Name: 器官型E18大鼠脑切片文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 学习器官型脑切片培养技术，使用E18大鼠胚胎脑组织进行解剖、包埋和振动切片。该方法结合Millicell滤膜培养系统，可维持脑片活性五至七天，适用于神经发育、细胞迁移和再生医学研究。

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e18 大鼠脑组织器官型切片培养

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

从胚胎啮齿类动物脑组织制备的器官型脑片培养被广泛用于研究脑发育。尽管在体系统常具有诸多优势，但器官型脑片培养允许开展多种目前在体条件下难以实现的操作。迄今为止，胚胎期器官型脑片培养已被用于通过延时显微成像追踪单个细胞，对神经节隆起区（该区域难以通过子宫内电穿孔靶向）的基因表达进行操控，以及开展药理学研究。在本视频方案中，我们演示了如何从大鼠胚胎第18天（E18）的胚胎制备器官型脑片培养。该方案包括胚胎解剖、在冰上用低熔点琼脂糖包埋胚胎脑组织、使用振动切片机对包埋后的脑组织进行切片，最后将脑片转移至培养皿中的滤膜上进行培养。本方案亦可直接适用于制备不同胚胎发育阶段的大鼠和小鼠器官型脑片培养。

关键词：器官型脑片培养，脑发育，胚胎期，大鼠，小鼠，振动切片，低熔点琼脂糖，延时显微成像，基因表达操控，药理学研究

E18 大鼠脑组织器官型切片培养

来自胚胎啮齿类动物大脑的器官型脑片培养被广泛用于研究大脑发育。尽管在体系统常常具有一些优势，……

我叫Laura Elias。我是神经科学专业的研究生，目前在Arnold K. Stein的实验室工作。我们所在的机构是加州大学旧金山分校（UCSF）的再生医学研究所。今天我将向大家演示如何进行E18大鼠脑的器官型脑片培养。该操作包括取出脑组织，将其包埋于低熔点琼脂糖中，然后在切片机上进行冠状切片，再将切片置于脑片培养系统中。因此，在该脑片培养操作中，我们使用了几种重要的试剂和工具。你需要体视显微镜来分离脑组织。我们还使用这种 V 型 VT 1000 S 振动切片机，这是一种用于切片的良好系统。胶水的选择可能很重要。我们使用这种锁型胶水，因为它能很好地粘附脑组织；因为有时如果使用了错误类型的胶水，在切片过程中脑组织会脱落，这可能会带来问题。我们还使用这些 milli cell 滤膜，这些滤膜用于在培养过程中放置脑片，这也是该流程中的一个重要环节。在开始脑片培养流程之前，您需要先完成几个步骤。首先，您需要配制 A CSF，在完成 A CSF 配制后，应立即将其置于冰上冷却，同时用碳氧混合气（carbogen）进行通气。你还需要制备4%的琼脂糖凝胶。具体操作时，应使用低熔点琼脂糖，将其溶解于脑脊液（CSF）中，用微波炉加热溶解后，保持在50摄氏度直至用于包埋脑组织。你还需要配制脑片培养基；配制完成后，应将其置于37摄氏度环境中预热，以便在最后放入脑片时，培养基处于适宜温度。此时，您应准备好收集工具并开始切片培养过程。接下来，我们将从胚胎第18天的大鼠胚胎脑组织中制备脑片培养物。首先，我将通过脚趾夹捏法检查母鼠是否已完全麻醉。这是一个例子，大鼠仍然存在微弱的反射，当我挤压其足部时，它会稍微向后收缩后肢。因此，我们需要等待更长时间，或再次进行轻微麻醉，直到完全看不到任何反应为止。现在我将开始切开，以取出胚胎。我只需将皮肤拉起，以便获得一个整齐干净的切口。移除这里的一些胚胎，我将把它们切出来。因此，你可以在两个胚胎之间进行切割，然后沿着切口继续切割。现在我们可以取出这个胚胎，并通过在胎盘附近做一切口将其从胎盘上分离。接下来，我们将胚胎转移至冷的 aCSF 中，并在此处移除剩余的囊膜。是的，就在那里剪掉。现在这个胚胎已准备就绪，我们将开始制作脑切片。好的，现在我们已获得胚胎，接下来我将用剪刀剪下头部。好了，现在我可以开始解剖出大脑了。首先我们需要固定头部，方法是将固定针穿过眼眶以及后脑区域。这有助于我们将脑组织在培养皿中固定。正如你现在所看到的，我们的培养皿中已放置了一个固定好的脑组织，接下来我们将从后脑区域开始做一切口，然后继续向前端方向进行。首先，我将在小脑附近做一个切口。将剪刀插入皮肤和颅骨下方，然后将切口向上延伸至罗森塔尔区。接着，在大脑皮层末端两侧靠近脉络丛的位置再做两个横向切口。我将做一个向侧方延伸的切口，方向是那样，然后在那里再做一个切口。接着，我会用镊子将颅骨如此剥离下来。现在我们已经暴露了脑组织，接下来就这样从头部将其取出。现在你的大脑样本已完全解剖完毕。接下来，我们将把这些大脑包埋在琼脂糖中。我已预先配制好4%的低熔点琼脂糖，用脑脊液（CSF）配制后经微波炉加热溶解，并保持在约50°C，以维持其液态。 现在我将开始包埋操作。我会取一些琼脂糖放入这些培养皿中，并将这些培养皿几乎加满琼脂糖。好的，第一步是取出脑组织样本，将其在装有琼脂糖的培养皿中进行基本冲洗。脑组织上不宜有过多液体，否则会影响其在琼脂糖中的充分包埋和牢固附着。因此，如果在第一步中清洗不充分，当在切片机上进行切片时，脑组织容易从琼脂糖中脱落。为此，我们只需轻轻旋转晃动，尽量去除多余的液体即可。然后，我们将这些大脑转移到其他装有4%琼脂糖的培养皿中，如图所示。现在我们将大脑放置在琼脂糖中。需要注意的是，大脑既不能过于靠近皿底，也不能过于靠近液面，以确保其四周均被琼脂糖完全包围。然后将盖子盖在培养皿上，将其覆盖，并将该培养皿置于冰上，使琼脂糖凝固，从而使脑组织很好地包埋在琼脂糖中。琼脂糖大约在5到10分钟内会硬化。好的，现在我们的脑组织已成功包埋在琼脂糖中，接下来将在冰冻切片机上开始切片，制备厚度约为300微米的切片，用于后续的脑片培养。所有这些操作，包括之前已完成的步骤，均将在持续通入碳氧混合气（carbogen）的冰冷人工脑脊液（ACSF）环境中进行。现在我们准备开始。好的，接下来我们将首先从琼脂块中取出脑组织。我们需要将顶部切开，有时需要稍加辅助，以确保琼脂块能够顺利从顶部取出。我们来看一下。可以将其直接放入底部区域。现在我们有了琼脂糖块，接下来要做的就是切开琼脂糖，从而将脑组织基本切割出来。因此，我将进行四次切割，一次在后部，一次在最前部，然后在两侧各切一次。基本上就是按照我们包埋时的位置来切除脑组织。现在我们已经做好切口，将脑组织在琼脂糖中切开了。现在，我们基本上可以将大脑组织从琼脂糖中取出。大脑组织已完整取出，并嵌在琼脂糖中。接下来，我们将使用胶水将其固定在这个小平台上。我们将放置少量胶水，然后将脑组织直接置于胶水上。小脑，即后脑部分，应朝向胶水，而嗅球或头端则垂直向上。随后，我们将把样本移入振动切片机的样品室中。现在，我将大脑转移到切片装置中，以便进行切片。好了，我们开始。将其放入振动切片机（Vibram）中，并如此固定紧实。然后，我们将加入冰上预冷并持续通入气体的aCSF。这一步同样会使胶水硬化，非常重要。现在，我们的脑组织就已固定在振动切片仪的样品台上了。现在我们准备开始在振动切片机上对脑组织进行切片。我将先去除一些多余的琼脂。接下来做一个切口，将多余部分移除。现在我们有了这个脑组织。我将把刀片安装到振动切片机的刀头位置。这样就可以将其插入此处，并将刀片放置到振动切片机上。我还将剪断这个小移液管的尖端，以便其口径足够大，能够吸取我即将切下的脑片。现在准备工作已完成，接下来可以开始切割了。正如我所说，我在此使用了300微米的切片。因此，我们需要将刀片向脑组织方向移动，同时向上调节载物台。好的，首先我们将刀片准确定位在组织前方的位置，最初的几次切割可能会切到琼脂，或者仅切到最表层的区域，但这主要是为了调整刀片的位置。我们目前的振动频率约为七，速度约为五。现在正在进行大脑皮层冠状切片。我们从大脑最前端开始，实际上此刻才刚刚进入大脑组织。现在我们刚开始。这是我们的第一片切片，但位置已经非常靠前脑了。因此我们将继续保留我的手切切片。当切片完成后，我用脚将其移出，并放入室温下冒泡的人工脑脊液（ACSF）中。对于这些胚胎脑组织，也可以选择在切片室中加入冰块，以保持更低的温度。首先是冰上培养。只要您的 aCSF 保持冰冻状态，它们似乎就能很好地存活。但对于其他实验，或者如果您的脑组织稍旧一些，您可能需要在孵育 chamber 中加入冰块，以确保所有物质保持极低的温度。现在，我们的脑片已放置在持续通氧的 aCSF 中。它们可以在此处停留约一小时，但我们也可以直接将其放入切片培养系统中。好的，现在我们准备开始制备培养皿和培养系统，以便孵育我们刚刚制备的脑片。因此，我们将使用一个六孔板。接下来，我们将在每个孔中加入约1.5毫升预先配制并已在37摄氏度预热的脑片培养基，每个培养皿中加入约1.5毫升。然后，我将取出滤膜。实际上，我们将把脑组织切片放置在这些滤膜上，但在放置切片之前，需先将滤膜置于培养基中。因此，我们将滤膜放置在需要去除的培养基上方，并将气泡至少推到一侧，确保滤膜下方没有气泡。这些滤膜可使脑片从培养基中吸收营养物质，同时保持暴露在空气中，从而避免脑片因缺氧而死亡。现在，我们的滤膜已放入培养皿中，接下来可以取出脑片并将其转移至滤膜上。此处培养皿中已有脑片，我已移除了大部分的A-CSF。因此，我需要迅速加入脑片培养基，因为基本上需要将脑片从A-CSF中转移至脑片培养基中。现在我将向切片中加入培养基，操作时尽量轻柔，以免过度损伤切片。目前切片已置于培养基中，接下来需要将其转移至这些滤膜上，也就是我准备好的这三张滤膜。现在，我将用移液器吸取切片，并将其转移到滤膜上。你可以将几片样本放在同一张滤膜上，或者根据需要只放一片。我将在这张滤膜上放置几片样本。然后，必须去除此处转移过来的过量培养基。接下来，我将吸走随脑片转移过来的多余培养基，因为培养皿中若残留过多培养基，脑片会被液体完全淹没，导致供氧不足，从而缩短其存活时间。现在，我已经去除了多余的培养基，脑片仅平铺于培养皿中，可以准备放入培养箱了。好的，现在这些切片可以放入37度的培养箱中了。它们通常可以保持良好状态五到七天。我们大约每三天更换一次培养基，每次更换一半的培养基，并用新鲜培养基替换。现在我就把这些培养物放入培养箱中。好了，就这样。全部操作完成了。因此，我们在实验室中使用该技术来研究皮层发育的多个方面，包括前体细胞的分裂和神经元的迁移。该技术若与延时显微镜结合使用，效果尤为显著，可使您在脑片培养物中追踪单个细胞的分裂和迁移过程。

organotypic-slice-culture-of-e18-rat-brains

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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E18 大鼠脑组织器官型切片培养

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