多尺度数字化神经元形态的自动Sholl分析

本视频演示了一种利用半自动化程序分析树突和轴突（统称为神经突）形态的方法，以观察局部变化。首先使用 Neuron J 软件对神经元的八位 TIFF 图像进行追踪，以确定神经突片段的位置。然后使用 NeuronStudio 软件定义神经突之间连接关系的结构信息。

最后，运行 bonfire MATLAB 程序以提取细胞的形态学数据，包括对神经突分支点数量和神经突末端数量的集簇分析。结果表明，基于对神经突树亚区域进行集簇分析，可检测到神经突形态的局部变化。与现有方法（如手动集簇分析）相比，该技术的主要优势在于程序为半自动化，可显著提高分析效率，并支持数据审计，从而验证分析结果的准确性。

进行该实验操作的是暑期在 Firestein 实验室工作的 Hirsch AWA 本科生。为了使用 Bonfire 程序分析神经突的形态学特征，必须在下载 Bonfire 程序后获取单个神经元的 8 位 TIFF 图像。需要根据待分析图像的分辨率调整程序设置，在 Bonfire 程序的 Bonfire 参数部分，将变量“picks conversion”的当前值替换为您的图像分辨率数值。

为了使 bonfire 能够分析数据，文件必须按照特定的结构进行组织，包括一个主文件夹、一个包含 bonfire MATLAB M 文件的 bonfire 文件夹，以及分别包含不同条件的子文件夹；细胞图像文件应置于对应条件的子文件夹内。首先准备用于 tracing 的图像。本实验中，仅对树突进行 tracing，以分析树突形态的变化。首先准备用于 tracing 的图像。

通过点击 neuron J 工具栏上的打开按钮并选择您要追踪的图像来打开图像。现在，通过点击最大化按钮调整图像的亮度和对比度，以便能够清晰地观察到所有神经突；在 neuron J 工具栏上选择图像，然后选择调整亮度对比度。开始追踪时，点击 neuron J 工具栏上的添加追踪按钮，沿细胞体的边缘进行勾画。

然后，在 neuron J 工具栏上选择“标签轮廓”按钮，从轮廓 ID 下拉菜单中选择 N one，在 neuron J 属性窗口中选择类型 zero six，然后点击“确定”。要开始追踪神经突，可在 neuron J 工具栏上选择“添加轮廓”按钮，并沿每个感兴趣的神经突分支添加轮廓。绘制的每一段应终止于每个分支点处，每个子分支应从该点开始作为一条新的轮廓，这样效果最佳。

在NeuronJ工具栏上选择“保存轨迹”按钮，并将您刚刚创建的轨迹保存到与原始图像文件相同的文件夹中。接下来，从NeuronJ导出轨迹文件和轨迹标识符文件。在NeuronJ工具栏上选择“导出轨迹”按钮。然后在NeuronJ的导出对话框中选择“制表符分隔的文本文件，每个轨迹单独保存为一个文件”选项，点击“确定”，允许NeuronJ自动选择文件名和保存位置。

在 NeuronJ 工具栏上选择“测量轨迹”按钮，然后在 NeuronJ 测量窗口中选择“显示轨迹测量值”选项，并在 NeuronJ 轨迹窗口中选择“运行选择文件”，接着选择“另存为”并保存文件。文件名必须与原始图像文件的名称完全一致，后跟下划线和 info，且不应包含三个字母的文件扩展名。请检查您的计算机是否不会自动添加 XLS 文件扩展名。

如果存在该情况，则必须手动删除文件扩展名。首先，在 MATLAB 中通过打开命令窗口右上角的三个点按钮，使用 bonfire load 重新整理文件夹。在“浏览文件夹”窗口中，选择主文件夹中的 bonfire 文件夹，在命令窗口中输入 bonfire load 并按回车键。

在“浏览文件夹”窗口中选择要分析的条件文件夹，然后点击“确定”。这将通过创建包含每个单独细胞所有数据的细胞子文件夹来重新组织文件夹结构。现在，要在命令窗口中输入 bonfire_ NDF2swc 并按回车键，以生成带有下划线前缀的 swc 文件名。

在“浏览文件夹”窗口中，选择刚刚使用bonfire载荷重新整理的相同条件文件夹，然后选择“确定”。这将为所选条件的每个细胞文件夹创建一个WC文件。每个细胞文件夹将包含五个文件。

原始TIF图像、NDF文件、下划线信息、轨迹标识文件、一个TXT文件以及一个swc文件。在使用Neuron Studio之前，我们建议您先熟悉该程序的功能和快捷键。他们提供了一份出色的在线用户手册，掌握键盘快捷键将为您节省大量时间。

首先打开 NeuronStudio 程序，在 NeuronStudio 工具栏中选择“文件”→“打开”，找到待编辑的神经元 TIF 图像并打开。选择“运行设置”，在三个输入框中均输入“1”。

在体素大小窗口中，选择文件导入 s wc。选择与您要处理的文件相匹配的适当 s WC 文件。此时，图像文件将与轨迹图像叠加显示。

应使用红色圆圈覆盖细胞胞体，以连接神经突。使用神经突工具连接节点，使每个由黄色节点表示的分支点仅能形成两个分支。所有轨迹必须与胞体连续相连。

现在，要从 Neuron Studio 导出数据，请选择文件、保存神经突，然后以默认名称保存，以检查 swc 文件中是否存在错误，输入 bonfire trace 进行追踪。进入命令窗口并按回车键。在“浏览文件夹”窗口中，选择包含刚刚处理的数据的条件文件夹，如果文件夹中任何图像存在错误，请选择确定。

程序将输出图像，显示错误所在位置，以从点 S WC 文件中提取形态学数据。在命令窗口中输入 bonfire，然后按回车。在“浏览文件夹”窗口中选择要分析的条件文件夹，并为每个感兴趣的神经元选择“确定”。

火焰图分析将生成神经元形态的图形，以及分析中使用的肩环。此外，“火焰图”命令将生成一个 MAT 文件，其中包含从分析中获取的所有形态学信息。要在 MATLAB 命令窗口中查看数据的初步图形，请输入 bonfire results，然后在“浏览文件夹”窗口中选择要查看的实验条件对应的文件夹，再点击“确定”。

“浏览文件夹”窗口将暂时关闭并重新打开，以便选择其他条件。选择完条件后，单击“取消”以退出选择过程。Bonfire 结果将返回汇总图表，包括您选择用于导出形态学数据的条件文件夹中的数据，以 Excel 类型的 Bonfire 导出到 MATLAB 命令窗口中。

在“浏览文件夹”窗口中选择包含您希望导出数据的条件文件夹，然后进行确认。Bonfire 导出功能将生成形态学数据的 Excel 文件，并将其保存至所选的条件文件夹中。接下来，我们将展示 Bonfire 程序在一个包含两个条件的数据集上生成数据的示例。

这些是两种条件下拍摄的倒置图像示例。从图像中可以看出，条件一的树突数量多于条件二。该现象也可在由 Bonfire 程序生成的多种图表中观察到。

由于 bonfire 程序在树突的亚区段上执行其分析，因此条件一中增加的树突可以被快速识别。绘制总树突分支的群集曲线显示，条件一神经元在胞体远端具有更多的树突。绘制每个细胞的平均分支点和末端点数量表明，条件一比条件二含有更多的分支点和末端点。图中展示了每个细胞的一级、二级、三级或更高级树突的平均突起数量。条件一的三级及更高级树突数量更多。绘制每个细胞的根部、中间和末端树突的平均突起数量显示，条件一比条件二具有更多的中间或末端突起。

此处显示的是按节段身份分类的群集分析曲线，其中将节段分组为初级、次级或三级及以上。对于条件一的神经元，三级树突的增加发生在胞体远端。图中还展示了按节段身份分类的群集分析曲线，其中将节段分组为根部节段、中间节段或末端节段。

条件一中，中间段和末端树突的增加发生在细胞体的远端。观看本视频后，您应充分了解如何使用bonfire程序进行群集分析，以观察神经形态的局部变化。