环境诱导的亚麻可遗传变化

本实验的总体目标是展示一种在可诱导条件下种植亚麻品种的方法，以产生可遗传的基因组变异。此外，监测基因组变化，并在不同环境条件下观察诱导后各代植株的生长情况。为实现这一目标，需在多种诱导条件下种植亚麻。

在不同环境条件下植株生长期间的各个时间点采集莱夫和马里斯的茎组织和叶片组织。接着，从这些组织样品中分离DNA和RNA。该实验流程的最后一步是利用DNA样品进行PCR，以及利用分离得到的RNA进行定量逆转录PCR（Q-R-T-P-C-R），以鉴定在不同环境条件下生长所引起的基因组变化和基因表达变化。

最终，可以通过PCR和RT-PCR对处理过的植物组织中提取的核酸进行分析，获得结果显示基因组对生长条件的响应，包括LIS1插入元件在基因组特定位点的出现以及该元件存在相关的基因表达差异。大家好，我是来自凯斯西储大学生物系的克里斯·卡勒（Chris Cull）。我是科尔实验室的科里·约翰逊（Cory Johnson）。

我叫 Tiffany Moss，同样来自 Cull 实验室。我是 Marshall Lucas，Cull 实验室暑期本科生科研项目中的一名本科生。

我们在实验室中采用此方法研究生长环境变化所导致的基因组和基因表达的改变。现在我们开始操作。要在诱导条件下培养亚麻，首先用土壤填满5英寸的花盆并压实。

下一株植物，每个花盆播种三粒亚麻种子，深度为四分之一英寸。然后在种子上方覆盖土壤，作为非诱导对照条件。用100毫升十分之一浓度的奇迹生长溶液浇灌植物。

在高营养条件下，用100毫升全浓度Miracle Grow处理植物。最后施用。

仅向低营养植物浇自来水。夏季植物生长期间，在自然光下培养。每天通过自动喷雾系统为所有植物浇水两次，每次五分钟。

每周对植物施加一次生长条件。每周定期采集叶片和嫩茎。采集6片叶片用于DNA提取，3个嫩茎用于RNA提取。采集后，将植物材料放入冻存管中，迅速置于液氮中冷冻，并将样品保存在-80摄氏度直至进行提取。

三种基因型的生长速率因条件不同而有所差异。在对照条件下，自交系亚麻品种 Storm 或 PL 系生长最佳。从该亲本衍生出多个品系，其中大株型（L 品系）比小株型（S 品系）生长更为旺盛。

然而，在低营养条件下，S 的生长优于 L 或 pl；在高营养条件下，L 的生长优于 pl，而 pl 仅略优于 S。在三种不同处理条件下对各品系进行比较发现，PL 在对照条件下生长最佳；L 在高营养条件下生长最佳；而 S 在高营养和对照条件下的生长表现相似。

这些数据表明，这三种品系在三种不同环境下的生长情况存在差异。PL 和 L 在特定环境中生长较好，而 S 在三种条件下生长状况大致相同。S 无法在营养条件改善时获得生长优势，但在极低营养条件下具有更强的生长能力。

进行DNA提取时，在微量离心管中加入缓冲液（Qiagen DNEZ植物DNA提取试剂盒中的AP1缓冲液）以及六片叶片和无菌砂，用微型研杵研磨组织，直至无可见团块。按照试剂盒说明书指示继续完成提取。为开始RNA提取，从储存用冻存管中转移三段马铃薯茎段及部分周围叶片至微量离心管中，加入无菌砂，用微型研杵研磨组织，直至充分研细。

将样品涡旋震荡15秒以促进裂解，然后在13,000 RPM下离心1分钟，以收集砂粒及任何碎片。将SNAT加入离心柱中，并按照制造商说明书继续进行RNA提取。一旦RNA从组织中提取出来，向反应体系中加入XDNA缓冲液，体积为RNA样品体积的十分之一。

在30单位的DNs下，于37摄氏度孵育反应30分钟，随后在70摄氏度孵育5分钟。使用Applied Biosystems的RNA转cDNA试剂盒进行逆转录。根据生产商的说明书，于37摄氏度孵育反应1小时，然后在95摄氏度孵育5分钟。

最后，在1.5% AROS凝胶上加样5 µL cDNA以测定产量。亚麻cDNA制备完成后，可用于qPCR。使用ABI StepOne系统进行qPCR。

每次实验每组均设三个重复孔，并使用看家基因肌动蛋白（Acton）作为拷贝数对照来准备QPCR反应。向每个反应管中加入1微升相应的引物对。将cDNA稀释至适当浓度后，向每管中加入9微升。

最后，向每个试管中加入10 µL的2×CyberGreen PCR预混液。接着，按照扩增步骤设置扩增程序。根据阈值循环数（Ct值）计算相对表达水平，该数值由Step One软件的默认参数确定，并通过检查扩增曲线加以确认。

从茎部不同位置叶片中提取的DNA进行PCR扩增，结果表明，在诱导条件下生长的植株中出现了一条大小为5.7 kb的单拷贝DNA片段，称为插入序列（line insertion sequence）或LIS1。当PL在低营养诱导条件下生长时，LIS1出现，并最终形成纯合状态。此处，叶片样品1至6按每周间隔采集，其中样品1为播种后最早采集的样品，随后从这些样品中提取了DNA。

PCR 扩增结果显示，除第一个样本外，所有样本中均检测到 LAS one 的两端。这与未插入位点的消失相对应，且在第五片叶的 QPCR 检测中未发现该位点存在的证据。结果表明，LAS one 的存在或其他与诱导相关的基因组改变会影响 S one 附近区域基因的表达。

此处显示的六个基因在 PL 和 S 中均表现出差异表达，其中四个基因在不具有 LIS 一的 PL 中表达水平较高。相反，另外两个基因在具有 LIS 一的 S 中表达水平较高。我们刚刚向您展示了如何培养可诱导的亚麻品系。因此，基因组会响应生长环境发生变化，并影响后续世代的生长特性。

进行此操作时，重要的是要记住，必须复制相同的生长条件，才能可重复地诱导出变化。就是这样。我知道你们中的许多人对这一现象持怀疑态度，但现在你们可以自行重复这些观察结果了。

感谢观看，祝您的实验顺利。