Name: 一个96孔微孔板为基础的方法监测的形成和抗真菌的药敏试验白色念珠菌生物膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 了解使用96孔微孔板培养白色念珠菌生物膜并进行抗真菌药敏试验的方法。该技术操作简便、成本低廉且可重复性高，适用于高通量筛选抗真菌药物活性。

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实验室中与生物膜相关的研究工作由美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，资助项目编号为R21DE017294和R21AI080930（授予J.L.L.-R.）。本内容仅由作者负责，不一定代表NIDCR、NIAID或美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。

1. 准备 C. albicans
C. albicans 属于危险等级1级/生物安全等级1级微生物。在操作该微生物时，务必始终采用良好的无菌技术，并遵循所在机构关于生物危害材料正确处置的规程。
<ol>
	<li>制备过夜培养物 C. albicans YPD（酵母膏蛋白胨葡萄糖）液体培养基中，接种单个菌落 C. albicans 加入 25 mL YPD 中。</li>
	<li>在摇床（约180 rpm）中孵育培养物 30 °C 过夜。大多数 C. albicans 在这些条件下，菌株将作为酵母细胞生长。</li>
	<li>离心过夜培养物（约 3,000 rpm，5–10 分钟），用无菌 PBS 洗涤细胞两次，将最终沉淀重悬于约 20–25 mL RPMI 1640 培养基中，该培养基用 165 mM 吗啉丙磺酸缓冲至 pH 7.0，并预热至 37 °C （此后该培养基简称为“RPMI 1640”） </li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。计数后，制备细胞悬液，使细胞终浓度为 1.0 x 106 细胞/mL，RPMI 1640培养基 注意：由于细胞容易发生聚集，在每次洗涤之间以及移液前必须充分涡旋振荡。</li>
</ol>
2. 设置96孔微孔板以形成生物膜
<ol>
	<li> 使用多通道移液器将 100 μL 的 C. albicans 悬液加入 96 孔微孔板的选定孔中。不要向第 12 列的孔中加入细胞，这些孔将作为阴性对照。</li>
	<li> 用微孔板的原始盖子盖好整个板，用封口膜密封后放入培养箱，在 37 °C 下孵育 24 小时。孵育时间可根据具体实验设计进行调整。例如，可通过接种多个微孔板并在不同时间点（即 2、4、8、12、24 和 48 小时）分别处理各板，来检测生物膜形成的动力学过程，时间范围可为 24–48 小时。</li>
	<li> 生物膜形成后，使用多通道移液器小心吸出培养基，注意不要触碰或破坏各孔中已形成的生物膜。</li>
	<li> 使用多通道移液器用无菌 PBS 洗涤微孔板三次（每孔 200 μL）。也可使用自动微孔板洗板机进行洗涤。每次洗涤之间，尤其是最后一次洗涤后，应将微孔板倒置，用纸巾轻压以吸除残留的 PBS。此时，各孔底部形成的生物膜即使肉眼也可清晰观察到，也可使用倒置显微镜进行观察（图 1）。生物膜现已准备好用于抗真菌药物敏感性检测实验。 （若实验主要目的是评估生物膜形成的程度，则可直接采用比色法处理微孔板。此时可加入 XTT/甲萘醌试剂（见下文步骤 3），并使用微孔板读数仪测定所产生的颜色信号）。</li>
</ol>
3. 生物膜抗真菌药物敏感性试验
<ol>
	<li> 从储备液或粉末开始，用RPMI 1640培养基配制待测抗真菌药物的工作液。氟康唑的典型高浓度为1,024 μg/mL，两性霉素B和卡泊芬净的典型高浓度均为16 μg/mL。其他药物可使用不同的浓度。</li>
	<li> 使用多通道移液器，将200 μL抗真菌药物的高浓度工作液加入含有真菌生物膜的每块微量滴定板第1列的相应孔中。</li>
	<li> 向第2至第10列的每个孔中加入100 μL RPMI 1640培养基。</li>
	<li> 向第11列的孔中加入100 μL RPMI 1640培养基。</li>
	<li> 从第1列各孔中取出100 μL抗真菌药物溶液，加入相邻的第2列孔中（该孔已含有100 μL培养基）。</li>
	<li> 通过反复吹打充分混匀内容物，完成连续倍比稀释，并更换移液器吸头。</li>
	<li> 重复上述操作向右进行，直至第10列；混合后，将第10列各孔中的最后100 μL溶液弃去。由此即得到一系列倍比稀释的待测药物溶液，浓度从第1列孔中的最高浓度递减至第10列孔中的最低浓度。第11列中未加药物的生物膜作为阳性对照，第12列的空孔作为阴性对照。</li>
	<li> 盖上培养板盖，用Parafilm封口膜密封，并在37 °C条件下孵育24–48小时。</li>
	<li> 孵育结束后，按照步骤2.4的方法用PBS洗涤培养板（3次）。</li>
	<li> 使用多通道移液器，向每个含有预洗生物膜的孔以及阴性对照孔中加入100 μL XTT/甲萘醌溶液，用于测定背景XTT比色值。
	<ol>
		<li> XTT需配制成在无菌乳酸林格液、PBS或生理盐水中浓度为0.5 g/L的饱和溶液，并使用0.22 μm孔径滤器过滤除菌。XTT溶液对光敏感，配制过程中应使用铝箔避光。配制并过滤除菌后，分装为每管10 mL的工作体积，于-70 °C保存。储存时使用铝箔包裹管子以避光。仅在实验前根据需要解冻相应数量的分装管。</li>
		<li> 甲萘醌需配制成10 mM的储备液，溶剂为100%丙酮，分装为约50 μL的小体积，于-70 °C保存。使用前临时配制XTT/甲萘醌工作液：将1 μL甲萘醌储备液加入含有10 mL已解冻XTT溶液的试管中。</li>
	</ol>
 </li>
	<li> 用铝箔包裹培养板，于37 °C避光孵育2小时。</li>
	<li> 取下铝箔。使用多通道移液器从每个孔中吸取80 μL显色后的上清液，转移至新的微量滴定板的相应孔中。</li>
	<li> 使用微量滴定板读数仪在490 nm波长下读取吸光度值。</li>
	<li> 计算最低抑制浓度SMIC50和SMIC80，即与未加抗真菌药物的对照生物膜（本实验中为第11列的数值）相比，比色读数分别降低50%或80%时的抗真菌药物浓度（注意：还需从实验孔读数中减去仅含XTT的阴性对照孔，即第12列孔的读数）。SMIC结果可以以表格形式呈现（例如多种分离株对多种抗真菌药物的结果），也可针对每种真菌分离株与每种抗真菌药物的组合，通过绘制抑制率对药物浓度的曲线图来展示结果。</li>
</ol>
示例： 扣除阴性对照的数值后，第11列中对照生物膜的平均吸光度（O.D.）为1.32。SMIC50是指能够引起 &gt; 比色读数降低50%时的浓度，在本例中为小于1.32 × 50/100 = 0.66。同理，SMIC80是指引起最低抗真菌浓度 &gt; 比色读数减少80%，在此情况下小于1.32 × 20/100 = 0.264。
4. 代表性结果
图1显示了一张显微照片 C. albicans 在96孔微孔板的孔底形成的生物膜，使用倒置显微镜拍摄。图2显示XTT比色法读数（OD490 每个11种生物膜的值） C. albicans 野生型菌株在同一个96孔微孔板的8个不同行中形成。图3显示了两性霉素B在不同浓度下对 C. albicans 生物膜；箭头指示 SMIC50 和 SMIC80 值。
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="细菌生长比较；显微镜和扫描电镜图像；细胞形态学研究；比例尺可见。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1.(A) 图A显示了使用倒置显微镜连接相机拍摄的白色念珠菌（C. albicans）生物膜的显微照片，该生物膜形成于孔板底部，在吸除RPMI培养基并用PBS洗涤后获得。(B) 采用扫描电子显微镜观察的典型白色念珠菌（C. albicans）生物膜的显微图像。图A和图B的比例尺分别为100 μm和10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="XTT 检测结果；比色分析图显示样品读数及对比数据" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 多个等效物的形成 C. albicans 96孔微孔板中的生物膜 比色读数（OD490 XTT还原实验测得的生物膜形成值 C. albicans 野生型在微量滴定板孔中的生物膜形成情况。数据来自同一块96孔微量滴定板中8个不同行各自独立形成的11个生物膜。采用单因素方差分析对不同行的结果进行比较，并结合Bartlett's方差齐性检验和Bonferroni多重比较事后检验。在对所有行两两比较时，未发现具有统计学意义的显著差异（P < 0.05）。 &gt; 0.05).
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="抗真菌药物敏感性图，XTT 检测，两性霉素 B 剂量-反应，SMIC50/80 值" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 针对真菌的抗真菌药物敏感性试验典型结果 C. albicans 生物膜 不同浓度两性霉素B对生物膜抑制效果的典型结果图 C. albicans 野生型菌株。数值表示相对于对照孔的XTT还原实验平均吸光度百分比。SMIC50和SMIC80值由箭头指示。

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
<li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+2%2C3-bis%282-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl%29-5-%5B%28phenylamino%29carbonyl%5D-2H-t+etrazolium+hydroxide+%28XTT%29+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li>
<li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%3A+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R 在 MicrobeHTS Technologies, Inc. 持有股权，该公司正在开发抗真菌药物。本研究未获得 MicrobeHTS Technologies, Inc. 的任何资金支持。

本文介绍一种简单、快速、经济且高度可重复的96孔微孔板模型，用于形成Candida生物膜，并结合XTT比色法检测生物膜内细胞的代谢活性。该96孔微孔板生物膜形成模型最初为C. albicans开发，但也可用于其他Candida spp.，并可轻松适用于其他真菌生物体。该方法可用于考察影响生物膜形成的多种参数和因素，评估多个真菌分离株和/或突变株的生物膜形成能力。但更重要的是，该方法在测定生物膜内细胞的抗真菌药物敏感性方面具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>沙氏葡萄糖琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>用于真菌分离株新鲜传代培养平板的制备</td></tr><tr><td>YPD：酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>用于过夜液体培养物增殖的培养基</td></tr><tr><td>不含碳酸氢钠并添加L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>用于生物膜形成的液体培养基</td></tr><tr><td>吗啉丙磺酸（MOPS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>用于缓冲RPMI 1640培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>洗涤用缓冲液</td></tr><tr><td>XTT钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>制备方法见上文</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s lactate</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>用于XTT溶液的配制</td></tr><tr><td>甲萘醌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>注意：经皮肤接触、吸入或摄入后具有危害性</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板：聚苯乙烯，平底，组织培养处理</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器及吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于96孔微孔板的真菌生物膜形成监测及抗真菌药物敏感性检测方法 白色念珠菌 生物膜

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

白色念珠菌 仍然是不断扩大的免疫功能低下患者群体中真菌感染最常见的病因，而念珠菌病现已成为美国医院内第三大常见感染。念珠菌病的不同临床表现均与生物膜的形成有关，无论是在宿主组织上和/或医疗器械（如导管）上。生物膜的形成具有不良的临床后果，因为生物膜内的细胞可免受宿主免疫反应以及抗真菌药物的作用。我们已开发出一种简单、快速且稳健的 体外 形成模型 C. albicans 使用96孔微孔板进行生物膜培养，该方法也可用于生物膜抗真菌药物敏感性检测。本实验采用比色法读数，其原理基于代谢活跃的真菌生物膜细胞还原XTT（一种四唑盐）。典型的实验流程包括约24小时的生物膜形成阶段，随后进行约24小时的抗真菌药物敏感性检测。由于该方法操作简便，且仅需常规实验室材料与设备，因而降低了生物膜研究的技术门槛，是实现真菌生物膜抗真菌药物敏感性检测标准化的重要一步。

我们介绍一种使用96孔微孔板形成Candida albicans生物膜的简单、快速且稳健的方法，并阐述其在检测生物膜内细胞抗真菌药物敏感性中的应用。

白色念珠菌仍然是不断扩大的免疫功能低下患者群体中真菌感染最常见的病因，而念珠菌病目前是第三大……

本实验的总体目标是形成白色念珠菌生物膜，并检测其对抗真菌药物的敏感性。首先在96孔微孔板的孔中形成真菌生物膜，随后将抗真菌药物加入已形成的生物膜中，在37°C下孵育24至48小时。采用一种比色法检测生物膜内细胞的代谢活性，以评估这些抗真菌药物的活性，从而确定抗真菌药物对生物膜的最低抑菌浓度。最终可通过一种简单、便捷的基于96孔微孔板并结合比色读数的方法，获得生物膜形成能力及抗真菌药物敏感性测试结果。该技术的主要优势在于操作简便、成本相对较低、重复性高，并可实现多个等效生物膜的同步形成。此外，该技术与大多数科研和临床实验室中常见的96孔板平台技术兼容。该技术的应用前景涉及犬科动物的治疗，因为这些感染通常与生物膜的形成相关。采用正确的微生物操作技术，从沙氏葡萄糖琼脂平板上新鲜传代的白色念珠菌菌落中挑取一环菌体，接种于含有 25 毫升酵母胰蛋白胨葡萄糖肉汤的 125 毫升三角烧瓶中，将培养物置于转速为 180 转/分钟、温度为 30 摄氏度的摇床中，过夜培养。过夜培养后，将酵母菌液倒入 50 毫升锥形离心管中，在 3000 转/分钟条件下离心 5 至 10 分钟，弃去上清液，涡旋重悬沉淀。剧烈振荡沉淀以充分分散细胞。然后加入无菌PBS洗涤，再次离心培养物。重复此洗涤步骤一次，随后重悬细胞。在约20毫升pH 7.0的RPMI 1640培养基中，使用165毫摩尔的MOPS缓冲液，并在37摄氏度预热。从此悬浮液中，使用标准血细胞计数板和明场显微镜，制备1:100的稀释液。计数细胞。然后，用预热的缓冲 RPMI 1640 培养基制备细胞终浓度为每毫升1×10⁶个细胞的悬液。使用多通道移液器，将100 µL的白色念珠菌悬液加入无菌96孔平底微孔板中选定的孔内。第12列的孔保持空置，作为阴性对照。用封口膜覆盖并密封培养板后，在37摄氏度下孵育24小时，以使生物膜形成。孵育结束后，轻轻吸出并弃去每孔中的培养基，注意不要破坏在孔底形成的生物膜。向每个孔中加入200 µL PBS进行洗涤，并通过小心地将平板倒置并轻压在叠好的纸巾上以去除液体。重复此洗涤步骤三次。此时，生物膜已可通过肉眼观察，并可使用倒置显微镜或扫描电镜（SEM）进行观察。我们可以观察到，生物膜由交织在一起的菌丝和酵母细胞混合物组成。一旦确认生物膜已形成，即可使用缓冲的RPMI 1640培养基开始抗真菌药物的测试，并配制待测抗真菌药物的高浓度工作液。通常，氟康唑的高浓度为1024微克/毫升，两性霉素B和CASPO fungi beri的高浓度为16微克/毫升。接下来，向第一列的各孔中加入 200 微升抗真菌溶液，并向第二至第十一列的各孔中加入 100 微升缓冲 RPMI 1640 培养基。通过将第一列各孔中的高浓度抗真菌溶液各 100 微升转移至第二列相应孔中，进行一系列连续的倍比稀释。轻轻吹打混匀后，从第二列各孔中吸取100微升加入第三列各孔中，依此类推直至第10列。第11列不添加任何抗真菌溶液，作为阳性对照，同时弃去第10列各孔中最后的100微升。除第12列各孔外，其余各孔均按此操作。此时总体积应为100微升。盖好板子，用封口膜密封，并在37摄氏度孵育24至48小时，使抗真菌药物发挥作用。孵育结束后，按前述方法用PBS洗涤板子3次，然后向所有孔（包括阴性对照孔）每孔加入100微升XTT培养基溶液。第12列。盖上板盖，用铝箔纸包裹以避光，并在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，打开铝箔纸以进行显色。最初澄清的XTT溶液经代谢活跃的细胞处理后会变为橙色。将80微升有色上清液转移至新的平底微孔板中。使用设定在490纳米波长的比色微孔板读数仪读取微孔板，如图所示。在无抗真菌药物存在的情况下，比色读数未经处理。不同行中SEA申请者的生物膜是等效的。为了首先评估所测试抗真菌化合物的效果，需从第12列阴性对照孔中获得的平均背景值中减去所有其他数值。接着，利用第11行的阳性对照计算抑制百分率。最大值是指检测到比色读数下降50%或80%时的抗真菌药物浓度，被称为Cecil最小抑菌浓度。这些数值通常被用作衡量化合物活性的参考指标。通过这种简单高效的高通量方法，可在体外24小时内形成真菌生物膜，并在方法初步建立后，对所选化合物进行抗真菌活性的筛选。该技术为医学真菌学领域的研究人员探索生物膜形成以及检测抗真菌药物的活性铺平了道路。此外，生物膜中的细胞。

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一个96孔微孔板为基础的方法监测的形成和抗真菌的药敏试验白色念珠菌生物膜

该实验方法描述了一种快速检测细菌和真菌早期生物膜形成的手段。该方法以微量滴定板作为微生物形成生物膜的基质，并利用结晶紫染色对生物膜进行可视化观察。该实验可提供针对早期生物膜形成的定性或定量分析。...

微量滴定板生物膜形成实验

我们开发了一种高密度微阵列平台，该平台由名为CaBChip的白色念珠菌（C.

Candida albicans 生物膜芯片（CaBChip）用于高通量抗真菌药物筛选

一种用于抗真菌化合物筛选的体外液体微量稀释法检测

本视频演示了一种 体外 研究抗体对真菌生物膜作用的技术。致病性真菌 Candida tropicalis...

一种用于评估抗体作用的体外检测方法 Candida tropicalis 生物膜

我们介绍了一种在小鼠皮下模型中建立Candida...

Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

本方案描述了使用可定制的自动化微流控装置来观察生物膜形成的实验方法 Candida albicans...

生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

一种简便且可适应的肉汤微量稀释法，用于筛选抗真菌化合物和提取物。...

微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法

在此，我们提供了一种逐步操作方案，用于研究线粒体呼吸和糖酵解功能 白色念珠菌...

使用实时细胞外通量分析对Candida albicans进行生物能量学研究

观察和量化内部特征 白色念珠菌...

澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

本方案描述了一种获取肽类及其他化合物（如小分子抗真菌剂）对白色念珠菌（Candida...

量化肽类物质对真菌的抗真菌活性 白色念珠菌

本文描述了一种基于96孔微孔板的实验方案，利用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-羧基苯胺-2H-四唑（XTT）还原法检测抗体对C.

一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

了解使用96孔微孔板培养白色念珠菌生物膜并进行抗真菌药敏试验的方法。该技术操作简便、成本低廉且可重复性高，适用于高通量筛选抗真菌药物活性。

一种基于96孔微孔板的真菌生物膜形成监测及抗真菌药物敏感性检测方法白色念珠菌生物膜

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一种基于96孔微孔板的真菌生物膜形成监测及抗真菌药物敏感性检测方法 白色念珠菌 生物膜

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