为控制植物组织分解好氧菌的琼脂块缩影

该程序的总体目标是在培养皿微观世界中接种好氧木材降解真菌，其中木材水分和外源性基质受到严格控制。这是通过首先准备具有精确体积的已知 edia 的微观世界来实现的。然后，将要降解的木材和任何外源性固体基材组装在农业表面的塑料网格顶部，不允许基材之间接触。

然后将微观世界接种并与测试真菌一起孵育。孵育后，收获木块以确定质量损失并准备组织进行分析。最终，通过质量损失测量、菌丝体形态观察和电感耦合等离子体光谱等靶向元素分析，可以获得显示木材生物降解程度和外源元素来源作用的结果。

大家好，我是来自明尼苏达大学生物制品和生物系统工程系 Jonathan Schilling 博士实验室的 Brooke Jacobson。今天，我们将向您展示一种使用培养皿作为微环境进行好氧真菌植物组织分解的程序。我们在实验室中使用该程序来研究真菌木质纤维素分解的机制。

木质素纤维素是由木质素、纤维素和半纤维素组成的植物组织。我们最常研究的组织是木材错误，螺旋桨设计技术性较低的是最常见的失败原因，也是研究之间可变性的主要来源，这使得我们的螺旋桨设置的视频发布有用。我们从经验中知道，该程序可产生高质量、低可变性的结果。

那么让我们开始吧。对于这些实验，使用比典型培养皿深一厘米的培养皿，以增加木块上方的顶部空间。在微观世界里。

通过为每个培养皿制备足够的 20 毫升 edia 来开始微观世界制备，以去除钙和铁。将 15 克琼脂的琼脂打入 500 毫升容量瓶中，该容量瓶中含有约 400 毫升经补充剂修饰的去离子水。使用先前制备的储备液向混合物中添加微量营养素。

添加营养物质后，将容量瓶填充至 500 mL。接下来，将培养基转移到 1000 毫升烧瓶中。高压灭菌器在 121 摄氏度和 16 PSI 下放置 20 分钟。

注意每个培养瓶的体积不要超过 500 毫升，以避免在施用测试板之前使 agri 凝固。高压灭菌后，让培养基冷却至触摸，以尽量减少冷凝。在这些实验中，尽量减少水分含量或 mc 至关重要。

超过 80% 会导致组织缺氧。限制好氧真菌的腐烂并增加一次变异性。凉。使用便携式移液器辅助工具和 10 毫升无菌聚苯乙烯移液器进行无菌。

将琼脂转移到生物安全柜中的高堆板中。接下来，将塑料网网格大量剪成适合板底。用肥皂和水切割并彻底清洗网格后，为本演示准备用于干燥和高压灭菌的网格。

使用南方黄松或 SYP，因为它代表了木材的重要来源。在美国的住宅中，使用未经处理的木材，并沿纹理从单个纵向切割中切割 19 x 19 毫米的无结块。将此长度切成 19 毫米的立方体块。

用凿子和锤子代替锯子，将 19 毫米的立方体块沿纹理劈成两半。这使得一个粗糙的块边缘朝下在农业块微观世界的塑料网上，并形成一个光滑的顶部边缘进行标记。用铅笔标记块的光滑边缘，切出足够的块以满足处理，以及未接种的对照，这些对照将用作污染监测器和基线数据样品，平行调节用于烘箱干燥材料，将样品放入铝制乳清锅中，并放入 100 摄氏度的对流烘箱中 48 小时。

将样品从烘箱转移到干燥室中冷却一次。凉。预先称量样品以确定初始卡氏炉干重。最后，用箔纸紧紧包裹以尽量减少润湿，从而准备样品，包括塑料网格和用于高压灭菌的木材。

这不需要每个样品单独包装，但蒸汽暴露量低且一致。将标记的样品在 121 摄氏度和 16 PSI 下高压灭菌 1 小时。在无菌生物安全柜中，组装空的 AE、用于接种网状植物基质外源材料的源板、Sharpie Paraform 条、镊子和转移工具。

接种的下一步是将物品添加到农业中，包含培养皿以最大限度地降低污染风险。使用时用 95% 乙醇进行火焰转移工具和镊子。首先，将塑料网添加到培养皿中。

然后在此处添加木质基材。沿网格长度添加两个木块，以便可以将早期和晚期收获的数据配对。这些块与谷物并排添加，并面向真菌接种物来源的点。

接下来，添加外源材料。这里。石膏的作用正在通过丝状真菌的腐烂进行测试。因此，真菌在到达木材之前应该遇到这些石膏盘。

在每个块和网眼顶部的接种点之间添加一个石膏盘。注意避免木头中的圆盘之间接触，同时保持它们靠得很近。对于真菌接种物，使用直径为 7 毫米的 4 号软木塞 Boer 从 20 毫升琼脂中生长的两周培养物制成栓子。

这有助于控制接种量。对于未接种的对照，最好从无菌板中添加一个塞子。不允许接种物与外源性基质或木材接触，而应将它们靠近放置。

每块使用一个接种塞。用剃刀切割的 param 密封盘子，将盘子水平，并以平稳连续的运动包裹 param。最后，使用直接在相应基材上标记块编号的耐酒精标记标记器盖。

还要在石膏盘上画圆圈。小心地将板转移到生物培养箱中，以避免推挤内容物并最大限度地减少由于温度波动引起的冷凝。这里使用的条件是 20 摄氏度，在黑暗中除最后一次收获外，在无菌条件下进行时间序列收获。

在第 5 周收获点，移除整个处理批次。用 70% 乙醇喷洒每个底部和顶部，并使用火焰镊子去除生物安全柜内的材料。在破坏农用盘子之前拍照，重点关注任何形态 F 或甜瓜。

然后去除要治疗的块。滚掉多余的 pha，但要小心不要丢失任何腐烂的材料烤箱。在铝锅中干燥块，并使用对照的新鲜和干重确定质量损失，以监测是否过度芯吸。

质量损失数据有助于衡量衰变过程，是重要的数据。如果要以克重为基础计算元素浓度，则必须对百分比数据进行归一化。对于统计数据，请标记并跟踪任何明显被水淹没的深棕色块。

最后销毁可高压灭菌袋中的培养物，节省塑料支撑网和任何其他可回收用于未来实验的成分。使用 agri block 缩影设置，松木块放在塑料网上，以将块抬高到农业接触上方。圆形 Crains 生长在与石膏表面直接接触并进入木块中。

这种菌丝体代表了木材和外源性营养元素来源之间的重要联系。在控制琼脂或固体材料中的这些外源材料来源是农业块设计与土壤块设计相比的一个关键优势，平均重量损失百分比作为 5 周和 15 周后木材腐烂程度的量度。这里显示了在农业块缩微世界中与松树的孵育。

没有治疗。对于同一字母下的每个收获棒，添加到琼脂中大于 99% 纯石膏或 1% 铁改性石膏的 5 毫摩尔氯化钙没有显着差异。误差线代表标准差，在对照棕色腐烂松木块中观察到超过 60% 的重量损失，这满足了美国材料与试验协会衰减大于 50% 的标准目标。

第 16 周时衰减的平均变异系数为 0.055。除了低变异性外，还观察到治疗效果。添加钙可以抑制真菌腐烂，无论是作为氯化钙还是作为纯石膏添加到琼脂中。

有趣的是，随着石膏中加入铁，腐烂速度会反弹。建议铁而不是钙对于观察衰变第 15 周的 5 次重复至关重要。通过相同的棕色腐烂，测试真菌，圆形核纤层蛋白，菌丝体的颜色显露出 mein。

处理间外部菌丝的差异，去除块状物并向上干燥。揭示了无钙治疗中缺乏 mein。纯钙处理中的黄变和铁改性处理中的锈迹。

该控件表示未接种的块以进行比较。有趣的是，使用高铁介质会丢失 mein 效果。总的来说，这表明这种真菌利用铁，而不是钙。

在这些材料中，我们刚刚向您展示了如何使用螺旋块设置来成功测试好氧丝状真菌对植物组织的生物降解。执行此程序时，请务必记住防止基质相互接触，尤其是植物组织和螺旋钻，尽量减少螺旋钻和血小板的水分含量，并仔细检查以确保每个板的内容物在孵育前没有移动。牢记这些变量，你可以比使用 soil 块设置时更好地控制衰变环境。

您可以生成具有回答研究问题所需的统计能力的数据。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。