Western Blotting: Sample Preparation to Detection

该程序的总体目标是证明使用适当的产品时易于进行蛋白质印迹。样品制备后，根据大小分离蛋白质，然后转移到固相中。然后用抗体探测蛋白质并进行检测，使用适当的方案和高质量、经济高效的试剂可产生增强的蛋白质印迹结果。

大家好，我是加利福尼亚州圣地亚哥 EMD Chemicals 的研发科学家 Jesse Luhan。EMD 是德国 Dharm stat 的 Merck， KGAA 的附属公司。今天，我们将向您展示一种蛋白质印迹程序。

那么让我们开始吧。蛋白质印迹的第一步是样品制备。首先，使用低速离心沉淀细胞，例如在 2， 500 倍重力下沉淀 5 分钟。

离心后，排空细胞沉淀。将细胞重悬于 cyto buster 蛋白提取试剂中，每 10 μL 150 μL 重悬于 6 个细胞中。将样品在室温下孵育 5 分钟。

接下来，离心后，在 4 摄氏度下以 16， 000 倍重力离心样品 5 分钟。将清除的 SNA 转移到新试管中并继续分析。评估样品的蛋白质浓度后，准备样品以加载凝胶以使蛋白质变性。

使用含有奥尼变性去污剂（如硫酸钠或 SDS）的样品缓冲液。将混合物在 95 至 100 摄氏度下煮沸 5 分钟。使用市售的预制凝胶，可以根据分子量快速分离蛋白质。

用电泳缓冲液填充电泳装置，该缓冲液可由 Omni PU 化学系列提供的试剂制成。用 Trail mix 蛋白质标记物加载孔的第一条泳道。该标记物具有三个参考条带，可在电泳过程中进行监测。

凝胶染色后，可以看到 10 条带，范围从 10 到 225 千克道尔顿不等。将变性样品加载到剩余的孔中。在 220 伏特下运行凝胶 1 小时。

蛋白质分离后，使用快速染色和超敏染色剂（即用 DS）用 kumasi 蓝对凝胶进行染色，以确保蛋白质均匀均匀地迁移。需要染色，就像可以诱导带电荷的蛋白质在电场中穿过凝胶一样，因此蛋白质可以在电场中从凝胶转移到膜（如 NITROCELLULOSE 或 PVDF）上。使用 PVDF 膜时，将膜浸泡在甲醇中几分钟，然后在冰冷的转印缓冲液中平衡 5 分钟。此外，将凝胶浸泡在冰冷的转印缓冲液 E 中几分钟，平衡可防止凝胶在转印过程中收缩。

对于湿式转印，在海绵和纸之间组装凝胶和膜的夹层。然后在确保凝胶和膜之间没有形成气泡后，将组件紧紧夹在一起。将三明治浸入转印缓冲液中并施加电场。

带负电的蛋白质将流向带正电的电极。然后，膜会阻止他们，结合他们，并阻止他们继续前进。转印完成后，对蛋白质进行可视化，以确保均匀转印，无气穴。

这可以通过 red alert Western 印迹染色轻松完成。这种染色剂是即用型的，并且 des 染色可以很容易地用水完成。这是凝胶，一旦它通过水洗涤被稀释，然后才能用抗体证明膜，膜被封闭。

为防止非特异性结合，请使用高质量的封闭试剂封闭膜。为避免背景增加，在室温下在封闭溶液中轻轻搅拌孵育 1 小时，然后在孵育后在 TBST 或 PBST 中洗涤膜 3 次。这些缓冲液可以分别使用 TBS tween 片剂和 PBS tween 片剂轻松方便地制备。

膜被封闭并洗涤后，即可与一抗一起孵育。使用信号增强溶液之一涂抹一抗，可显著增强信号。在溶液 1 中制备一抗，并将膜孵育 1 小时。

孵育后无需添加更多封闭剂。用 TBST 清洗膜。接下来，将膜与在信号增强溶液 2 中稀释的二抗孵育 1 小时。

最后，用 TBST 再次洗涤膜数次，用于 HRP 偶联。这里传统上使用通过增强化学发光或 ECL 检测二抗。使用 ECL 试剂快速步骤，因为它不需要混合鲁米诺或增强剂。

只需在膜上喷洒几次，孵育 2 分钟，然后使用 X 射线胶片显影即可。Rapid Step 快速步骤具有低皮克级灵敏度和更轻的任务，可在添加底物后长达两小时内使用。与标准 Western 印迹方案相比，Trail mix 蛋白标记物可在电泳过程中进行蛋白质追踪。

Signal Boost 可实现更大的动态范围和灵敏度。最后，使用 Rapid Step 代替传统的 ECL 试剂可以获得卓越的灵敏度。我们刚刚向您展示了如何使用全面的产品系列高效且经济地进行蛋白质免疫印迹法。

请记住，结果的质量取决于试剂的质量。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。