一个96孔微孔板为基础的方法监测的形成和抗真菌的药敏试验白色念珠菌生物膜
October 21st, 2010
我们描述了一个简单，快速和可靠的方法形成白色念珠菌生物膜在细胞内生物膜的抗真菌药敏试验使用96孔板和它的效用。
该程序的总体目标是形成白色念珠菌生物膜，并检查它们对抗真菌剂的敏感性。这是通过首先在 96 的孔上形成这些真菌生物膜来实现的。孔微量滴定板，然后将抗真菌剂添加到预先形成的生物膜中，并在孵育后孵育 24 至 48 小时。
测量生物膜内细胞代谢活性的 chole metric 方法用于测量这些抗真菌药的活性，以确定抗真菌药对生物膜的最低抑制浓度。最终，可以获得结果，表明通过一种简单易用的基于 96 孔微量滴定板的方法与色度读数相结合，能够形成生物膜和抗真菌药敏试验。该技术的主要优点是它简单、相对便宜、高度可重复，并允许形成多个等效生物膜。
此外，它还与大多数研究和临床实验室中常用的 96 孔平台技术兼容。这项技术的影响延伸到犬科动物的治疗。因为很多时候，这些感染与生物膜的形成有关。
使用适当的微生物处理技术，从 SAU 葡萄糖铜板 Alan 上的新鲜白色淀粉亚培养物中取出一个充满细胞的环，并接种到含有 25 毫升酵母辣椒葡萄糖肉汤的 125 毫升锥形瓶中，将培养物置于设置为 180 RRP M 和 30 摄氏度的轨道振荡器中，并在过夜孵育后孵育过夜。将酵母培养物倒入 50 毫升锥形管中，以 3000 RBM 离心 5 至 10 分钟。弃去上清液涡旋。
该沉淀剂用力去分离细胞。然后加入无菌 PBS 进行洗涤，然后再次离心培养物。重复此洗涤步骤一次，然后重新弯曲细胞。
在约 20 mL RPMI 1640 中，缓冲至 pH 7.0 的培养基中。使用 165 毫摩尔拖把溶液，并从该悬浮液中预热至 37 摄氏度，使用标准血细胞仪和明场显微镜制备 1 至 100 稀释液。计数细胞。
然后在温热缓冲 RPMI 1640 中使用每毫升 6 次中的 10 次制备最终细胞悬液。使用多通道移液器将 100 μL 白色海悬浮液注入无菌 96 孔平底微量滴定板的选定孔中。将第 12 列中的孔留空，因为它们将用作阴性对照。
用 paraform 覆盖和密封板后，将其在 37 摄氏度下孵育 24 小时以形成生物膜。孵育后，轻轻吸出并丢弃每个孔中的培养基。注意不要破坏底部形成的生物膜。
以 200 微升 PBS 洗涤每个孔，并在一叠纸巾上小心地倒置和吸干板以沥干。重复此洗涤步骤 3 次。此时，生物膜可以通过肉眼检测到，并且可以使用 SEM 的倒置显微镜进行可视化。
我们可以理解生物膜由细丝和酵母细胞交织在一起的混合物组成。一旦验证了生物膜的形成，就可以开始使用缓冲 RPMI 1640 培养基进行抗真菌剂的测试，准备待测抗真菌剂的高浓度工作溶液。典型的高浓度氟康唑为 1024 μg/mL，两性霉素 B 和 CASPO 真菌贝里为 16 μg/mL。
接下来，向第一列的孔中加入 200 微升抗真菌溶液和 100 微升缓冲 RPMI 1640。第 2 至 11 列的中等至孔。通过将 100 μL 高浓度抗真菌溶液从第一柱的孔转移到第二柱的孔中，进行一系列连续倍增稀释。
轻轻上下移液混合后，将 100 微升移液器从 2 柱的孔中移入 3 柱的孔中，依此类推直至第 10 柱。不要向第 11 列添加任何抗真菌溶液，因为它将用作阳性对照，并丢弃第 10 列孔中的最后 100 μL。除第 12 列中的井外的所有井。
现在的最终体积应该是 100 微升。盖上板子，用香水密封，然后在 37 摄氏度下孵育 24 至 48 小时，以使抗真菌药在孵育后发挥作用。如前所述，在 PBS 中洗涤板 3 次后，每孔向所有孔中加入 100 微升 XTT medion 溶液，包括阴性对照孔。
在第 12 列中。盖上板子，用铝箔包裹以保护其避光，并在 37 摄氏度下孵育两个小时。为了在孵育后显色，请展开板。
最初透明的 XTT 溶液在被代谢活跃的细胞处理后会变成橙色。将 80 μL 有色上清液转移到新鲜的平底微量滴定板中。使用设置为波长为 490 纳米的比色微量滴定读板器读取板，如图所示在没有抗真菌药的情况下，比色读数未经处理。
SEA 申请人在不同行中的生物膜是等效的。为了评估首先测试的抗真菌化合物的效果，从所有其他值中减去从第 12 列中的阴性对照孔获得的平均背景值。接下来，使用第 11 行中的阳性对照计算抑制百分比。
作为最大值，检测到比色读数降低 50% 或 80% 的抗真菌药浓度称为 Cecil 最低抑制浓度。这些值通常用作化合物效力的参考量度。使用这种简单的高通量方法，可以在 24 小时内在体外形成真菌生物膜，并且可以在初始开发后筛选选定的化合物的抗真菌活性。
这项技术为医学真菌学领域的研究人员探索生物膜形成和检查抗真菌剂的活性铺平了道路。同样，生物膜中的细胞。
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概述
本文介绍了一种使用96孔微量板形成白色假丝酵母菌生物膜的简单有效方法。该方法特别适用于评估生物膜细胞的抗真菌药物敏感性。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 真菌学
- 抗真菌药物敏感性测试
背景
- 白色假丝酵母菌是一种常见的真菌病原体。
- 生物膜在治疗真菌感染方面提出了重大挑战。
- 了解生物膜中的抗真菌药物敏感性对于有效治疗至关重要。
- 传统方法可能无法准确反映生物膜的行为。
研究目的
- 开发一种快速形成生物膜的方法。
- 评估抗真菌药物对生物膜的有效性。
- 使用微量板建立可重复的测试协议。
所用方法
- 在96孔微量板中形成白色假丝酵母菌生物膜。
- 用抗真菌药物孵育生物膜24到48小时。
- 使用比色法评估代谢活性。
- 确定抗真菌药物的最小抑制浓度（MIC）。
主要结果
- 成功形成了白色假丝酵母菌生物膜。
- 该方法显示出高可重复性和易用性。
- 抗真菌药物敏感性测试提供了明确的结果。
- 该方法具有成本效益，并允许多个样本。
结论
- 这种方法是研究白色假丝酵母菌生物膜的有价值工具。
- 它便于评估抗真菌药物敏感性。
- 该技术可以增强真菌病理学和治疗的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized, high-throughput biofilm formation and antifungal susceptibility testing are critical for de-risking early antifungal discovery and supporting translational research in fungal pathogenesis. This 96-well microtiter plate-based method enables reproducible, quantitative assessment of Candida albicans biofilms, directly informing compound prioritization and portfolio advancement. Its simplicity and scalability facilitate cross-program comparability and enterprise-wide adoption in antifungal R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of antifungal efficacy against clinically relevant biofilm phenotypes.
- Supports functional validation of targets by quantifying biofilm metabolic activity in response to compounds.
- Facilitates predictive confidence in candidate selection by providing standardized minimum inhibitory concentration (MIC) data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biofilm systems for downstream antifungal screening workflows.
- Delivers quantitative, colorimetric readouts suitable for high-throughput compound evaluation.
- Supports assay standardization and scalability across research and clinical laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm susceptibility data with disease-relevant infection models.
- Enables continuity from early discovery through preclinical antifungal validation.
- Provides risk-adjusted data for advancing compounds with demonstrated biofilm activity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical antifungal evaluation, supporting hypothesis-driven compound triage and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Quantifies antifungal impact on biofilm metabolic activity, clarifying compound mechanism of action.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay readiness for antifungal libraries.
- Analytics: Generates MIC and percent inhibition data for cross-condition comparison and decision-making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to infection-relevant biofilm models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for ongoing antifungal R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal candidate evaluation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm susceptibility testing.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antifungal assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological handling and biofilm quantification.
- Needs access to standard 96-well plate readers and colorimetric detection infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis protocols.
- Adaptable to various antifungal agents and potentially other fungal species with validation.
- Limited to in vitro biofilm models; translational alignment with in vivo systems should be considered.
