优化转染的HEK - 293T细胞中的表达和重组的电压门控离子通道的电生理记录策略

电生理学通常用于研究培养的人胚胎肾细胞中重组电压门控离子通道的活性。成功的记录要求细胞在细胞膜上表达足够水平的通道以进行检测，并且细胞以足够低的细胞密度接种以分离单个细胞。进行细胞记录经常受到这种表达所需的 28 °C 长潜伏期的阻碍，其中通常会失去细胞粘附和膜稳定性。

在这里，展示了一种优化的细胞培养和转染方法，可以规避这些问题。以中等共流畅度转染细胞，然后在 28 摄氏度下孵育直至获得足够的离子通道表达。然后将转染的细胞以低密度接种在玻璃盖玻片上，并在 37 摄氏度下孵育数小时，以实现细胞粘附和膜稳定。

适当铺板后，通过共表达的 EGFP 和全细胞膜片钳鉴定细胞。可以进行记录，也可以将细胞再次在 28 摄氏度下孵育。为了进一步增加通道表面表达，对转染电压门控钙通道（如 L CAV one L CAV 2 或 L cav 3）的细胞进行记录实验的结果表明，这些通道已成功转染并由细胞表达。

虽然仅显示了 L CAV 3 的代表性结果，但在我们的实验室中，我们开发了一种增强人类细胞系中膜片钳记录的低表达离子通道基因表达的方法。现在的常规方法是先在盖玻片上分裂细胞，用含有离子通道基因的血浆 CDNA 转染，然后在 28 摄氏度下孵育多年，以便在电生理记录之前实现高效的离子通道表达。我们的新方法大大缩短了记录前 28 摄氏度所需的孵育时间。

现在，通过减少 28 度孵育时间，我们发现细胞膜更加稳定，转染的细胞更多地粘附在盖玻片上。这增加了可记录单元的数量，并显著提高了实验效率。转染前，将 HEK 2 9 3 T 细胞的完全汇合培养瓶（1 至 4 个）分装到一个新的 25 cm 见方培养瓶中，并将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中。

4 小时后让细胞附着 3 到 4 小时，通过微分干涉对比检查细胞以验证附着。请注意，单元格看起来不再是圆形的，而是扁平化的。延伸或伪足可见。

较少的汇合单元看起来相同，但间隔会更远。细胞贴壁后，混合必要的试剂进行标准磷酸钙转染。每个培养瓶在 600 μL 转染溶液中制备总共 12 μg DNA。

在这里，来自各种离子通道的 CDNA 被克隆到 P-I-R-E-S 两个 EGFP 质粒中，将该表达载体转染到哺乳动物细胞系中。通过在离子通道包被序列下游和 EGFP 包被序列上游的内部核糖体进入位点开始翻译，从与克隆插入片段相同的 mRNA 中产生增强的绿色荧光蛋白。这允许识别阳性转染的细胞，而不会因将 EGFP 蛋白直接融合到目标蛋白而可能对蛋白质功能造成干扰。

将转染溶液逐滴移到细胞上，然后轻轻旋转培养瓶，并于第二天将其置于 37 摄氏度的培养箱中过夜。通过在荧光显微镜下观察细胞来检查转染效率。阳性转染的细胞应在整个细胞中呈绿色。

验证转染后，小心地将 4 至 5 mL 温热培养基移液到倒置培养瓶中。通过缓慢翻转培养瓶来洗涤细胞，使细胞表面向下，并摇动培养瓶，使洗涤液轻轻地在细胞上移动。取出培养基并重复此洗涤。

再迈出两步。然后向培养瓶中加入 6 mL 培养基，并在 37 摄氏度下孵育 2 小时。无脊椎动物离子通道的表达存在一些挑战。

首先，它们通常很大，因此可能需要很长时间才能在内质网中翻译。此外，它们可能无法有效地靶向哺乳动物细胞系中的细胞膜。最后，由于不同的物种表现出不同的密码子使用频率，异源 CDNA 可能含有在哺乳动物细胞中不常见的高频密码子，例如 HEK 2 9 3 T，以克服其中一些困难。

洗涤转染后在 37°C 下孵育 2 小时后，将培养瓶转移至 28°C 培养箱中 2 至 6 天，以延长表达时间。必须根据经验确定所表达的每种离子通道的孵育时间。由于在 28 摄氏度下长时间孵育会导致细胞脱离和膜稳定性差。

在进行电生理学研究之前，需要进一步的细胞制备。首先，将 1 毫升 37 摄氏度胰蛋白酶溶液抽吸到倒置的培养瓶中，从转染细胞中去除培养基。然后轻轻地将培养瓶放回细胞表面向下位置，让胰蛋白酶轻轻地流过细胞。

将培养瓶翻转过来并去除胰蛋白酶。然后直接在细胞上加入 250 微升温胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育 3 到 5 分钟，直到细胞分离。同时，将 3 到 8 个聚乙烯赖氨酸包被的盖玻片放入 60 毫米培养皿中，并加入 5 毫升温热培养基。

一旦细胞分离复苏，将它们悬浮在 4 毫升的温热培养基中，接下来用微量移液器的尖端上下吹打约 6 次，向下推盖玻片以确保它们位于培养皿的底部。然后加入 250 至 500 μL 重悬细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育 3 小时，使其粘附在盖玻片上。

将细胞在 37 度下放置太长时间将导致细胞分裂和转染质粒的稀释。转染的细胞应以足够低的密度铺板，以便它们彼此分离，如图所示。这将有助于电生理记录。

对于需要辅助亚基的细胞，通常需要将细胞转移到 28 摄氏度，并在电生理化前再孵育 3 到 4 天。对不需要附件亚基的细胞进行记录。孵育后可立即进行记录。

这里使用的电生理装置包括放大器、电动双移液器纵器、落向荧光显微镜和灌注系统。该设备已安装在隔振台上，并有杂散。电气噪声由一个 40 英寸高的双雪貂笼电子控制系统限制，包括一台配备数字数据 1440 的 PC，一个模数转换器接口，以及 P clamp 10.1 软件。

计算机监视器放大器、电动机械手和气门连杆多流量控制系统都安装在法拉第笼外。在独立的 19 英寸金属电气机架上，所有电气设备都接地到铜分配器并插入医疗级隔离变压器，该变压器提供线路绝缘、一致的接地和浪涌抑制。将电阻为 2 至 5 兆欧姆的火焰抛光微量移液器安装在头部载物台上的微量移液器支架上，为实验做准备。

补液管填充内部溶液轻弹以去除气泡，最后安装在头部载物台上。接下来，使用镊子将一个带有电镀细胞的盖玻片转移到室温下含有 3 毫升外部记录溶液的 35 毫米塑料培养皿中。进行药物实验时，必须准确测量记录溶液的体积，在此期间，用微量移液器将已知量的药物添加到培养皿中，将培养皿放在显微镜载物台上。

然后用三摩尔氯化铯填充微电极支架半电池。然后将参比电极插入半电池中，并使用微米机械手将接地电极放入浴中，将贴片移液管放入浴液中。在荧光模式下观察细胞，并将分离的阳性转染贴壁绿色细胞置于视野中间。

在浴模式下，将补液管靠近细胞。将在计算机屏幕上观察到的方波轨迹归零。调整膜片移液管的位置，使其刚好接触细胞，屏幕上的方形电流迹线开始波动。

用附带的注射器轻轻抽吸，直到形成千兆欧姆密封。一旦实现千兆欧姆密封，将程序切换到补丁模式。用注射器快速抽吸，以突破细胞膜。

然后切换到 cell 模式并在 amp扩音器上使用整个 cell 参数。为了补偿电容瞬变，有必要平衡贴片，以便细胞内记录溶液透析到贴片细胞中。在此处输入为此实验编写的电压钳协议。

实验者设计了一种方案来测量通过电压门控离子通道的离子电流，当细胞膜上的电压被调制时，会产生这种离子电流。在这种情况下，我们正在研究一个 IV 协议，该协议指定软件将电池保持在负 110 毫伏，然后 SEP 保持在负 70 毫伏，持续 250 毫秒。然后，每次步长增加 10 毫伏时，将保持电位降至负 110 毫伏，以便步长为负 70 毫伏、负 60 毫伏，依此类推，直到最后一步为正 20 毫伏。

使用放大器上的低通贝塞尔滤波器过滤 10 kHz 的记录电流，并使用 clamp X 10.1 软件以 2 kHz 的采样频率进行数字化 仅使用最小泄漏小于 10% 的记录进行分析，培养 HEK 2 93 T 细胞并用 L Cav 转染。三个钙通道，如图所示。从 P-I-R-E-S 两个 EEG FP 载体产生的荧光表明异源离子通道 CDNA 的成功转染。

在这里，我们展示了无脊椎动物 cav 三电压钙通道的成功表达。当细胞未转染时，不会引发钙电流。而当对细胞应用全细胞电压钳方案时，转染细胞会产生大电流。

实验者可以根据自己的要求使用各种电生理条件和数据分析方案。在尝试此程序时，请务必记住使用自己的判断来判断实验的时间。由于不同的通道在细胞膜上的表达效率不同，因此您需要确定用于提高细胞活力以及最大化您感兴趣的通道表面表达的最佳策略。

观看本视频后，我们希望您对如何培养和维持人类细胞系，以及如何将异源离子通道 CDNA 和亚基 CDNA 转染到这些细胞中有了很好的了解。用于电生理记录。