E16 大鼠胚胎的宫内脑室内注射与电穿孔

大家好，我叫William Ti，来自Arnold Creek Stein实验室。今天，我和同事们将向大家演示E16大鼠胚胎的子宫内注射。大家好，我叫Laura Elias。

今天我将向您展示如何制备显微注射移液管，并为即将进行的脑室内注射和电穿孔实验装载移液管。我还将演示如何在E16大鼠胚胎中执行脑室内注射和电穿孔操作。在体电注射和电穿孔技术在大鼠中尤为有用，因为大鼠系统难以进行常规的遗传操作。

好的，该手术过程中会使用多种外科器械。我们会用到一个游离器、几把持针器，其中一对为带齿持针器，另一对末端带有小齿。此外还会用到一把止血钳。

这是一把剪刀，然后我们使用这两个订书器。较大的这个用于大鼠，较小的这个用于小鼠，使用七号订书钉，而这个使用九号订书钉，它们都是弹簧加载的。

我们在此用于辅助手术的一些设备包括一个简单的带有双头的光纤光源。我们使用一个加热垫，通过循环温水来保持温度。工作台面则采用BTX公司生产的电穿孔系统。

我们根据胚胎的大小使用几种不同尺寸的拨片。蓝色一侧为正极。好的，现在我们将对注射毛细管进行斜面处理。

这一点非常重要：你的移液器必须具有足够大的开口，以便能够装载 DNA，但同时必须非常锋利，以免在注射时损伤胚胎。如果注射时损伤了胚胎，胚胎的死亡率将会显著升高，这是不可取的。

因此，这实际上是该手术中一个非常重要的步骤。首先，我们将一些水滴加到正在旋转的磨边石上。然后，我们将取一根——让我们看看——就是一根小棒。

我们将刚拉制好的移液管用胶带固定在这根棒上。然后使用其中一个显微操作器夹住移液管的斜面，使其能够在此处形成斜面。我们只需将移液管放置到位，并利用显微镜观察移液管的尖端。

我们将它直接放在水中的斜面之上，施加轻微的压力。可以看到，针尖正抵住此处的石块。保持这一状态进行研磨，时间至少为15分钟。

我喜欢将它们放置得更久一些，比如一小时左右。有时它们会变得非常、非常锋利，但具体磨边时间的长短确实因人而异。好了，现在我们来看，如图顶部所示，这是一根已经拉制完成但尚未进行磨边的移液管。

因此，虽然它很锋利，但没有可用于加载DNA的开口。现在，下方的移液管已被削成斜面，可以看到这个漂亮的倾斜开口，它能够让你加载DNA，同时仍保留尖锐的尖端，以便在注射时不会造成任何损伤。好的，现在我们要用DNA填充注射用移液管。

因此，以无内毒素的方式制备DNA非常重要，以确保在注射DNA时不会同时注入任何脂多糖。接下来，我们将取出DNA，并在此处准备好我们的点样膜。你需要在此处制备好点样膜，收集DNA，并将其作为一个小点样点直接加到该膜上。

然后，我通常会取每10微升DNA使用约1微升的这种快速染料，我的DNA浓度通常为每微升1.5至1.7微克。使用这种染料有助于我们定位注射位置，并确保成功将样品注入脑室。

然后，我将把这种快绿染料与我的 DNA 混合。接着，取注射电极，通过回拉活塞来填充移液管。你可以看到，如果移液管完好且尖端开口足够大，DNA 应该很容易被吸入。

有时需要来回移动移液器的推杆，以帮助其正确吸样。这样就可以像这样装填移液器。此时，DNA 已完全装入该移液器中，已准备好进行注射。

好的，现在我要对动物进行麻醉。我们使用这些脱帽锥形管，只需将管口边缘向后卷一下，以便更容易握持。

那么我们开始吧。我通常会把它放在笼子的边缘，为它形成一个小小的隧道，让它这样钻进去。好的，这只动物看起来已经安顿下来了。

我们将进行足趾夹捏以确认麻醉效果，只需抓住动物的足趾，用力夹捏一下即可。注意不要用力过猛，以免损伤动物，但需确保其确实处于麻醉状态。

这只动物已经完全麻醉了。接下来，我将剃除它腹部的毛发。我只想避开缝合线，以免不小心剪到它们的末端。

我认为这对动物来说可能会非常痛苦。因此需要先将动物的毛剃除。现在我要把它放入生物安全柜中。

我们将为她进行清洗并开始操作。好的，我们已经再次确认该动物已处于麻醉状态，现在可以先进行清洗。我需要做的是在每只眼睛上涂抹一些眼药膏，以防止她的眼睛变干。

然后，我们将交替使用酒精消毒片和碘伏消毒片进行擦拭，共重复三次，即三次交替擦拭。操作过程中必须非常轻柔，以免在消毒时损伤胚胎。

因此，您只需直接向下擦拭，然后笔直地返回。这是第一步。我需要先将她充分湿润，以便进行擦拭。很好。

这是第二个，这是第三个。好的，我们已经盖上盖子以帮助灭菌，现在我将开始打开动物体。我们开始切割。

好的，我首先需要戴上消毒手套。我们戴上无菌手套后，就可以开始操作了。务必确认动物仍处于麻醉状态。

因此我将再进行一次足趾捏夹，并在整项操作过程中持续进行此类操作。通常情况下，我会先捏起一小部分组织，迅速做一剪口，用镊子夹住顶端并向下切开，再用另一把镊子夹住组织两侧将其撑开。

然后取你要的肌肉组织，在正中线处剪开，以避免损伤任何血管或神经。注意不要夹住组织。好的，看起来我们此处获得了较好的产量。

我要确保充分润滑，以免样本干燥。我再做一个示例，以确认操作无误，看起来情况良好。因此，我总是为劳拉调整位置，通常我会将胚胎的头部置于母鼠的右侧，以保持一致性。

现在我开始。在这里我们可以看到胚胎，可以看到尾部和后部晶状体，头部则位于更上方的位置。

在这里，我们观察的是该胚胎的头部。可以看到中线位置有一条深色的线条。此外，还可以分辨出左半球和右半球，以及后脑部分。

现在我将把注射目标定为左侧大脑半球。用移液器注入，稍微上提后注入染料。现在可以看到染料正在扩散到左侧侧脑室。

因此，这看起来是一次成功的注射。很好，现在我们可以看到心室已充分充盈。染料实际上已从左心室通过至右心室。

因此，我们在两个心室中都有D和DNA。此时，我将取电穿孔电极，将其置于大脑两侧，正极放在左侧。这样，DNA就能进入左侧半球的前体细胞和皮层壁。

现在我正在通入电流。当我们开始通入电流时，你会在电极的负极端看到一些泡沫。这是一个令人放心的现象，表明你已经正确连接了电极。

好的，现在我们已经对这些胚胎进行了电转，接下来我将把它们放回并缝合切口。现在我将给她注射10 mL抗生素，并使用手术缝线进行缝合。我喜欢采用间断缝合的方式。

之后，我们将使用皮肤缝合器对皮肤进行缝合。明白吗？好。我已经给她注射了一剂布托啡诺，以确保她在苏醒过程中不会感到任何疼痛。现在，我将她放入培养箱中，这样可以在她苏醒期间保持体温，避免出现低体温。

好的，我们刚刚向您展示了如何在大鼠体内进行子宫内脑室内注射和电穿孔。您可以向脑室内直接注射多种不同的物质，例如病毒，包括慢病毒或逆转录病毒。

在这种情况下，您无需进行电穿孔，因为病毒会自行整合到细胞中。如果您注射的是质粒DNA（如我们今天所做的），则必须进行电穿孔，才能使质粒进入脑室壁的细胞。因此，您可以利用这些载体实现多种实验目的。

你可以仅使用它们来标记细胞并表达GFP，从而观察这些前体细胞的分裂和迁移过程。你也可以利用这些载体来操控细胞，例如表达shRNA发夹结构，进而敲低特定基因。

您还可以过表达特定基因，从而操控经过电穿孔或病毒感染的细胞。这种方法在研究特定蛋白质在您感兴趣的生物学过程中的作用时非常强大。这对于大鼠的研究尤其重要，因为与小鼠相比，对大鼠进行遗传操作要困难得多。