Name: 环境引起的遗传亚麻的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解亚麻在营养胁迫下诱导基因组变异的方法，通过PCR和Q-R-T-P-C-R技术监测基因变化与表型响应。该研究有助于理解植物适应机制并提高作物抗逆性。

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1. 在诱导条件下亚麻的生长。
<ol>
 <li>5" 花盆装入土壤并压实。</li>
 <li>每个花盆中播种3粒种子，深度为¼英寸，并将土壤轻轻压实覆盖种子。</li>
 <li>然后用100 ml相应的营养液对花盆进行浇灌
 <ol>
 <li>非诱导对照（C）条件使用1/10th 每周施用全浓度 Miracle-Gro。高营养条件（NPK 处理）每周施用全浓度 Miracle-Gro。低营养条件——植物在整个生长期间仅施用自来水。（Durrant 1971，Cullis 1980）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>植物在夏季于自然光条件下生长，冬季则在钠灯下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。</li>
 <li>每周定期采集叶片和分生组织。</li>
 <li>植物材料在液氮中迅速冷冻。</li>
</ol>
结果
三种基因型的相对生长速率因培养条件不同而有所差异（图1）。在对照条件下，Pl系的生长状况最好，且L系的生长活力强于S系（图1a）。在低营养（水分）条件下，S系的生长优于L系和Pl系（图1b）。在高营养（NPK）条件下，L系的生长优于Pl系，而Pl系仅略优于S系（图1c）。图1d–f展示了三种不同处理条件下各品系生长情况的比较。Pl系在对照条件下生长最佳（图1d），L系在高营养条件下生长最佳（图1e），而S系在高营养和对照条件下生长表现相似（图1f）。
这些数据表明，这三种菌株在三种不同环境下的生长情况存在差异，可以据此加以区分。值得注意的是，Pl 在对照条件下生长最佳，而 L 在 NPK 条件下生长最佳（该菌株即在此条件下诱导获得）。S 在三种条件下的生长水平大致相同，即其无法利用营养条件的改善来促进生长，但在极低营养条件下仍具有相对较好的生长能力。
与植物分化相关的生长参数包括植株高度（以及与此相关的节间长度，即每片叶子之间的距离）、叶片大小和分枝程度。在对照条件下，Pl植株较高，具有分枝，叶片大且呈深绿色。在低营养条件下，植株非常矮小，叶间距也很短，叶片小且呈浅绿色。茎顶端的叶片比下部的叶片颜色更深。在高营养条件下，植株外观与对照条件下的植株非常相似，但主茎和侧枝均比对照植株短。对于大型基因型（large genotroph），植株外观与Pl植株非常相似，但其在高营养条件下的生长最为旺盛。在低营养条件下，该基因型植株同样非常矮小，叶片呈浅绿色。S基因型在三种环境中生长表现相似，尽管在低营养条件下叶片颜色较浅。然而，在低营养条件下，S基因型的生长活力明显强于Pl或L品系。
2. 亚麻分生组织和叶片的RNA与DNA提取分别进行。RNA提取采用Roche总RNA提取试剂盒，DNA提取采用Qiagen DNeasy植物DNA提取试剂盒。
RNA 提取
<ol>
 <li>将3个分生组织及部分周围叶片从储存用冻存管转移至离心管中，并置于液氮中，直至准备研磨。</li>
 <li>向离心管中加入无菌砂，使用微型研磨杵研磨组织，直至呈细粉状。</li>
 <li>加入400 µl Roche总RNA提取试剂盒中的裂解/结合缓冲液，继续研磨组织，直至无可见团块。</li>
 <li>样品涡旋振荡15秒以促进裂解，然后在13,000 rpm下离心1分钟，以沉淀砂粒及任何残渣。</li>
 <li>将上清液转移至离心柱中，并按照RNA提取试剂盒说明书的后续步骤进行操作。</li>
</ol>
DNA酶处理
<ol>
 <li>加入1/10 RNA样本体积的10X DNA酶缓冲液。</li>
 <li>加入30单位DNA酶，反应体系在37°C孵育30分钟，然后在70°C孵育5分钟。</li>
</ol>
逆转录
<ol>
 <li>按照说明书使用 Applied Biosystems RNA 转 cDNA 试剂盒，反应在 37°C 孵育 1 小时，然后在 95°C 孵育 5 分钟。</li>
</ol>
然后将 cDNA 用于 PCR 或 qPCR
qPCR
使用 ABI Step One 系统进行 qPCR。每次运行中所有检测均设置三个重复。肌动蛋白基因作为拷贝数对照，是目前可用的最佳看家基因。
<ol>
 <li>每管中加入 1μl 适当的引物对。</li>
 <li>将 cDNA 稀释至适当浓度后，每管加入 9μl。</li>
 <li>每管中加入 10μl 2x Power SYBR Green PCR MasterMix (ABI)。</li>
 <li>扩增程序如下：
 <ul>
 <li>95°C 下 10 分钟</li>
 <li>40 个循环：95°C 下 15 秒，60°C 下 1 分钟</li>
 </ul>
 
 进行热变性步骤以验证扩增特异性</li>
 <li>相对表达水平通过 2(CT未知 - CT肌动蛋白) 的值确定。</li>
</ol>
DNA 制备
<ol>
 <li>将Qiagen DNeasy植物DNA提取试剂盒中的AP1缓冲液加入含有6片叶片和无菌砂的微量离心管中。用微型研杵研磨组织，直至无可见团块。</li>
 <li>按照试剂盒说明书操作。</li>
</ol>
结果
从茎部不同位置叶片中提取的DNA进行PCR扩增，结果表明LIS-1的出现发生在植物处于诱导条件生长期间（4）。qPCR结果显示，LIS-1的存在（或与诱导相关的其他基因组变化）会影响LIS-1附近区域基因的表达（图2）。图2所示的六个基因在Pl和S中均表现出差异表达，其中四个基因在PL（无LIS-1）中表达水平较高，两个基因在S（含有LIS-1）中表达水平较高。图中第1和第2个基因为距离LIS-1插入位点最近的两个基因。要确定LIS-1与基因表达变化之间的因果关系，还需进一步研究大型基因型植株（已发生诱导变化但无LIS-1）中这些基因的表达情况，以及在不同生长条件下的表达模式。
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="植物生长比较实验；不同处理下幼苗的示意图：水、对照、NPK。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 三种不同养分条件下生长的Pl、L和S。图a - 对照，b - 低养分，c - NPK。d - Pl，e - S，f - L。图d - f从左至右分别为：低养分、对照和NPK。D - Pl，e - L，F - S。
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="条形图比较不同条件下各种抑制剂和基序的蛋白质表达水平。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2 缩略图"> 图2. LIS-1插入位点附近的基因表达。基因1（生长抑制因子）位于LIS-1的5'端紧邻位置，基因2（Kip相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂id3）位于LIS-1的3'端。其他基因均位于基于完整亚麻基因组序列构建的同一支架上（约500 kb）。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">点击此处查看高清图像</a>。
<img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="DNA片段的凝胶电泳结果；第1-6泳道显示条带分离与分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 从低营养条件下生长的Stormont Cirrus植株的单个叶片中提取DNA进行PCR扩增的结果。PCR产物在2%琼脂糖-TBE凝胶上进行分离。未插入位点显示在a图中，插入位点的两端分别显示在b图和c图中。叶片样本1-6按每周间隔分离，其中样本1为播种后最早采集的样本。

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

亚麻似乎具有内在不稳定的基因组。一些商用纤维亚麻品种在连续种植几代后会迅速变得不整齐。但这一现象在油用亚麻品种中似乎并不存在。因此，选育纤维品质与基因组不稳定性之间可能存在关联。环境诱导的可遗传变化最初是通过观察纤维作物农艺性状的研究发现的。这些可重复的特定表型与基因组变异现象引发了一个问题：环境胁迫如何影响可能发生的基因组重排组合。LIS-1在特定环境条件下反复出现，表明该突变可能受到直接或间接的选择作用。经不同处理诱导的品系在相应诱导条件下也表现出更优的生长表现。与LIS-1存在相关的基因表达变化再次表明，该插入事件影响了植株的性能表现。视频展示提供了一个观察植物表型变化的平台，其直观性是传统印刷材料无法传达的。

<table><tbody><tr><td>原始 Stormont Cirrus 品种的亚麻种子，标记为 Pl，以及其基因型变异体 L 和 S。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; 花盆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>育苗土</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miracle-Gro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>温室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压钠灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型研杵和微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字成像系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StepOne qPCR 模块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy 植物DNA提取试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems RNA 转 cDNA 试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche 总RNA提取试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

环境诱导的亚麻可遗传变化

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

某些亚麻品种会通过修饰其基因组来响应营养胁迫，且这些修饰可遗传给后代多代。与这些基因组变化相关的还有可遗传的表型变异1,2。亚麻品种 Stormont Cirrus (Pl) 在三种不同营养条件下生长时，可能保持可诱导状态（在对照条件下），或分别在高营养或低营养条件下稳定地转变为大型或小型基因型型（genotroph）。在每种条件下最初生长产生的品系，在后续世代中若继续在相同条件下生长则表现更佳；值得注意的是，Pl 品系在对照处理下生长最好，表明在高营养和低营养条件下生长的植株均处于胁迫状态。与可遗传变化诱导相关的基因组变化之一，是在植物处于营养胁迫生长条件下时出现一种插入元件（LIS-1）3,4。就这一插入事件而言，亚麻品种 Stormont Cirrus (Pl) 在三种不同营养条件下生长时，可能保持不变（在对照条件下），或在所有植株中均出现插入（在低营养条件下），并可将此插入传递至下一代，或出现插入（或其部分序列）但无法在世代间传递（在高营养条件下）4。该插入事件出现的频率表明其处于正向选择压力下，这也与后续世代中的生长响应一致。在不同生长阶段采集的叶片或分生组织用于 DNA 和 RNA 的提取。RNA 用于鉴定与不同生长环境和/或 LIS-1 存在与否相关的表达差异。分离的 DNA 则用于鉴定发生插入事件的植株。

在营养胁迫条件下种植某些亚麻品种会导致基因组部分区域出现基因组变异以及表型变异。特定位置的一个复杂插入与不同营养条件下的生长表现以及该位点附近基因表达的变化相关。

某些亚麻品种会通过修饰其基因组来响应营养胁迫，且这些修饰可遗传给后代多代。此外……

本实验的总体目标是展示一种在可诱导条件下种植亚麻品种的方法，以产生可遗传的基因组变异。此外，监测基因组变化，并在不同环境条件下观察诱导后各代植株的生长情况。为实现这一目标，需在多种诱导条件下种植亚麻。在不同环境条件下植株生长期间的各个时间点采集莱夫和马里斯的茎组织和叶片组织。接着，从这些组织样品中分离DNA和RNA。该实验流程的最后一步是利用DNA样品进行PCR，以及利用分离得到的RNA进行定量逆转录PCR（Q-R-T-P-C-R），以鉴定在不同环境条件下生长所引起的基因组变化和基因表达变化。最终，可以通过PCR和RT-PCR对处理过的植物组织中提取的核酸进行分析，获得结果显示基因组对生长条件的响应，包括LIS1插入元件在基因组特定位点的出现以及该元件存在相关的基因表达差异。大家好，我是来自凯斯西储大学生物系的克里斯·卡勒（Chris Cull）。我是科尔实验室的科里·约翰逊（Cory Johnson）。我叫 Tiffany Moss，同样来自 Cull 实验室。我是 Marshall Lucas，Cull 实验室暑期本科生科研项目中的一名本科生。我们在实验室中采用此方法研究生长环境变化所导致的基因组和基因表达的改变。现在我们开始操作。要在诱导条件下培养亚麻，首先用土壤填满5英寸的花盆并压实。下一株植物，每个花盆播种三粒亚麻种子，深度为四分之一英寸。然后在种子上方覆盖土壤，作为非诱导对照条件。用100毫升十分之一浓度的奇迹生长溶液浇灌植物。在高营养条件下，用100毫升全浓度Miracle Grow处理植物。最后施用。仅向低营养植物浇自来水。夏季植物生长期间，在自然光下培养。每天通过自动喷雾系统为所有植物浇水两次，每次五分钟。每周对植物施加一次生长条件。每周定期采集叶片和嫩茎。采集6片叶片用于DNA提取，3个嫩茎用于RNA提取。采集后，将植物材料放入冻存管中，迅速置于液氮中冷冻，并将样品保存在-80摄氏度直至进行提取。三种基因型的生长速率因条件不同而有所差异。在对照条件下，自交系亚麻品种 Storm 或 PL 系生长最佳。从该亲本衍生出多个品系，其中大株型（L 品系）比小株型（S 品系）生长更为旺盛。然而，在低营养条件下，S 的生长优于 L 或 pl；在高营养条件下，L 的生长优于 pl，而 pl 仅略优于 S。在三种不同处理条件下对各品系进行比较发现，PL 在对照条件下生长最佳；L 在高营养条件下生长最佳；而 S 在高营养和对照条件下的生长表现相似。这些数据表明，这三种品系在三种不同环境下的生长情况存在差异。PL 和 L 在特定环境中生长较好，而 S 在三种条件下生长状况大致相同。S 无法在营养条件改善时获得生长优势，但在极低营养条件下具有更强的生长能力。进行DNA提取时，在微量离心管中加入缓冲液（Qiagen DNEZ植物DNA提取试剂盒中的AP1缓冲液）以及六片叶片和无菌砂，用微型研杵研磨组织，直至无可见团块。按照试剂盒说明书指示继续完成提取。为开始RNA提取，从储存用冻存管中转移三段马铃薯茎段及部分周围叶片至微量离心管中，加入无菌砂，用微型研杵研磨组织，直至充分研细。将样品涡旋震荡15秒以促进裂解，然后在13,000 RPM下离心1分钟，以收集砂粒及任何碎片。将SNAT加入离心柱中，并按照制造商说明书继续进行RNA提取。一旦RNA从组织中提取出来，向反应体系中加入XDNA缓冲液，体积为RNA样品体积的十分之一。在30单位的DNs下，于37摄氏度孵育反应30分钟，随后在70摄氏度孵育5分钟。使用Applied Biosystems的RNA转cDNA试剂盒进行逆转录。根据生产商的说明书，于37摄氏度孵育反应1小时，然后在95摄氏度孵育5分钟。最后，在1.5% AROS凝胶上加样5 µL cDNA以测定产量。亚麻cDNA制备完成后，可用于qPCR。使用ABI StepOne系统进行qPCR。每次实验每组均设三个重复孔，并使用看家基因肌动蛋白（Acton）作为拷贝数对照来准备QPCR反应。向每个反应管中加入1微升相应的引物对。将cDNA稀释至适当浓度后，向每管中加入9微升。最后，向每个试管中加入10 µL的2×CyberGreen PCR预混液。接着，按照扩增步骤设置扩增程序。根据阈值循环数（Ct值）计算相对表达水平，该数值由Step One软件的默认参数确定，并通过检查扩增曲线加以确认。从茎部不同位置叶片中提取的DNA进行PCR扩增，结果表明，在诱导条件下生长的植株中出现了一条大小为5.7 kb的单拷贝DNA片段，称为插入序列（line insertion sequence）或LIS1。当PL在低营养诱导条件下生长时，LIS1出现，并最终形成纯合状态。此处，叶片样品1至6按每周间隔采集，其中样品1为播种后最早采集的样品，随后从这些样品中提取了DNA。PCR 扩增结果显示，除第一个样本外，所有样本中均检测到 LAS one 的两端。这与未插入位点的消失相对应，且在第五片叶的 QPCR 检测中未发现该位点存在的证据。结果表明，LAS one 的存在或其他与诱导相关的基因组改变会影响 S one 附近区域基因的表达。此处显示的六个基因在 PL 和 S 中均表现出差异表达，其中四个基因在不具有 LIS 一的 PL 中表达水平较高。相反，另外两个基因在具有 LIS 一的 S 中表达水平较高。我们刚刚向您展示了如何培养可诱导的亚麻品系。因此，基因组会响应生长环境发生变化，并影响后续世代的生长特性。进行此操作时，重要的是要记住，必须复制相同的生长条件，才能可重复地诱导出变化。就是这样。我知道你们中的许多人对这一现象持怀疑态度，但现在你们可以自行重复这些观察结果了。感谢观看，祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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