白三烯B₄介导的细胞迁移及BLT1与β-arrestin相互作用的实时成像

白三烯B4是一种促炎性分子，通过G蛋白偶联受体BT1和BT2在多种炎症细胞上介导其生物学作用。研究表明，LTB4-BLT1信号通路在多种炎症性疾病中发挥关键作用，包括哮喘、关节炎和动脉粥样硬化。G蛋白偶联受体（GPCR）介导细胞外信号的转导，从而引发细胞内反应，如趋化作用、细胞内钙离子释放和基因表达调控。

胞外配体结合会诱导一系列构象变化，从而激活异源三聚体G蛋白。G蛋白随后调节第二信使的水平，例如环磷酸腺苷、三磷酸乙酰胆碱以及二酰甘油，以实时监测白三烯B4介导的细胞迁移。在通过微移液管控制流速递送趋化因子的同时，对骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）进行成像。通过延时成像评估细胞迁移情况。

利用这些活细胞实时成像技术，我们实验室发现白细胞趋化因子受体BT1在树突状细胞上具有功能性表达。我们还鉴定了BT1受体内化过程中的磷酸化及β-arrestin依赖性机制。本实验室的Jla博士（助理教授）开发了其中多项技术，她将演示活细胞迁移以及受体内化实验。为准备用于细胞迁移检测的骨髓来源树突状细胞（BMDCs），请将50万个细胞接种于含FPS、重组G-M-CSF和重组FLT3的RPMI 1640培养基中，置于35毫米玻璃底培养皿内。

接种后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育16小时。加入三毫升磷酸盐缓冲液，然后吸除。最后一次吸除后，至少再重复此洗涤步骤两次，最后向培养板中加入两毫升磷酸盐缓冲液。

细胞现已准备好用于实验，应保持在 37 摄氏度。在实验进行之前，本视频中使用的成像系统由连接至尼康 Eclipse TE 300 倒置显微镜的 A-T-E-F-M 正置荧光系统组成，该显微镜配备加热载物台和 Cool SNAP hq 数字黑白 CCD 相机。

激发和发射波长通过滤光轮和Lambda 10-2滤光轮控制器进行控制。硬件控制和图像采集由MetaMorph软件控制。两个显微操作器连接至显微镜载物台，用于固定移液管，这些移液管可根据随附文本中的说明自行制备，或直接购买。

将1.5毫升浓度为100纳摩尔的促炎配体白三烯B4（leukotriene B four）或LTB four原液转移至一个1.5毫升离心管中。通过将微量移液器吸头插入溶液中并让溶液进入吸头的方式回吸加样，此加样方法可防止在微量移液器末端形成气泡。接下来，用1毫升LTB four溶液加载一支连接微填充针头的1立方厘米结核菌素注射器。

然后从顶部用其缓慢填充一支微移液管，并将导管连接到已装满配体的微移液管上。接着，将微移液管和导管连接至一支21号、1.5英寸长的针头上，该针头已连接一个同样装满配体的1毫升注射器。现在，小心地将装有配体的微移液管固定在显微镜载物台上的一个显微操作器上，以对骨髓来源的树突状细胞进行活细胞成像。

在加入LTB四配体后，将培养皿中未成熟的bMDCs从培养箱中取出，并置于显微镜的加热载物台上。使用60倍油镜观察细胞，选择细胞分布不过于密集的区域，以便准确监测其迁移行为。

打开荧光培养皿的盖子。然后使用粗调手动操作器，小心降低已装载配体的移液管并将其移入。利用液压微调微操作器将其靠近细胞。

将移液器调至焦点。通过注射器施加少量压力，以启动LTB4配体从尖端的缓慢释放；配体应通过扩散在培养基中缓慢散开。接下来，使用MetaMorph软件设置图像采集参数，每15秒采集一次明场图像，持续两小时。

每五分钟持续监测细胞向配体迁移的进展情况。本方案中所述方法用于测定树突状细胞向白三烯B4的迁移。此处，小鼠骨髓来源的树突状细胞向100

本次延时成像视频展示了骨髓来源树突状细胞（BMDCs）向LTB4迁移的活细胞运动过程。类似方法可用于测定多种细胞类型对各类趋化因子的趋化反应。此类成像技术结合荧光蛋白标记分子，可用于在活细胞中实时追踪分子的运动与相互作用。

本文实时展示了荧光标记的白三烯B4受体1与β-arrestin之间的相互作用。RBL-2H3是一种源自Wister大鼠的嗜碱性白血病细胞系，可从ATCC获得。这些细胞不表达多种趋化因子受体，但具有介导趋化因子依赖性信号通路所需的细胞组分。

为了实时评估配体诱导的BT1内化，将RBL-2H3细胞转染表达BT1-RFP和β-arrestin-GFP。在延时成像过程中向培养板中加入配体。通过图像分析可评估这些蛋白定位的变化。

为实时研究G蛋白偶联受体的内化，按照随附文本中的说明，将BLT1R-RFP和β-arrestin-GFP转染至RBL-2H3细胞中。然后将300 µL电穿孔后的细胞与常规培养基的混合物转移至含有2 mL常规培养基的35 mm荧光培养皿中。将细胞置于37 °C、95%空气和5%二氧化碳的湿润环境中，使其贴附于培养皿底部。

孵育1小时后，将转染培养基更换为常规生长培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养18至24小时。培养结束后，用含有10毫摩尔HEPES的2毫升温热酚红-free RPMI培养基洗涤细胞两到三次，每次加入后吸去培养基。然后加入另外1.8毫升培养基。

接下来，将培养皿置于加热的显微镜载物台上。使用60倍油镜在600倍放大倍数下采集图像。然后切换至适当的荧光滤光片。

选择一个健康的细胞，该细胞在细胞表面表达 HBL BT one RFP，并在此处采集图像。使用 RFP 滤光片切换至 GFP 滤光片，确保β抑制蛋白与 GFP 在细胞质中表达，并采集图像。然后检查合并后的伪彩图像，以确认是否存在因串色导致的荧光渗漏现象。

受体的靶向定位不会发生在RFP与GFP之间。接下来，在此处输入延时成像的参数。使用相机采集16位图像时，像素合并设置为1×1。

使用RFP和GFP荧光染料滤光片，通过R-F-P-G-F-P分光镜依次采集红色和绿色荧光图像。指导软件在一小时内以第32个时间间隔采集图像。设置相机曝光时间，以获得相似的动态范围。

对于RFP和GFP的荧光强度，在t等于零时采集一分钟的图像，然后直接向孔板中加入200微升配体，注意不要扰动孔板。

继续采集荧光图像60分钟。加入配体后，随着图像的获取，系统将自动以TIFF格式保存图像，并按顺序命名文件。随后可使用软件查看单个或合并的图像。

最后，在获取所有细胞图像后，使用相同的设置获取无细胞的空白培养基图像。保存这些文件，用作背景图像以分析图像数据。使用 MetaMorph 中的图像减除功能，将上述获得的实际数据图像减去背景图像。

这将消除培养基可能产生的背景信号或自发荧光。接下来，在文件菜单下，打开最终生成的图像序列文件选项，并载入各个图像序列。随后，在区域测量中选择“椭圆区域”或“轨迹区域”工具，绘制感兴趣的区域，选择细胞表面和胞质区域，以测量对应于BLT1和β-arrestin转位的RFP与GFP荧光强度。

使用日志数据选项，该选项会自动链接到 Excel，以绘制荧光强度随时间变化的曲线图。该图表将提供有关特定分子转位动力学的信息。通过图像分析，可以揭示 G 蛋白偶联受体、胞质蛋白以及细胞核的定位情况。

此处可见BT one RFP在RBL two H three细胞表面的表达。该图像显示了同一细胞胞质中beta rest与GFP的定位，而细胞核中可见p nuke CFP。此处展示的彩色叠加图像表明了每种荧光染料独特的细胞内定位。此外，还可在此评估细胞膜G蛋白偶联受体（GPCR）与胞质蛋白之间的配体诱导相互作用。

配体诱导的BLT1受体与β阻遏蛋白的转位。该视频展示了表达BLT1-RFP和β阻遏蛋白-GFP的活细胞的实时成像。加入1 µM LTB₄后，可使用MetaMorph软件监测转位模式的量化结果。

在T等于零时，显示了一个代表性细胞中荧光强度的线扫描结果。BT1 RFP出现在细胞膜上，而β-arrestin GFP出现在细胞质中。加入配体后，观察到RFP与GFP信号线的重叠，提示受体与β-arrestin发生了共定位。

此外，还可在此测定蛋白质运动的动力学，包括受体的内化动力学和β阻遏蛋白的转位动力学。在加入一微摩尔LTB4后进行了检测。

在细胞膜和细胞质位置，荧光强度随时间的变化被测定。向转染了BT one RFP和β-arrestin one GFP的RRB two H three细胞中加入LTB four配体后，β-arrestin one GFP在1分钟内从细胞质向细胞膜转位，表现为形成一个黄色环状结构。在与β-arrestin one GFP相互作用后，BT one RFP形成受体-β-arrestin one GFP复合物，并以内涵体的形式在细胞质中转位，5分钟内可见黄色点状结构的出现。利用这些方法，可以确定配体依赖性受体激活状态以及参与受体激活的关键基序或过程。

实验中最重要的是在操作过程中密切关注板中的缓冲液。随着实验在其建立后持续超过一小时，该技术已出现在趋化因子及其受体领域的研究人员中，用于探索多种哺乳动物细胞类型的细胞迁移以及受体-配体相互作用。

观看本视频后，您应能充分理解如何建立涉及趋化因子及其受体，以及它们与细胞质蛋白（如β抑制蛋白）相互作用的实时成像实验。