Name: 优化转染的HEK - 293T细胞中的表达和重组的电压门控离子通道的电生理记录策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 了解在HEK-293T细胞中优化转染和电生理记录重组电压门控离子通道的方法。该技术通过改进细胞贴附和膜稳定性，提高了离子通道表达效率和记录可靠性。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）向 JDS 提供的发现基金运营资助、NSERC 亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金（博士阶段）（授予 A. Senatore）以及心脏与中风基金会资助项目（资助号：NA#6284）的支持。

1. 细胞培养
<ol>
 <li>人胚胎肾293T细胞（HEK-293T，Invitrogen）在含6 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；Sigma Aldrich）的透气式25 cm2 培养瓶（经组织培养处理；Cellstar；greiner bio-one）中以贴壁单层形式培养，培养基中添加10% v/v 胎牛血清（FBS；Sigma Aldrich）、1% 丙酮酸钠和250 μg/mL 青霉素/链霉素，于37°C、5% CO2 条件下培养。 
 
 细胞在设定为37°C或28°C的CO2 培养箱（5% CO2）中孵育。所有细胞操作均在超净工作台中进行。 
 
 </li>
 <li>细胞通常每两周传代一次，从约90%融合度开始，周一按1:8比例稀释传代，周四按1:12比例稀释传代。（参见图1，了解不同接种密度下HEK-293T细胞的图像）</li>
 <li>传代时，通过抽吸去除培养瓶中的培养基，然后将1 mL预热至37°C的胰蛋白酶溶液（Sigma Aldrich）加入倒置的培养瓶中，使胰蛋白酶覆盖细胞层。轻轻手动摇动培养瓶数次，使胰蛋白酶充分作用于贴壁细胞。随后迅速抽吸去除胰蛋白酶，并用移液器向瓶内加入250 μL胰蛋白酶，再次轻轻摇动，使溶液均匀覆盖细胞表面。</li>
 <li>将培养瓶置于设定为37°C的CO2 培养箱中孵育3–5分钟，然后用移液管将细胞重悬于4 mL温热的完全DMEM培养基中。胰蛋白酶消化不完全或重悬不充分会导致细胞成团，可能引起细胞向上生长而非形成预期的单层。过度消化则可能损伤细胞。</li>
 <li>对于1:8传代，取500 μL细胞悬液加入含有5.5 mL DMEM的新培养瓶中；对于1:12传代（参见图1），取333 μL细胞悬液加入含有5.7 mL DMEM的新培养瓶中。轻轻混匀后，将培养瓶转移至37°C培养箱。传代后于37°C孵育3–4小时期间，细胞将逐渐沉降并贴附于瓶壁。细胞初始呈圆形，随后逐渐变扁平并伸出突起（伪足），贴附更加牢固（图1）。 
 
 细胞应以可预测的方式形成贴壁单层生长。若细胞生长状态或形态异常或不一致，应考虑操作技术问题或污染（细菌/支原体）的可能性。成功的组织培养关键在于操作的一致性。 
 
 </li>
</ol>
2. 使用重组离子通道 cDNA 转染 HEK-293T 细胞
<ol>
 <li>此处，各种离子通道的cDNA被克隆至pIRES2-EGFP质粒（BD Biosciences Clontech）中，该质粒可通过增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的荧光来识别成功转染的细胞。eGFP在转染细胞中由与克隆插入片段cDNA相同的转录本表达，翻译起始于插入cDNA下游、eGFP编码序列上游的内部核糖体进入位点（见图2）。图3展示了使用pIRES2-EGFP载体成功转染钙通道亚基的HEK-293T细胞的荧光图像。</li>
 <li>转染前，将完全汇合的培养瓶以1:4比例传代至新培养瓶中，并在37°C的CO2培养箱中孵育3–4小时，使细胞贴壁（见图1）。</li>
 <li>细胞贴壁后，采用标准的磷酸钙转染方法（Cold Spring Harbor实验方案），将含有离子通道及其辅助亚基cDNA的构建体导入HEK细胞。通常每瓶/每次转染使用600 μL转染液中含有总共12 μg DNA。</li>
 <li>将转染液逐滴加入细胞后，将培养瓶置于37°C培养箱中过夜孵育。</li>
 <li>转染完成后，用预热的培养基或磷酸盐缓冲液（4–5 mL）小心清洗细胞三次：将洗涤液加入倒置的培养瓶中，然后缓慢将培养瓶翻转至直立位置，并轻轻摇晃，使洗涤液流过细胞表面。若操作不当，细胞可能脱落，三次洗涤后将所剩无几。重复洗涤两次后，向培养瓶中加入6 mL培养基，在37°C孵育2小时，随后转移至28°C培养箱中继续培养。</li>
 <li>转染后1至3天，可使用落射荧光显微镜确认pIRES2-EGFP构建体的转染是否成功。在紫外光照射下发出绿色荧光的细胞为成功转染细胞，应表达外源性离子通道蛋白和eGFP蛋白。</li>
</ol>
3. 为电生理记录准备转染的 HEK293T 细胞铺板
不同的离子通道在HEK细胞膜上的表达效率各不相同，因此本实验方案的后续步骤需要进行一定优化，以最大程度地提高通道在细胞表面的表达，从而实现成功的电生理记录。在HEK细胞中表达异源离子通道，特别是来源于非哺乳动物的通道，可能会面临一些挑战，包括：（1）蛋白质分子较大，翻译和定位至质膜所需时间较长；（2）通道蛋白上缺乏或存在与哺乳动物细胞系不匹配的折叠和靶向定位基序；（3）不同物种间密码子使用频率的差异。上述因素综合作用可能导致需要在28°C下长时间孵育，以确保外源蛋白的有效表达和膜表面定位，同时避免细胞分裂（细胞分裂会稀释外源cDNA和蛋白质）。然而，在28°C长时间孵育会导致细胞脱落和细胞膜稳定性下降，从而增加电生理记录的难度。因此，我们决定对传统的转染策略（参见Thomas和Smart，2005年综述）进行改进，以尽量减少记录前在28°C下的孵育时间，并最大化通道在细胞表面的表达。我们的方法要求细胞转染后，在28°C下孵育3至7天，随后通过胰酶消化使细胞脱离，重新接种到盖玻片上，并在37°C下孵育，以恢复膜稳定性并促进细胞牢固贴附于盖玻片。此后，细胞可立即用于记录，也可继续在28°C下额外孵育一段时间。我们发现，在该方法的后期阶段将细胞重新接种至盖玻片上，对于获得大量表达通道且彼此分离、贴附良好的细胞至关重要。
我们提出了两种替代策略：一种适用于不包含可能易受胰蛋白酶消化影响的大胞外域的离子通道及离子通道复合物（例如Cav3电压门控钙通道；Senatore和Spafford 2010）；另一种适用于包含大胞外域的离子通道（例如L型电压门控钙通道及其辅助亚基；Senatore, et al. 2010）。
<ol>
 <li>
 <ol>
 <li>细胞在28°C下孵育2至6天，以抑制细胞分裂并促进翻译蛋白的积累。每种离子通道的孵育时间需通过实验确定，因为表面表达水平依赖于内在因素，这些因素分别决定了通道新生mRNA和多肽序列与翻译机制及分泌途径的相互作用。</li>
 <li>铺板前，将圆形玻璃盖玻片（Circles No. 1，厚度 0.13 至 0.17 mm；直径 12 mm，Fisher Scientific Canada，Ottawa，Ontario）用 Poly-L-赖氨酸（Sigma），按照制造商说明书操作。</li>
 <li>通过抽吸去除转染细胞的培养基，将1 mL 37°C的胰蛋白酶溶液（Sigma）用微量移液器加入倒置的培养瓶中（细胞面朝上）。轻轻将培养瓶翻转至直立位置，使胰蛋白酶流过细胞表面，再将培养瓶重新倒置，通过抽吸去除胰蛋白酶。随后，直接向细胞表面加入250 μL预热的胰蛋白酶，将培养瓶置于37°C孵育3–5分钟，直至细胞脱落。</li>
 <li>同时，poly-L将-赖氨酸包被的盖玻片放入6 mm培养皿中（每皿3-8片），并向每皿加入5 mL预热的培养基。</li>
 <li>用移液管将胰蛋白酶消化后的细胞用4 mL预热的培养基轻轻吹打约6次，重悬细胞，然后取250–500 μL重悬细胞液，用微量移液器接种至含有盖玻片的培养皿中。在加入细胞前，先用微量移液器枪头轻压盖玻片，确保其位于培养皿底部。</li>
 <li>将细胞在37°C孵育3小时，以使其贴附于盖玻片上，随后转移至28°C。此时细胞已准备好进行电生理记录，理想情况下应使用分离贴壁的细胞（图3展示了转染细胞在接种至盖玻片前后的状态）。若在37°C孵育时间过长，将导致细胞分裂。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>
 <ol>
 <li>表达具有大型胞外结构域的通道/通道复合物的细胞制备方法与上述基本相同，不同之处在于，在进行电生理记录之前，需将盖玻片在28°C下额外孵育2至4天。这一步骤有助于细胞经胰蛋白酶消化后，通道/通道复合物在细胞膜上的重新积聚。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 在 HEK-293T 细胞中对重组通道进行电生理记录
目前已有一些全面的资源，介绍了电生理记录的基本概念（例如 Ogden 和 Stanfield 1987；Molleman 2003）。
4.1 电生理设备
典型的电生理实验装置（图4）包括一个放大器（例如 Axopatch 200B 或 Multiclamp 700B 放大器；Axon Instruments，加利福尼亚州联合市）、一台配备 Digidata 1440A 模数转换器接口和 pClamp10.1 软件的 PC 计算机（Molecular Devices，加利福尼亚州桑尼维尔）、电动双移液器操纵器（MPC-385-2，Sutter Instrument Company）、落射荧光显微镜（Axiovert 40 CFL，Zeiss Canada，安大略省多伦多）以及灌流系统（图4和图5）。通过将设备安装在 TMC 63-500 系列减振台上（Technical Manufacturing Corporation，马萨诸塞州皮博迪），可有效减少振动干扰。使用一个高40英寸的II型法拉第笼（TMC）包围安装在减振台上的电子设备，以降低杂散电噪声。电子控制系统（如计算机和显示器、放大器、模数转换器、电动操纵器以及 Valvelink 灌流控制系统）安装在法拉第笼外的一个独立金属电气机架上（Hammond Manufacturing，安大略省圭尔夫）。所有电子设备均接地至一个铜质配电端子，并接入医用级隔离变压器（1800W，Tripp Lite UL60601-1），以提供线路隔离、稳定的接地和浪涌抑制。
4.2 膜片钳电极
将带丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 mm，长度15 cm；货号BF150-86-15；Sutter Instrument Company）切成两半，插入Flaming/Brown微电极拉制仪（P-97型，Sutter Instrument Company）。优化拉制程序，以稳定制备出电极对地电阻在2至5 MΩ之间的微电极（经火焰抛光后；图6）。每个微电极均单独进行火焰抛光，以平滑尖端表面，从而实现与细胞膜之间的紧密封接（Micro Forge MF-830；Narishige，日本；图6）。微电极使用专用支架（1-HL-U；Molecular Devices，加利福尼亚州森尼韦尔）安装在放大器头级上。
4.3 接地电极
用于制作膜片钳电极的硼硅酸盐玻璃管也可用于制备参比电极。将15厘米长的玻璃管切割成3段。用两把尖头镊子夹住玻璃管，在本生灯火焰中加热，直至玻璃变软，可将玻璃管弯成具有90°角的“L”形或“曲棍球杆”形。当玻璃管仍处于高温状态时，立即将一端浸入预热的含3M CsCl和1.5%琼脂糖的溶液中，溶液通过毛细作用被吸入管内。一旦参比电极完全充满溶液，即将其放入盛有冷水的烧杯中冷却。所有参比电极填充完毕后，逐个用Kimwipe纸巾轻轻擦拭，去除外壁多余的琼脂糖，并将其浸入3M CsCl溶液中保存。在进行电生理记录时，参比电极被固定在微电极夹持半电池（Microelectrode Holder Half-Cells，型号：Holder 90 F Pellet 1.5mm；货号：#MEH3RF15；World Precision Instruments Inc.，佛罗里达州萨拉索塔）中，且夹持器内需填充3M CsCl溶液。（参见图7，示意图显示接地电极置于浴液中）
4.4 电生理记录溶液
不同类型的电压门控离子通道根据离子通透性/选择性的差异，需要使用不同的记录溶液。对于电压门控钙通道，细胞通常浸浴在含有不同浓度钡离子或钙离子的外部溶液中。例如，对无脊椎动物Cav3型电压门控钙通道（LCav3）进行电生理记录时，可使用含5 mM CaCl₂的外部溶液进行记录。2，166 mM 四乙基氯化铵（TEA-Cl）、10 mM HEPES，用 TEA-OH 调节 pH 至 7.4。膜片钳电极内充以含 125 mM CsCl、10 mM EGTA、2 mM CaCl 的内液2，1 mM MgCl2，4 mM MgATP，0.3 mM Tris-GTP 和 10 mM HEPES，pH 值为 7.2（Senatore 和 Spafford，2010）。可使用含钡离子作为电荷载体的外液记录无脊椎动物L型电压门控钙通道（LCav1）（15 mM BaCl₂，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，pH 7.4）2，10 mM HEPES、40 mM TEA-Cl、72.5 mM CsCl、10 mM 葡萄糖，用 TEA-OH 调节 pH 至 7.2）以及含 108 mM 钙甲烷磺酸盐、4 mM MgCl₂ 的内液2，9 mM EGTA，9 mM HEPES，用CsOH调节pH至7.2（Senatore 等, 2010).
4.5 全细胞记录
<ol>
 <li>将含有转染细胞（表达异源离子通道或离子通道复合物）的盖玻片转移至一个含有约 3 mL 外部记录液的 35 mm 塑料培养皿中。在进行需要通过微量移液器向培养皿中添加已知量药物的药物实验时，必须准确测量记录液的体积。电生理记录通常在室温下进行，但研究人员可根据实验需求调整温度。</li>
 <li>通过落射荧光显微镜观察细胞，并将视野中央的一个孤立、转染阳性且贴壁的绿色细胞居中定位。</li>
 <li>使用显微操作器将膜片钳电极移入浴液中，从而完成膜片钳电极内电极与参考电极之间的电路连接。在浴液模式下，pClamp10.1 软件会驱动放大器在电极与参考电极之间产生微小的重复电压阶跃，并将产生的电流以方波轨迹形式显示（图 8A）。在对细胞进行封接前，必须使用放大器上的电极偏移调节功能将该方波轨迹调零。pClamp10.1 软件测量电极电阻，其值应在 2–5 MΩ 范围内。</li>
 <li>在浴液模式下，将电极移至靠近细胞的位置，此时可在方波轨迹上观察到快速波动；随后对膜片钳电极施加轻微吸力，以在电极与细胞膜之间形成吉欧姆封接（表现为方波轨迹完全变为一条直线；图 8B）。</li>
 <li>随后将程序切换至膜片模式，并使用放大器上的电极电容补偿功能，对电极电容（表现为平坦电流轨迹前沿和后沿出现的小电流尖峰；图 8B）进行补偿。</li>
 <li>施加短暂而锐利的吸力，以破裂膜片中的细胞膜，使电极进入细胞内部。成功的膜破裂表现为电流轨迹前沿和后沿出现较大的电容瞬变（图 8C）。一旦破膜成功，即将程序切换至细胞模式，并调节放大器上的全细胞电容补偿，以消除电容瞬变。记录前需等待数分钟，以使细胞内记录液在细胞内充分平衡。</li>
 <li>使用配备 Digidata 1440A 模数转换接口的计算机，结合 pClamp10.1 软件生成电压指令并采集数据。针对每个实验设计特定的电压钳制方案，用于记录转染细胞中的离子通道电流。图 9 展示了在表达无脊椎动物 LCav3 电压门控钙通道的 HEK-293T 细胞中记录到的钙电流。细胞钳制在 -110 mV 电压下，并施加从 -70 mV 到 +20 mV 的逐步去极化脉冲，以诱发内向钙电流。</li>
 <li>记录到的电流使用低通贝塞尔滤波器在 10 kHz 条件下滤波，并以 2 kHz 的采样频率进行数字化。仅选用漏电流极小（&lt;10%）的记录数据进行分析，离线漏电流扣除使用 Clampfit 10.1 软件完成。</li>
</ol>
4.6 记录细胞的药物研究
药物可直接用移液器加入正在记录的培养皿中。如果已知所加药物的体积和灌流液的体积，即可计算药物浓度。对于昂贵或用量有限的药物，也可通过多通道歧管聚酰亚胺灌流笔（带可拆卸的250微米尖端）进行微灌流给药，灌流系统可选用八通道Smartsquirt加压微灌流系统（AutoMate Scientific），或通过特氟龙阀门和Valvelink8阀门控制器（AutoMate Scientific）操作的重力灌流系统（灌流系统设置见图5）。微灌流系统的流速设定为每分钟0.1 mL，灌流笔出口距离记录细胞400微米。灌流笔尖端与记录电极尖端之间的距离应在每次封接之间保持一致；图10展示了在40倍放大倍数下建议的距离。适当的流速可确保对记录细胞实现充分饱和的灌流。在使用微灌流进行药物实验前，需先用对照灌流液持续微灌流使细胞达到平衡状态。实验过程中应尽量减少对灌流液流的中断，通过快速切换控制灌流液、药物溶液或洗脱液来实现。可在记录皿边缘安装吸液装置，通过注射器手动抽吸或使用蠕动泵驱动装置（例如MINISTAR微型直流蠕动泵，World Precision Instruments）去除多余的液体。需格外注意，过快的灌流速度会产生剪切力，可能改变钙电流（Peng et al. 2005），导致记录的细胞被冲走，并过快耗尽药物储备。
直接移液至培养皿与灌流系统的比较
 
 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>直接移液</td>
 <td>微灌注系统</td>
 <td>重力流灌注系统</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>所需药物体积</td>
 <td>中等</td>
 <td>低</td>
 <td>高</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>技术要求</td>
 <td>低</td>
 <td>中等</td>
 <td>中等</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>设备成本</td>
 <td>低</td>
 <td>较高</td>
 <td>较高</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>每日设置与清理所需时间</td>
 <td>无需</td>
 <td>20分钟以上</td>
 <td>20分钟以上</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>设备污染风险</td>
 <td>无</td>
 <td>有</td>
 <td>有</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>故障排查</td>
 <td>容易</td>
 <td>复杂</td>
 <td>复杂</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>能否确保药物进入培养皿</td>
 <td>是</td>
 <td>否</td>
 <td>否</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>加药时是否会导致细胞丢失</td>
 <td>是</td>
 <td>是</td>
 <td>是</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>通过换液大幅降低药物浓度的难易程度</td>
 <td>困难</td>
 <td>直接简便</td>
 <td>直接简便</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>进行多剂量反应曲线实验的便捷性</td>
 <td>不够理想</td>
 <td>直接简便</td>
 <td>直接简便</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>结果的可重复性</td>
 <td>一般 — 依赖于移液位置</td>
 <td>良好</td>
 <td>良好</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

能够使用所述方案和溶液记录到全细胞电流，表明转染成功，且目标电压门控离子通道或离子通道复合物已在细胞膜上以可观的量存在。如果细胞呈阳性转染（即呈现绿色荧光），但无法记录到电流，则可能需要延长在28°C的孵育时间，以使通道蛋白得以正确组装并插入细胞膜。需注意，长时间在28°C孵育会导致细胞从盖玻片上脱落，细胞膜稳定性下降，并积累死亡细胞的碎片，从而增加膜片钳记录的难度。本方案中建议的所有时间参数均针对我们研究的特定通道进行了优化。其他通道及其亚基可能需要更长或更短的孵育时间，可根据实际情况进一步调整本方案。对于某些通道而言，较低的转染效率（即荧光细胞较少且单个细胞荧光强度较低）反而比高效转染、高荧光强度的细胞获得更好的实验结果。若细胞具有荧光但无法记录到电流，可能的问题包括：缺乏辅助蛋白；转染试剂混合不充分；记录溶液非最适条件；或通道或通道亚基的cDNA构建体发生突变或重组，导致蛋白错误折叠或无法表达。
<img src="/files/ftp_upload/2314/2314fig1.jpg" alt="细胞培养汇合度与传代比例、显微镜图像、细胞密度影响研究" data-altup...

<table><tbody><tr><td>pIRES2-EGFP 质粒</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>圆片编号1——厚度0.13至0.17毫米，尺寸：12毫米</td></tr><tr><td>放大器</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B 或 Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>电生理学软件</td><td>Axon Instruments</td><td>pClamp10.1</td><td></td></tr><tr><td>移液器操作器</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MPC-385-2</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Axon Instruments</td><td>CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>头端电极夹</td><td>Axon Instruments</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;#8211;接地电极用的电极夹</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3RF 15</td><td></td></tr><tr><td>电生理学毛细管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF-150-86-15</td><td>含细丝硼硅酸盐玻璃管，外径1.5 mm，外径0.86 mm，长15 cm</td></tr><tr><td>弗拉明/布朗微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>微移液管火焰抛光仪</td><td>Narishige International</td><td>Micro Forge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>微型药物灌注系统</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>SmartSquirt8 Valvelink8.2</td><td></td></tr><tr><td>药物灌注系统</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>Valvelink8.2 配备聚四氟乙烯阀门</td><td></td></tr></tbody></table>

优化的转染策略用于在hek-293t细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

该 体外 在培养的人胚肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行电生理记录是一种广泛使用的科研策略。为进行不受邻近细胞接触干扰的电生理记录，必须将HEK-293T细胞以足够低的密度接种于玻璃盖玻片上，使其彼此不发生接触。此外，转染的离子通道必须在细胞质膜上高效表达，以便在全细胞膜片钳记录中检测到显著高于噪声水平的电流信号。异源表达的离子通道通常需要在转染后于28°C下长时间孵育，才能实现足够的膜表达；然而，该温度下细胞与盖玻片的黏附性及膜稳定性会逐渐下降。为克服这一问题，我们开发了一种优化的HEK-293T细胞转染与接种策略。该方法要求细胞在相对较高的汇合度下进行转染，并在转染后于28°C孵育不同时间，以促进离子通道蛋白的充分表达。随后将转染后的细胞接种至玻璃盖玻片上，并在37°C孵育数小时，以实现细胞与盖玻片的牢固黏附及细胞膜的重新稳定。细胞接种后可立即进行记录，也可转移至28°C继续孵育。我们发现，转染后、接种前在28°C的初始孵育阶段，对于通常难以在质膜上高效表达的异源离子通道而言，是实现其高效表达的关键步骤。转染成功的培养细胞可通过共表达的eGFP进行识别，eGFP可由双顺反子载体（如pIRES2-EGFP）表达，该载体在内部核糖体进入位点及eGFP编码序列的上游含有重组离子通道的cDNA。全细胞膜片钳记录需要专用设备，以及使用硼硅酸盐玻璃拉制抛光的记录电极和L形接地电极。研究离子通道药理学时，药物可通过微量移液直接加入记录皿中，或通过微灌流或重力驱动流系统，使药物溶液持续流经被记录细胞。

高效且可靠的实验方法 体外 在培养的人胚胎肾细胞（HEK-293T）中表达重组电压门控离子通道并进行后续电生理记录

优化的转染策略用于在HEK-293T细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

在培养的人胚胎肾细胞（HEK-293T）中进行重组电压门控离子通道的体外表达与电生理记录……

电生理学常用于研究在培养的人胚胎肾细胞中表达的重组电压门控离子通道的活性。成功的记录要求细胞在细胞膜上表达足够水平的通道以便检测，并且细胞铺板密度需足够低，以分离单个细胞。进行细胞记录时常受到限制，原因是通道表达通常需要在28摄氏度下长时间孵育，而此过程往往导致细胞黏附性和膜稳定性下降。在此展示了一种优化的细胞培养与转染方法，可规避上述问题。细胞在中等汇合度下进行转染，随后在28摄氏度下孵育，直至离子通道表达达到足够水平。转染后的细胞以低密度接种于玻璃盖玻片上，并在37摄氏度下孵育数小时，以促进细胞贴附和膜稳定性。通过共表达的EGFP和全细胞膜片钳技术鉴定已适当接种的细胞。可直接进行记录，或再次将细胞置于28摄氏度条件下孵育。为进一步提高通道膜表面表达，对转染了电压门控钙通道（如L CAV1、L CAV2或L cav3）的细胞进行记录实验的结果表明，这些通道已成功转染并在细胞中表达。尽管本实验室仅展示了LCAT三的代表性结果，但我们已开发出一种方法，可增强在人源细胞系中表达水平较低的离子通道基因，以用于膜片钳记录。传统方法是首先将细胞接种到盖玻片上，转染含有离子通道基因的质粒cDNA，随后在28摄氏度下孵育多天，以在电生理记录前实现高效的离子通道表达。我们的新方法显著缩短了记录前在28摄氏度下所需的孵育时间。通过缩短至28摄氏度的孵育时间，我们发现细胞膜更加稳定，转染后的细胞在盖玻片上的贴附性也显著增强。这增加了可记录细胞的数量，并显著提高了实验效率。在转染前，将一个完全融合的HEK 293T细胞培养瓶以1:4的比例传代至一个新的25平方厘米培养瓶中，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养。接种细胞后静置3至4小时，然后通过差分干涉对比显微镜观察细胞，以确认其已贴壁。注意此时细胞不再呈圆形，而是逐渐变平，并可见细胞突起或伪足。融合度较低的细胞外观相同，但细胞间距会更大。待细胞贴壁后，混合必要的试剂以进行标准的磷酸钙转染。每瓶准备总量为12微克的DNA，溶于600微升转染溶液中。此处将来自各种离子通道的cDNA克隆到P-I-R-E-S双EGFP质粒中。将该表达载体转染至哺乳动物细胞系后，可在同一mRNA上产生增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其翻译起始位点位于离子通道编码序列下游、EGFP编码序列上游的内部核糖体进入位点（IRES）。这种方法使得转染成功的细胞能够被识别，同时避免了将EGFP蛋白直接融合至目标蛋白时可能对蛋白功能造成的干扰。将转染液逐滴加入细胞中，然后轻轻摇动培养瓶，并于次日将其置于37摄氏度培养箱中过夜。通过荧光显微镜观察细胞以检测转染效率。成功转染的细胞应在整个细胞内呈现绿色荧光。在确认转染成功后，小心地将四到五毫升预热的培养基加入倒置的培养瓶中。通过缓慢翻转培养瓶使细胞面朝下，并轻轻晃动培养瓶，使洗涤液轻柔地流过细胞表面，从而清洗细胞。移除培养基后，重复此洗涤步骤。重复上述步骤两次。然后向烧瓶中加入六毫升培养基，在37摄氏度下孵育两小时。无脊椎动物离子通道的表达存在一些挑战。首先，它们通常分子量较大，因此在内质网上翻译可能需要较长时间。此外，在哺乳动物细胞系中，它们可能无法被高效地靶向至细胞膜。最后，由于不同物种的密码子使用频率不同，异源 cDNA 可能含有在哺乳动物细胞（如 HEK 293T）中罕见的密码子，从而导致翻译效率低下；为克服其中一些困难，可采取相应优化策略。转染后洗涤，在37摄氏度孵育两小时，随后将培养瓶转移至28摄氏度培养箱中继续孵育2至6天，以延长表达时间。孵育时间需根据所表达的每种离子通道类型通过实验确定。由于在28摄氏度长时间孵育会导致细胞脱落和细胞膜稳定性下降。在进行电生理学研究之前，需要进一步制备细胞。首先，用移液管吸除转染细胞的培养基，并向倒置的培养瓶中加入一毫升37摄氏度的胰蛋白酶溶液。然后轻轻将培养瓶恢复至细胞面朝下的位置，使胰蛋白酶缓慢流过细胞表面。将培养瓶翻转回来并吸除胰蛋白酶。然后在细胞上直接加入250微升预热的胰蛋白酶，于37摄氏度孵育3至5分钟，直至细胞脱落。在此期间，将3至8个经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入60毫米的培养皿中，并加入5毫升预热的培养基。待细胞脱离后，用移液器上下吹打约六次，将细胞重悬于4毫升预热的培养基中。接着，用微量移液器的枪头轻压盖玻片，确保其完全贴附于培养皿底部。然后加入250至500微升重悬的细胞悬液。将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育3小时，使其充分贴附于盖玻片上。在37摄氏度下孵育时间过长会导致细胞分裂，从而稀释转染的质粒。转染后的细胞应以足够低的密度接种，使其彼此分离，如图所示。这将有利于进行电生理记录。对于需要辅助亚基的细胞，通常需将细胞转移至28摄氏度，并额外孵育三至四天，然后进行电生理记录。对于不需要辅助亚基的细胞，则可在孵育结束后立即进行记录。此处使用的电生理设备包括放大器、电动双移液器操纵器、落射荧光显微镜以及灌流系统。所有设备均安装在防震台上，并配有防杂散电场的屏蔽罩。通过一个40英寸高的II型铁磁屏蔽笼来限制电噪声。电子控制系统包括一台配备Digit Data 1440的计算机、一个模数转换器接口，以及与P-Clamp 10.1软件协同工作的系统。计算机显示器放大器、电动操纵器以及阀控灌注系统均安装在法拉第笼外部。所有电子设备安装在一个独立的19英寸金属电气机架上，并接地至铜质配电端子，同时接入医用级隔离变压器，以提供线路绝缘、稳定的接地和浪涌抑制。实验前，将经火焰抛光、电阻为2至5兆欧的微电极安装在头部支架的微电极夹持器上。用内部溶液填充膜片电极，轻弹以去除气泡，最后安装到显微镜的电极架上。接着，用镊子将载有培养细胞的盖玻片转移至一个含有3毫升室温外部记录液的35毫米塑料培养皿中。在进行药物实验时，必须准确测量记录液的体积，以便用微量移液器向培养皿中加入已知量的药物，然后将培养皿置于显微镜载物台上。然后用3摩尔的氯化铯填充微电极夹持器半电池。将参考电极插入半电池中，并使用显微操作器将接地电极放入浴液中，再将膜片钳电极移入浴液。在荧光模式下观察细胞，并将一个孤立的、呈绿色荧光的转染阳性贴壁细胞置于视野中央。在灌流模式下，将记录电极移至细胞附近。将计算机屏幕上观察到的方波信号调零。调整记录电极的位置，使其刚好接触细胞，此时屏幕上的方波电流信号开始出现波动。使用连接的注射器施加轻柔的负压，直至形成吉欧姆封接。一旦达到吉欧姆封接，立即将程序切换至膜片钳模式。用注射器施加短暂的负压脉冲，以击穿细胞膜。然后切换到细胞模式，并在放大器上使用全细胞记录参数。为了补偿电容性瞬变，需要平衡膜片，使细胞内记录液扩散进入被封接的细胞。在此处输入为本实验设计的电压钳制程序。实验人员设计了一种方案，用于测量当细胞膜两侧电压发生变化时，通过电压门控离子通道的离子电流。在此情况下，我们采用一种IV方案，该方案要求软件先将细胞钳制在负110毫伏，然后阶跃至负70毫伏并持续250毫秒，随后返回至负110毫伏的保持电位，每次阶跃增加10毫伏，即依次至负70毫伏、负60毫伏等，直至最后一步达到正20毫伏。使用放大器上的低通贝塞尔滤波器以10千赫兹对记录的电流进行滤波，并利用Clampex 10.1软件以2千赫兹的采样频率进行数字化。仅使用漏电流小于10%的记录进行分析。在分析中，将HEK 293T细胞进行培养，并转染如图所示的L Cav 3型钙通道。异源性离子通道cDNA的成功转染由P-I-R-E-S双eeg FP载体产生的荧光指示。在此，我们展示了无脊椎动物cav三型电压门控钙通道的成功表达。当细胞未被转染时，无法诱发出钙电流；而转染后的细胞在施加全细胞电压钳制程序时可产生显著的电流。实验人员可根据自身需求采用不同的电生理条件和数据分析方法。在进行该实验操作时，需注意根据实验时间自行判断和调整。由于不同通道在细胞膜上的表达效率存在差异，因此需要您自行确定最佳策略，以提高细胞存活率，并最大化目标通道在细胞表面的表达水平。观看本视频后，我们希望您能够充分掌握如何培养和维持人源细胞系，以及如何将异源离子通道cDNA和亚基cDNA转染到这些细胞中，用于电生理记录。

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