蛋白质印迹：从样品制备到检测

本实验的总体目标是展示使用合适产品进行 Western 印迹的简便性。在完成样品制备后，蛋白质将根据分子大小进行分离，随后转移至固相膜上。然后利用抗体对目标蛋白进行探查，通过采用适当的实验方案以及高质量且经济有效的试剂，可获得更优的 Western 印迹结果。

大家好，我是 Jesse Luhan，来自加利福尼亚州圣迭戈的 EMD Chemicals 公司，担任研发科学家。EMD 是德国达姆施塔特市默克集团（Merck KGaA）的附属公司。今天我们将向您展示一种蛋白质印迹（Western blotting）实验流程。

那么我们开始吧。蛋白质印迹（Western blotting）的第一步是样品制备。通过低速离心沉淀细胞来开始样品制备，例如在2,500 × g条件下离心5分钟。

离心后，弃去细胞沉淀。每10的6次方个细胞加入150微升细胞裂解蛋白提取试剂，充分重悬细胞。室温孵育5分钟。

随后，在4°C条件下，以16,000 × g离心样品5分钟。将上清液转移至新管中，并继续进行分析。在测定样品的蛋白浓度后，制备样品以加载至凝胶，使蛋白变性。

使用含有离子型变性去污剂（如十二烷基硫酸钠或SDS）的上样缓冲液。将混合物在95至100摄氏度下煮沸5分钟。利用 commercially available precast gel（预制凝胶），可快速根据分子量分离蛋白质。

使用Omni PU化学试剂系列提供的试剂配制电泳运行缓冲液，并将其加入电泳装置中。在加样孔的第一泳道加入混合蛋白预染标记物。该标记物含有三条参考条带，可用于电泳过程中的监测。

染色后，凝胶上可见10条条带，分子量范围为10至225千道尔顿。将变性样品加入剩余的加样孔中，在220伏电压下电泳运行1小时。

蛋白质分离后，使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，以确认蛋白质是否均匀且一致地迁移，可采用即用型快速染色或超敏染色，无需进行脱色处理。正如带电荷的蛋白质可在电场中被诱导穿过凝胶一样，蛋白质也可在电场中从凝胶转移至膜上，例如硝酸纤维素膜（NITROCELLULOSE）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。使用PVDF膜时，需先将其在甲醇中浸泡数分钟，随后在冰浴的转移缓冲液中平衡5分钟。同时，也将凝胶在冰浴的转移缓冲液中浸泡数分钟，此平衡步骤可防止转移过程中凝胶发生收缩。

进行湿法转膜时，将凝胶和膜夹在海绵和滤纸之间形成三明治结构。确保凝胶与膜之间无气泡产生后，用夹子将该结构紧密固定。将此三明治结构浸入转膜缓冲液中，并施加电场。

带负电荷的蛋白质将向带正电荷的电极方向迁移。随后，膜会截留这些蛋白质，与之结合并阻止其继续移动。转膜完成后，对蛋白质进行可视化检测，以确认转膜均匀且无气泡产生。

使用红色警戒 Western 印迹染色液即可轻松完成此步骤。该染色液可直接使用，脱色过程只需用水即可轻松完成。这是在用水洗涤脱色后的凝胶。在用抗体孵育膜之前，需对膜进行封闭处理。

为防止非特异性结合，需使用高质量的封闭试剂对膜进行封闭。将膜在室温下轻轻振荡孵育于封闭液中一小时，以避免背景升高，随后在孵育结束后用 TBST 或 PBST 缓冲液洗涤膜三次。这些缓冲液可分别通过 TBS tween 片剂和 PBS tween 片剂方便快捷地配制而成。

封闭并洗涤膜后，可与一抗孵育。使用溶液一中的信号增强剂配制一抗，以显著增强信号。将一抗用溶液一稀释后，与膜孵育一小时。

孵育后无需添加其他封闭试剂。用TBST洗涤膜，随后将膜与用信号增强液溶液二稀释的二抗溶液于室温孵育一小时。

最后，用TBST再次洗涤膜数次，用于HRP偶联的二抗检测。此处传统上采用增强型化学发光（ECL）进行检测。使用快速步骤的ECL试剂，因其无需混合鲁米诺或增强剂。

只需将膜喷洒数次，孵育两分钟，然后使用X射线胶片显影。Rapid Step具有低至皮克（picogram）级别的灵敏度，并且在加入底物后长达两小时内仍可产生较弱的信号。与标准的Western印迹实验方案相比，Trail mix蛋白标记物可在电泳过程中实现蛋白的追踪。

Signal Boost 可实现更宽的动态范围和更高的灵敏度。最后，通过使用 Rapid step 试剂替代传统的 ECL 试剂，可以获得更优异的灵敏度。我们刚刚向您展示了如何利用一系列全面的产品高效且经济地完成 Western 印迹实验。

请记住，实验结果的质量取决于所用试剂的质量。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。