网筛上，同时保留一个光滑的顶面用于标记。

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为控制植物组织分解好氧菌的琼脂块缩影

市面上有标称为“可生物降解”的塑料薄膜，可用于农业覆盖地膜。耕作是一种具有吸引力的处置方式，但此类薄膜在田间条件下的降解过程尚不明确。本研究的目的是建立从田间掩埋后的塑料地膜上分离定殖的本土土壤真菌和细菌的方法。...

分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

本文详细描述了生态系统器件制造装置（EcoFABs）的构建方案，该装置可在高度受控的实验室条件下用于研究植物及其与微生物的相互作用。...

用于研究植物-微生物互作的实验室生态系统构建（EcoFAB）协议

由于专性厌氧生物在接触氧气时无法生长，因此必须采用厌氧培养技术。本文展示了一种简单有效的方法，用于培养来自沼气厂的混合菌群，内容涵盖从培养基制备到气体和挥发性脂肪酸定量的全过程。...

严格厌氧/无氧条件下微生物培养的培养基制备

本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。...

从土壤生物多样性中分离与筛选降解难降解材料的真菌

由于土壤不透明，其内部微生物组分之间的相互作用难以在细胞分辨率下直接观察。本文介绍了两种微流控工具，为研究真菌-微生物相互作用提供了新的机会。这些装置用途广泛且操作简便，能够实现高时空控制，并在细胞水平上进行高分辨率成像。...

用于在细胞水平上探究真菌-微生物相互作用的微流控工具

本文介绍了一种在基于超吸收性聚合物的自养体系中接种并观察丛枝菌根真菌的简单且低成本的技术。...

在基于超吸水聚合物的自养系统上接种并观察丛枝菌根培养物

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。...

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

本文介绍了一种利用石油化学品和污染性材料制备基于菌丝体的复合材料（MBCs）以用于隔热应用的优化方法。为了实现碳中和与可持续发展，诸如菌丝体生物复合材料等生物基且可堆肥的材料可能成为解决方案。为确定其是否符合建筑标准，已开展了多项实验。...

油菜秸秆与Ganoderma resinaceum菌丝体生物复合材料的湿热性能制备与测试

我们介绍一种温度梯度模块，并详细说明其构建和使用方法。该模块可提供22个离散温度点，在用户定义的0至90...

土壤有机质分解速率对温度的响应：温度梯度模块的构建与应用

学习使用琼脂块缩影技术控制木材水分和外源底物，研究好氧真菌对木质纤维素植物组织的生物降解过程。该方法通过精确控制环境变量，提高生物降解研究的可重复性，适用于微生物生态学和真菌生物学领域。

用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

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