Name: 蠕虫病毒实验室介绍:从培养蠕虫突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习利用EMS和TMP/UV两种诱变方法培养Pristionchus pacificus线虫，通过表型筛选鉴定基因功能。该技术为神经科学与发育生物学研究提供重要的遗传学工具。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号 IOB#0615996。

第1部分：制备线虫生长培养基（NGM）培养皿
实验用线虫（如 C. elegans 和 P. pacificus）通常在含有线虫生长培养基（NGM）的 6 cm 培养皿中进行实验室培养1。线虫一般保存在 20°C 条件下，但可根据线虫种类和实验设计，在一定温度范围（4°C - 25°C）内进行培养。制备含 NGM 的培养皿时，必须采用标准的无菌操作技术，以防止真菌和细菌污染。以下是制备 NGM 培养皿的实验方案：
<ol>
	<li>称取 15 g 琼脂、2.4 g NaCl、2 g 胰蛋白胨和 2.72 g KH2PO4 在2 L锥形瓶中加水定容至1 L，高压灭菌后冷却至 60° C 在水浴中。</li>
	<li>每次加入 0.8 ml 的 1 M CaCl₂2，胆固醇（5 mg/ml，溶于乙醇），以及 1 M MgSO₄4为防止真菌和细菌污染，可在每升培养基中加入1 ml链霉素（100 mg/ml）和1 ml制霉菌素（10 mg/ml）。</li>
	<li>使用 Unispense 仪器并在无菌条件下，将培养基倒入所需培养皿中。培养皿应填充至约 2/3 满rd 完全凝固。标准的60 mm直径培养皿需要约10 ml培养基。在琼脂完全凝固之前不要移动培养皿；否则琼脂表面会不平整，导致在体视显微镜下难以聚焦线虫。</li>
	<li>干燥后，可立即接种平板，或储存于 4° C 直至接种细菌前。</li>
</ol>
第2部分：制备OP50细菌并接种NGM培养皿
P. pacificus 在实验室中通过喂养于 E.coli OP50 菌株。OP50 在 NGM 平板上的生长受限，因而形成稀疏的菌苔，有利于线虫的观察1. 培养OP50菌株时，使用LB液体培养基：
<ol>
	<li>在500 ml带螺旋盖的瓶中加入5 g胰蛋白胨、2.5 g酵母提取物和2.5 g NaCl，用蒸馏水定容至500 ml，然后进行高压灭菌。</li>
	<li>在无菌条件下，从培养平板中挑取单个OP50菌落接种至液体培养基中，于37°C过夜培养。</li>
	<li>LB-OP50培养基即可使用，若保持无菌状态，可在4°C保存数月。每次需要涂布平板时，可将少量培养基倒入无菌小烧杯中使用，以避免污染原菌种储备液。</li>
	<li>涂布平板时，取100–120 μl OP50菌液滴加至直径为60 mm的NGM培养皿中，轻轻旋转混匀使其均匀铺展。</li>
	<li>将涂布后的平板于室温下过夜培养，使菌苔生长。这些涂布好的平板现可于4°C保存最多3周。倒置存放有助于防止培养基过快干燥。</li>
</ol>
第3部分：进行挑取
本节介绍如何制作线虫挑取针。该挑取针用于将线虫从一个位置转移到另一个位置。挑取针由30号90%铂金和10%铱合金丝制成，但部分研究人员可能偏好略有不同的金属配比：
<ol>
	<li>剪取约 3-4 cm 的金属丝，将其中 0.5 cm 插入已截短尖端的巴斯德移液管尖端内，然后在本生灯上将其密封于玻璃中。金属丝从玻璃中伸出的长度约为 3-3.5 cm，可根据个人偏好调整。</li>
	<li>使用锤子或钳子将伸出的金属丝末端压平，然后将压平部分向上弯曲形成小铲状。</li>
	<li>用砂纸打磨接种针的锋利边缘，以避免损伤线虫或琼脂培养基。</li>
</ol>
第4部分：挑选线虫
<ol>
	<li>挑取线虫时，将铂金丝在火焰上灭菌，然后用其扁平的尖端轻轻刮取细菌菌苔，使尖端附着一层浓稠黏性的细菌，注意不要刺破或损伤琼脂表面。</li>
	<li>在体视显微镜下，将带有黏性细菌的尖端轻轻接触需要转移的线虫，直至线虫黏附到挑棒上的细菌中。</li>
	<li>一旦线虫附着在挑棒尖端，应立即将其转移到新培养皿中，通过将挑棒尖端轻触或滑过新培养皿上的细菌菌苔，使线虫爬离挑棒。操作时需小心避免损伤培养皿上的琼脂表面，否则线虫可能钻入孔洞中，难以找回。若线虫在挑棒上停留过久，可能会因干燥而死亡。</li>
</ol>
第5部分：EMS诱变
甲基磺酸乙酯（EMS）可在基因组中诱导产生广泛的突变。可通过产卵缺陷、肌肉异常、性别决定异常、dauer形成、行为改变以及性腺形成缺陷等表型来鉴定突变体。EMS诱变的实验方案与所描述的类似 秀丽隐杆线虫 1.
<ol>
	<li>配制 500 ml（或更多）的 1N NaOH 溶液。</li>
	<li>取 4–5 个直径为 6 cm 的培养皿，其中含有数百条处于三龄幼虫（J3）阶段的线虫，每皿用 2–3 ml 无菌 M9 缓冲液冲洗，将线虫洗下。</li>
	<li>将所有线虫收集至一个无菌的一次性 15 ml 离心管中，在 1500 × g 条件下离心 5–7 分钟，直至线虫形成沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，加入 2 ml M9 缓冲液重悬线虫。在含有 2 ml M9 缓冲液的离心管中加入 20 μl EMS，振荡使其溶解，然后将该 EMS 溶液加入 2 ml 线虫悬液中，轻轻混匀。最终 EMS 浓度为 47 mM。注意：EMS 是一种强效诱变剂，必须在通风橱中操作。所有接触过该诱变剂的材料（手套、移液器、枪头等）均需用 1N NaOH 处理以灭活 EMS。在整个 EMS 诱变过程中应佩戴双层手套，并按照所在机构的规定处理危险废物。</li>
	<li>将离心管盖紧，用封口膜封住管盖，水平放置于通风橱内，使线虫孵育 3.5 小时。也可将离心管置于低速摇床上进行孵育。</li>
	<li>将离心管翻转，再次用封口膜封住管盖，竖直放置，继续孵育直至线虫沉底。</li>
	<li>吸除上清液，并将其弃入盛有 1N NaOH 的烧杯或锥形瓶中，以灭活残留的 EMS。</li>
	<li>向沉淀中加入 5 ml M9 缓冲液，倒置混匀 25–30 次以清洗线虫，在 1500 × g 条件下离心 5–7 分钟，直至线虫形成沉淀。吸除上清液，并将其弃入含 1N NaOH 的烧杯中。</li>
	<li>重复清洗步骤至少 3 次。</li>
	<li>最后一次清洗后，用少量 M9 缓冲液（约 500 μl）重悬线虫沉淀，用移液器将线虫转移至铺有 OP50 菌苔的 NGM 培养基平板上。此时无需再在化学通风橱中操作。</li>
	<li>等待液体干燥数分钟，然后在显微镜下挑选外观健康的 J4 幼虫，转移至新的接种平板上。根据所在机构的危险废物处理规定丢弃原始平板。</li>
	<li>让经诱变处理的线虫自体受精，利用体视显微镜观察 F2 代的表型，筛选感兴趣的隐性突变体。</li>
</ol>
第6部分：补骨脂素诱变
本部分介绍了使用三甲基补骨脂素（TMP）结合长波紫外线（UV）进行诱变的方法。TMP/UV诱变法被广泛用于在基因组内诱导缺失突变3。
<ol>
	<li>按照前述步骤，从4-5个直径为6 cm的培养皿中收集线虫至15 ml离心管中。</li>
	<li>加入10 ml M9溶液，倒置混匀20次以清洗线虫，然后在1500 × g离心5分钟。弃去上清液，共重复洗涤3次。用移液器吸尽液体后，将线虫重悬于约10倍其体积、含30 μg/ml TMP的M9溶液中。将20 μl TMP（3 mg/ml）移液至2 ml M9溶液中。与EMS类似，TMP是一种强效致癌物，操作时必须采取适当的安全防护措施。为避免紫外线可能带来的风险，应佩戴适当的护目镜。所有一次性耗材必须丢弃至指定的生物危害垃圾袋中。</li>
	<li>将离心管置于黑暗环境中，在室温下低速摇床上（40 UPM）孵育15分钟。将盖好的离心管垂直静置10分钟，使所有线虫沉降至管底。</li>
	<li>用巴斯德吸管从管底吸取线虫，转移至未接种的NGM平板上。根据所在机构的危险化学品处理规范丢弃上清液。</li>
	<li>将平板置于黑暗环境中，直至过量TMP被平板完全吸收。</li>
	<li>使用紫外光强度计，调节长波紫外光源与平板之间的距离，使平板表面的光强为500 μW/cm2 4。移去铝制遮盖物和平板盖，将含有经TMP处理的线虫的平板暴露于长波紫外辐射下50秒。</li>
	<li>重新盖好平板，在室温下黑暗环境中静置5小时。</li>
	<li>挑选表型健康的J4期幼虫，转移至新鲜的接种平板上。根据所在机构的危险化学品处理规范丢弃原始平板。</li>
	<li>利用体视显微镜，筛选F2代中目标突变的表型。</li>
</ol>
第7部分：代表性结果
图1展示了通过诱变（EMS或TMP/UV处理）获得的部分P. pacificus突变体表型。每个突变体均具有可与野生型个体明显区分的特征性表型。将经诱变处理的线虫中来自亲代（P0）的30条J3/J4期幼虫分别放入不同的培养板中，使其产卵，得到F1代。从表现出健康F1后代的培养板中，共挑选1000条F1个体转移至单独的培养板中，并对F2代后代进行表型筛选。结果发现了具有短粗（Dumpy）5,6、运动失调（Uncoordinated）6和性别转换（Transformer）7表型的个体。
<img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="显示不同行为学研究位置的线虫显微镜图像；比例尺：500μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. Pristionchus pacificus 野生型及突变型个体。A. 野生型雌雄同体；B. 野生型雄性；C. dpy 突变体；D. unc 突变体；E. tra 突变体。上方两幅图显示野生型雌雄同体（左）和雄性（右）个体，用于与其余图中的不同突变体进行比较。

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

诱变是各种实验模式生物中广泛采用的遗传学研究技术。诱变实验常用于鉴定基因的功能2。此处描述的诱变方法不仅适用于P. pacificus，也适用于C. elegans及其他相关线虫物种。本文将介绍两种方法：EMS诱变和TMP/UV诱变。
EMS 是一种化学诱变剂，可在整个基因组中诱导点突变或小片段缺失3,8。补骨脂素诱变（TMP/UV）主要因紫外线照射可能导致DNA断裂，从而引发缺失突变。缺失片段的长度通常在 0.10 至 15 kb 之间3。
我们筛选了较为常见的表型。在使用EMS进行的筛选中，每400块含有F2代动物的培养板中，大约有1块会出现Dpy、Unc或Tra表型。Dpy表型可通过其较短的体型来识别7，Unc表型则表现为运动异常6，而Tra表型具有雄性表型且核型为XX7。与EMS相比，TMP/UV诱变产生突变体的频率较低3，但能...

从线虫培养到诱变：线虫实验室入门指南

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

本实验方案描述了在实验室中培养线虫的方法，以及使用两种不同方法对线虫进行诱变的技术：甲基磺酸乙酯（EMS）诱变法和4,5',8-三甲基补骨脂素联合紫外线（TMP/UV）诱变法。由于线虫具有结构简单的身体构造和独特的繁殖系统（由可自体受精的雌雄同体个体和能够产生大量后代的雄性组成），因此是遗传学研究中强有力的生物模型。线虫可在含有细菌菌苔的琼脂平板上培养，并可通过挑针轻松地从一个平板转移到另一个平板。EMS是一种烷化剂，常用于诱导点突变和小片段缺失，而TMP/UV处理则主要诱导较大片段的缺失。根据所使用的线虫物种不同，EMS和TMP的使用浓度需进行优化。为分离线虫Pristionchus pacificus的隐性突变体，我们对F2代个体进行了表型的肉眼筛选。为演示这些方法，我们对线虫进行了诱变处理，并筛选了运动不协调（Unc）、体形粗短（Dpy）和性别转换（Tra）等突变表型。

筛选具有表型缺陷的突变体是鉴定参与特定生物学过程基因的直接方法。本文介绍了如何在实验室中培养自由生活的线虫（例如 Pristionchus pacificus），并展示了两种不同的诱变方法：EMS 和 TMP/UV。

本方案描述了在实验室中培养线虫的步骤，以及使用两种不同方法通过甲基磺酸乙酯（ethyl methane ...）对线虫进行诱变的方法。

本实验的总体目标是实施两种常用的诱变方案，用于产生突变体和线虫，例如秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、嗜肝病毒秀丽线虫（hepatitis elegance）和普里司卡线虫（prisca）。太平洋线虫诱变法是一种揭示基因功能的强大工具。该方法首先准备含有大量处于成虫前最后一个幼虫阶段线虫的培养物，随后在此基础上进行诱变处理。下一步是使用两种替代方法对线虫进行诱变：乙基甲烷磺酸处理，或结合紫外线辐射的秋水仙素诱变。该实验方案的第三步是将外观健康的线虫转移至已新鲜接种细菌的培养皿中，细菌是其食物来源。该实验方案的最后一步是在第一、第二或第三代中筛选感兴趣的突变表型。您好，我是来自德克萨斯大学阿灵顿分校生物系Andre Perez博士实验室的Jore Silva。T-M-P-U-V和EMS诱变技术有助于回答遗传学研究领域的一些关键问题，例如哪些基因参与了在发育过程中起重要作用的生物学过程。您好，我叫Manish Phar，尽管本视频所演示的诱变方法针对的是斑马鱼（Pristi Onca S Pacificus），但这些方法也可广泛应用于其他实验模型，例如秀丽隐杆线虫（nematode sea elegance），甚至包括斑马鱼等脊椎动物。那么，让我们开始吧。我们选用的转移线虫的工具是由30号规格、90%铂和10%铱的金属丝制成的挑针。尽管一些研究人员可能偏好略有不同的金属配比来制作挑针，但也可使用移液管来持握挑针。首先将巴斯德移液管的延长尖端折断至所需长度。剪取约三到四厘米的金属丝，并将其中0.5厘米插入巴斯德移液管尖端，然后在本生灯上加热，将金属丝密封在玻璃内。从玻璃管中伸出的金属丝长度约为三至三厘米半，可根据个人偏好调整。使用镊子将伸出端的金属丝末端压平，然后将压平部分向上弯曲，形成一个小铲状结构。最后，用砂纸磨平挑针的锋利边缘，以防止损伤线虫或琼脂。挑取线虫时，先将挑针的金属丝在火焰上灭菌，然后将压平的针尖轻轻拖过NGMP树板上的细菌菌苔，使针尖沾上浓稠的黏性细菌。操作时需使用体视显微镜，动作要轻柔，注意避免刺破或损伤琼脂表面。将粘性挑环轻轻接触待挑取的线虫，直至线虫粘附在挑环上的细菌中。一旦线虫附着在挑环尖端，立即将挑环接触或轻滑至新培养皿的细菌菌苔表面，完成转移。操作时需格外小心，避免损坏培养皿的琼脂表面，防止线虫爬入孔洞中而难以找回。线虫在接触或轻轻滑动接种针尖端与细菌菌苔时，应自行爬离接种针。线虫不应在接种针上停留过久，以免脱水。我们将对四至五个直径为六厘米的培养皿中的秀丽隐杆线虫三龄幼虫进行EMS诱变处理。每块平板使用 2 至 3 毫升无菌 M9 液体冲洗线虫，每块平板应获得数百条线虫。将线虫收集至无菌的一次性 15 毫升离心管中。在1500 × g条件下离心5至7分钟，或直至线虫形成沉淀。吸除上清液，并使用2 mL M9缓冲液重悬线虫，操作时佩戴双层手套并在通风橱中进行。向含有2 mL M9缓冲液的离心管中加入20 µL EMS，振荡使其溶解。然后将该溶液加入2 mL线虫悬液中，轻轻涡旋混匀。EMS 的终浓度为 47 毫摩尔。将含有对苯二甲醛的离心管置于通风橱内的低速摇床上，让线虫孵育 3.5 小时。3.5 小时孵育结束后，将离心管垂直放置，继续孵育直至线虫沉底，随后吸除上清液，并将其弃入含有 1 N 氢氧化钠的烧杯中，以灭活上清液中的 EMS。每次将手从通风橱中取出之前，务必也在1 N氢氧化钠溶液中冲洗双手。为灭活EMS，向线虫中加入5毫升M9培养基。倒置离心管25至30次以洗涤线虫，然后在1500 ×g条件下离心5至7分钟，或直至线虫形成沉淀；离心结束后，吸除上清液，并将其弃入盛有1 N氢氧化钠溶液的烧杯中。重复此洗涤步骤：加入M9离心液并去除上清液，至少三次。最后一次洗涤后，将线虫沉淀物重悬于少量M9溶液中，用移液器将线虫悬液转移至含有OP50细菌菌苔的NGM平板上。待液体干燥数分钟后，挑选外观健康的J4幼虫转移至新的接种平板上。约八到十天后，让诱变后的线虫自体受精，使用体视显微镜筛选F2代中过量存在的目标突变体表型。该诱变操作将以采集自四至五个直径为六厘米的培养皿中的ppac秀丽线虫为材料进行演示，将线虫收集至15毫升离心管中。向线虫沉淀中加入10毫升M9培养基。颠倒混匀20次以清洗线虫，然后在1500 G下离心5分钟。离心后弃去上清液。用M9培养基重复清洗线虫，共洗涤3次。最后一次洗涤后，吸去液体，并将线虫重悬于约为其体积10倍的M9培养基中。然后从 3 毫克/毫升的储备液中加入 4 5 8-三甲基-苏林（trimethyl SOREIN）或 TMP，使终浓度为 30 微克/毫升。将试管置于室温下避光，低速摇床上孵育 15 分钟。孵育结束后，将试管垂直放置 10 分钟，使所有线虫沉降。本视频中试管显示为未加盖状态，但 TMP 溶液应避免光照。由于该化学物质对光敏感，需使用移液器将线虫从管底取出，并转移至未铺琼脂的NGM平板上。将平板置于黑暗环境中，直至过量的TMP被平板吸收。待TMP完全吸收后，可对线虫进行紫外光照射处理。在TMP紫外线诱导神经发生实验中，最关键的步骤之一是确保长波紫外线光源与培养板之间保持适当的距离。因此，我们需要多次调整距离，以获得照射在培养板上的合适紫外线强度。该强度应由光强计记录，且应为500微瓦每平方厘米。由于紫外线存在潜在风险，此步骤应使用适当的护目镜。使用紫外强度计，确定长波紫外光源与目标位置之间的距离，使辐射强度达到500微瓦/平方厘米。接下来，移去铝箔和盖子，将含有经 TMP 处理的线虫的培养皿放置在距离光源一定距离的位置，使培养皿表面的光照强度为 500 微瓦/平方厘米。用长波紫外光照射培养皿 50 秒，然后将线虫在室温下避光孵育 5 小时。5 小时后，挑选外观健康的 J4 幼虫，转移至新鲜涂有菌的培养皿中。最后，使用体视显微镜对F1、F2或F3代进行筛选，以鉴定目标表型。图中显示的是在经过EMS或T-M-P-U-V诱变后，在F2代中鉴定出的一些秀丽小杆线虫（P. pacificus）突变体表型。这些图像中的上方两幅图分别为野生型雌雄同体和野生型雄虫的示例。每种突变体都具有特征性的表型，可轻松与野生型动物区分开来。图C为短粗型（dumpy）突变体的示例，图D显示的是运动不协调型（uncoordinated）突变体，图E为性别转换型（transformer）突变体。一旦掌握操作技巧，EMS诱变可在四个半小时内完成，而TMP/UV诱变若操作得当，则可在五个半小时内完成。这一时间段还包括孵育时间。切记 EMS 和 TMP 具有极高危险性，在操作这些物质时，必须采取防护措施，例如穿戴实验服、佩戴双层手套、使用通风橱以及佩戴护目镜。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

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