Name: 重演的离子通道IV曲线的使用频率分量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习使用频率分量表征离子通道频率响应的新技术，通过全细胞电压钳技术同时测量多种离子通道类型的电流。该方法无需药理学阻断剂即可实现多通道同步测量，有助于深入理解离子通道相互作用机制。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R21-HL094828-01，授予 Poelzing 博士。

1. 准备噪声函数和输入信号
<ol>
<li>创建一个包含所需频率成分的噪声函数。可通过在频域中描述所需的频率成分，然后计算其快速傅里叶逆变换来实现。本研究中使用了 1 - 15 kHz 的频率范围。本研究中所有傅里叶变换和逆傅里叶变换均使用 Matlab 的 FFT 和 IFFT 函数进行计算。</li>
<li>适当地调整噪声函数的幅度。在本研究中，噪声函数被缩放，使其从零到峰值的幅度为 50 或 100 mV。</li>
<li>使用与所用采集软件相适应的方法创建刺激文件。对于 Clampex 8，首先创建一个带有适当文件头的文本文件。在文件头下方，第一列中插入单次扫描的时间增量。时间增量应与测量中使用的采样间隔具有相同的时间间距。对于电压步阶协议中的每一次扫描，在每个时间点插入所需的精确电压值，其中应包含噪声函数。</li>
</ol>
2. 进行电压钳制测量
<ol>
<li>在采集软件中创建一个与先前生成的刺激文件兼容的测量方案。在Clampex中，有一个菜单允许用户将刺激文件与当前方案相关联。</li>
<li>将模型（或生物）细胞连接到测量设备上。</li>
<li>按计划进行实验。为对照目的，务必包含一些不包含任何噪声函数的周期性测量。</li>
</ol>
3. 实验后分析
<ol>
<li>计算单次记录的电流-电压（IV）曲线。如果在施加噪声函数时记录处于稳态，则可使用噪声函数时间范围之外的稳态部分来生成IV曲线。如果记录未处于稳态，噪声函数可能会干扰IV曲线的计算，因此应另进行一次无噪声函数的记录。 </li>
<li>对记录中的每个电压步长，计算插入噪声函数部分的快速傅里叶变换。将每个电压步长的傅里叶变换组合成一个 m × n 矩阵，其中 m 为快速傅里叶变换中的频率数，n 为电压步长数。在此配置下，矩阵的每一行表示实验中所有电压步长下单个频率的幅值。</li>
<li>针对每个频率（即上述矩阵中的每一行），将该行与在3.1中生成的IV曲线进行相关性分析，并记录相关系数。</li>
<li>绘制相关系数与频率的关系图，以可视化与 IV 曲线高度相关的频率。由于直流分量包含在 FFT 的第一个频率中，因此该频率的相关系数应始终为 &gt; 0.99. </li>
</ol>
4. 代表性结果：

图1A和图1B分别展示了在未插入（图1A）和插入（图1B）噪声函数的电压阶跃方案下，模型细胞的代表性电压钳记录结果。同时，还计算了该模型细胞的电流-电压（IV）曲线（图1C）。对于图1中的每次扫描记录，快速傅里叶变换（FFT）均在插入噪声函数的时间段内进行计算（参见图1A和1B中的红色框）。图2A和图2B分别展示了对图1A和图1B所示记录数据计算得到的FFT结果。通过肉眼观察可见，直流（DC）分量（以红色标出）的形状与IV曲线相似。在未插入噪声函数时，除DC分量外的所有频率成分的幅值均接近于零（图2A）。当插入噪声函数后，1至15 kHz范围内的频率成分呈现出明显可辨的幅值（图2B）。图3展示了将不同频率幅值随电压阶跃变化的情况与IV曲线进行相关性分析的结果。图3A至3C分别显示了在对照条件（无噪声函数）以及噪声幅值为50 mV和100 mV时的相关系数。注意在所有情况下，DC分量与IV曲线几乎完全相关。事实上，在所有记录中，该频率的相关系数均大于0.99（R = 0.9996 ± 1E-5，均值±标准差）。在图3A（对照条件）中可见，除DC分量外，没有任何其他频率的幅值与IV曲线表现出显著相关性。具体而言，这些频率的相关系数均未超过0.5。即使插入最低幅值的噪声函数（50 mV），这些频率的相关系数仍低于0.5。当噪声幅值增加至100 mV时，这些频率的相关系数也未超过0.5。

 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="模型细胞电流-时间曲线及IV曲线图；信号噪声与电学特性分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 模型细胞记录：显示了在电压阶跃程序中未包含（1A）和包含（1B）噪声函数的模型细胞的电压钳制记录。每次扫描的前20 ms和后20 ms，电位保持在钳制电位（0 mV）。每个电压阶跃持续80 ms，噪声函数在阶跃开始后40 ms插入，持续30 ms，包含1至15 kHz之间的频率成分。电压以5 mV为增量，从-150 mV阶跃至+50 mV。同时展示了该模型细胞的IV曲线（1C）。为了便于观察记录，1A和1B中仅显示每第五次扫描，而1C中包含了所有扫描数据。
 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="电位与频率的傅里叶变换分析；示意图比较了无噪声与有噪声条件下的情况。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 记录信号的快速傅里叶变换（FFT）：对每次扫描中将插入噪声函数的30 ms时段（图1A、1B中红框标示区域）计算了FFT。图2A和图2B分别显示了未添加和添加噪声函数时计算得到的FFT结果。为清晰起见，图中仅展示了每第五次扫描的FFT结果，但在后续计算中使用了所有扫描的数据。
 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="0、50、100 mV 下的频率相关性图；x 轴：频率 (kHz)，y 轴：相关性 (R)" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. IV 频率相关性：显示了在不同电压步阶范围内，记录的 IV 曲线与各个频率振幅之间的相关性结果。图 1A - 1C 分别显示了在对照条件下以及存在 50 或 100 mV 噪声函数时，0 至 20 kHz 频率范围内的相关系数。
 <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="IV 曲线图；电压-电流关系；实际 IV 曲线、直流分量、R 值=0.3212。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. IV 曲线的重建：模型细胞的 IV 曲线（与图 1C 相同）与两个频率的幅值叠加显示。第一个频率为直流分量（R = 0.995），第二个为随机选择的相关性较低的频率（R = 0.3212）。频率幅值被缩放至与 IV 曲线近似相同的幅度。

<ol><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Ukomadu, C., Zhou, J., Sigworth, F. J., Agnew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mu%5Dl+Na%2B+channels+expressed+transiently+in+human+embryonic+kidney+cells%3A+Biochemical+and+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mu]l Na+ channels expressed transiently in human embryonic kidney cells: Biochemical and biophysical properties.</a> Neuron. 8, 663-676 (1992).</li>
<li>Abriel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Arrhythmogenic+Mechanism+Revealed+by+a+Long-QT+Syndrome+Mutation+in+the+Cardiac+Na%2B+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Arrhythmogenic Mechanism Revealed by a Long-QT Syndrome Mutation in the Cardiac Na+ Channel.</a> Circ Res. 88, 740-745 (2001).</li>
<li>Giles, W. R., Imaizumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+potassium+currents+in+rabbit+atrial+and+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells.</a> J Physiol. 405, 123-145 (1988).</li>
<li>Lee, K. S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calcium+channel+blockade+by+verapamil%2C+D600%2C+diltiazem+and+nitrendipine+in+single+dialysed+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calcium channel blockade by verapamil, D600, diltiazem and nitrendipine in single dialysed heart cells.</a> Nature. 302, 790-794 (1983).</li>
<li>Ozdemir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Na%2FCa+Exchange+Results+in+Increased+Cellular+Ca2%2B+Load+Attributable+to+the+Predominance+of+Forward+Mode+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Na/Ca Exchange Results in Increased Cellular Ca2+ Load Attributable to the Predominance of Forward Mode Block.</a> Circ Res. 102, 1398-1405 (2008).</li>
<li>Zhang, S., Zhou, Z., Gong, Q., Makielski, J. C., January, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Block+and+Identification+of+the+Verapamil+Binding+Domain+to+HERG+Potassium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels.</a> Circ Res. 84, 989-998 (1999).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Poelzing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+increased+right+ventricular+conduction+sensitivity+to+flecainide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying increased right ventricular conduction sensitivity to flecainide challenge.</a> Cardiovasc. Res. 77, 749-756 (2008).</li>
<li>Goodman, M., Art, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+by+a+potassium-selective+inward+rectifier+enhances+tuning+in+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Positive feedback by a potassium-selective inward rectifier enhances tuning in vertebrate hair cells.</a> Biophysical Journal. 71, 430-442 (1996).</li>
<li>Han, A., Frazier, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+characterization+using+single+cell+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ion channel characterization using single cell impedance spectroscopy.</a> Lab Chip. 6, 1412-1414 (2006).</li>
<li>Hayashi, H., Fishman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+K%2B-channel+kinetics+from+analysis+of+the+complex+conductance+of+Aplysia+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier K+-channel kinetics from analysis of the complex conductance of Aplysia neuronal membrane.</a> Biophysical Journal. 53, 747-757 (1988).</li>
<li>Millonas, M. M., Hanck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+response+spectroscopy+of+voltage-sensitive+ion+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium response spectroscopy of voltage-sensitive ion channel gating.</a> Biophys. J. 74, 210-229 (1998).</li>
<li>Misakian, M., Kasianowicz, J., Robertson, B., Petersons, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+alternating+currents+through+the+Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of alternating currents through the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin ion channel.</a> Bioelectromagnetics. 22, 487-493 (2001).</li>
<li>Sale, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Properties+of+hERG+1a%2F1b+Heteromeric+Currents+and+a+hERG+1b-Specific+Mutation+Associated+With+Long-QT+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological Properties of hERG 1a/1b Heteromeric Currents and a hERG 1b-Specific Mutation Associated With Long-QT Syndrome.</a> Circ Res. 103, 81-95 (2008).</li>
<li>Blatz, A. L., Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+description+of+three+modes+of+activity+of+fast+chloride+channels+from+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative description of three modes of activity of fast chloride channels from rat skeletal muscle.</a> J Physiol. 378, 141-174 (1986).</li>
<li>Kuo, J. J., Lee, R. H., Zhang, L., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+persistent+sodium+current+in+spike+initiation+during+slowly+rising+inputs+in+mouse+spinal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the persistent sodium current in spike initiation during slowly rising inputs in mouse spinal neurones.</a> The Journal of Physiology. 574, 819-834 (2006).</li>
<li>Thompson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+potassium-channel+selectivity+revealed+by+Na%28%2B%29+and+Li%28%2B%29+binding+sites+within+the+KcsA+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of potassium-channel selectivity revealed by Na(+) and Li(+) binding sites within the KcsA pore.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1317-1324 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

目前存在一些技术障碍，阻碍研究人员同时测量多种离子通道类型，并进一步确定每种通道类型所贡献的电流大小。由于这一限制，离子通道通常通过电压钳、电流钳和动作电位钳等技术进行单独研究。1 为研究特定的通道类型，常采用异源表达系统。2 在处理从组织中分离的细胞（如心肌细胞）时，必须采用其他方法来阻断各种离子通道。例如，可通过缓慢去极化的电压斜坡使钠通道失活。3 内向整流性钾通道可被细胞外 BaCl₂ 阻断，4 钙通道可使用维拉帕米阻断。5
一种部分克服此局限性的方法是同时测量两种通道类型中的电流通量，然后在使用适当试剂选择性阻断其中一种通道类型后重复测量。通过将两次测量结果相减，可估算出被阻断通道类型所贡献的电流量6。然而，该技术存在两个主要局限性。首先，尚未发现能够选择性阻断每种离子通道的化学试剂，且一些广泛使用的药物会非特异性地作用于其他类型的通道5,7。其次，该技术无法确定一种通道是否受到另一种通道的调节。例如，在豚鼠心室中已观察到NaV 1.5与Kir 2.1的异源性表达，有研究提示这两种通道之间可能存在协同关系，即右心室中较高的Kir 2.1表达会降低传导速度8。目前，这一假设尚无法被验证。
在本研究中，我们认为阻抗谱可能是一种用于同时研究多种离子通道类型的有用工具。尽管本文所提出的方法尚未被用于区分同时测量的两种通道类型的电流，但阻抗谱已被用于研究离子通道功能的多个其他方面。Goodman 和 Art 利用龟听觉毛细胞表明，电流钳协议可被修改以使细胞调谐至不同频率，而膜电位的振荡是由于内向整流钾通道（K⁺）与电压门控钙通道之间相互作用所致。+ 通道和 Ca2+ 通道9 韩和弗雷泽证明了可以在单个细胞中测量宽频率范围（100 Hz 至 5 MHz）内的阻抗，并观察到当 K+ 或 Ca2+ 通道被阻断可能是一种在高通量药物筛选中检测通道阻滞的简便方法。10 Hayashi 和 Fishman 已采用复电导法研究内向整流性 K+ 通道11 其他研究团队已在不同通道类型的电压钳制方案中插入单一频率，并发现所观察到的频率响应在某些频率下与预期响应一致，但在其他频率下则不一致。12,13 Millonas 和 Hanck 提出，某些频率未产生预期响应的原因在于马尔可夫模型中存在多个速率常数。12 此类研究以及其他研究均表明，在使用阻抗谱技术测量离子通道的离子电流时，存在测量结果与理论频率响应不一致的情况。本研究中无需担忧此问题，因为本研究方法的目的是识别与电流幅值相关的频率，而不依赖于膜电学电路的潜在假设。此外，电流幅值是根据记录中未插入任何噪声函数的部分计算得出的。还有许多其他研究提出了多种离子通道的模型，这些模型包含多个导通态和非导通态，每个状态均有其各自的速率常数。14,15,16 Thompson 等人表明，KcsA 通道的选择性滤过区对 Na 具有不同的结合位点+，Li⁺ 和 K⁺+，而当离子通过选择性滤器在不同结合位点间移动时，其迁移所需的能量代价决定了通道对K⁺的优先传导性+ 通过其孔道的离子17 在本文中，我们将一系列频率（噪声函数）插入到电压阶跃方案中，并寻找那些其振幅与总电流振幅高度相关的频率。已有充分证据表明，多个速率常数在离子通过不同通道的传导过程中发挥作用，因此引入与这些速率常数相对应的频率，可能导致某些频率与电流振幅产生共振或高度相关，而这种情况在无此引入时本不会出现。本研究中所展示的技术应用于一个模型细胞，该模型为一个并联RC电路，通常用于测试电压钳制电路及数据采集设备。理论上，除直流（DC）外，不应有其他频率与电流幅值相关，我们的数据结果也证实了这一点。我们还发现，加入噪声函数后并未导致任何频率与电流振幅高度相关。这两项发现至关重要，表明测量设备和噪声函数本身不会引起频率与电流振幅之间的相关性。在未来的研究中，当使用含有离子通道的膜进行测量时，预期根据所用通道的不同，对应于选择性滤器或可能孔道区域中速率常数的频率将影响通道的频率响应，从而影响哪些频率与电流振幅呈现高或低的相关性。
由于该方法是一种研究离子通道的新技术，未来的研究可以从多个方向展开。首先，应利用该技术来表征特定分离通道的频率响应特性。此外，还需进一步工作以将频率幅度与电流幅度进行校准。在对多种通道分别进行表征后，应同时测量多种类型的通道。该技术还可被改进用于动作电位钳、电流钳以及场刺激研究。尽管这是一项新技术，但它展现出一种强有力的方法，有望实现以往无法完成的电生理测量，并为深入理解离子通道的生理功能提供宝贵的新见解。

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td>马萨诸塞州纳蒂克</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>分子设备公司</td><td>Clampex 8</td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr><tr><td>集成式膜片钳放大器</td><td>分子设备公司</td><td>Axopatch 200</td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr><tr><td>前置放大头级</td><td>分子设备公司</td><td>CV202</td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr><tr><td>16位数据采集系统</td><td>分子设备公司</td><td>Digidata 1322A</td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr><tr><td>模型细胞</td><td>分子设备公司</td><td>Patch 1 Model Cell</td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr></tbody></table>

利用频率分量重现离子通道iv曲线

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

引言：目前尚无成熟的方法可同时测量多种离子通道类型，并将测得的电流分解为各通道类型所贡献的部分。本研究展示了如何利用阻抗谱技术来识别特定频率，这些频率与电压钳制实验中测得的稳态电流幅度高度相关。该方法涉及在电压阶跃方案中插入包含特定频率的噪声函数。在本研究中，采用模型细胞证明了电压钳制电路本身不会引入高相关性，且在不存在离子通道时，噪声函数本身也不会引入任何高相关性。在将该技术应用于含有离子通道的样本之前，此类验证是必要的。本方案的目的是展示如何表征单种离子通道类型对噪声函数的频率响应。一旦在某种特定通道类型中识别出相关频率，便可利用这些频率重建其稳态电流-电压（IV）曲线。那些与某一通道类型高度相关而与其他通道类型相关性极低的频率，随后可用于估计同时测量的多种通道类型的电流贡献。
方法：在模型细胞上采用标准电压阶跃方案（-150 至 +50 mV，步长 5 mV）进行电压钳制测量。在每个电压阶跃中插入包含 1–15 kHz 频率成分且幅度相等的噪声信号（零到峰峰值：50 或 100 mV）。针对每个阶跃电位，分别计算输出信号快速傅里叶变换（FFT）实部在有噪声和无噪声条件下的数值。各频率成分的幅度随电压阶跃的变化与相应电压下的电流幅度进行关联分析。
结果与结论：在无噪声（对照）条件下，除直流分量（DC组分）外，所有频率的幅值与IV曲线的相关性均较差（|R|&lt;0.5），而直流分量在所有测量中的相关系数均超过0.999。当在电压阶跃方案中加入噪声函数后，各频率与IV曲线之间的相关性质量并未发生变化。同样，增加噪声函数的振幅也未提高相关性。对照实验表明，电压钳电路本身不会导致0 Hz以上的任何频率与稳态IV曲线高度相关。同样，在存在噪声函数的情况下进行的测量表明，当不存在离子通道时，噪声函数不会导致0 Hz以上的任何频率与稳态IV曲线相关。基于此验证结果，该方法现可用于仅含单一类型离子通道的样本，以识别其振幅与该特定通道类型显著相关的频率。

同时测量多个离子通道的电流通量，并随后区分跨膜电流中每种通道类型的贡献，存在技术上的困难。为满足这一需求，本方法提出了一种利用特定频率成分来生成单个通道类型电流-电压（IV）曲线的方法。

利用频率分量重现离子通道IV曲线

引言：目前尚无 established 方法可同时测量多种离子通道类型，并将测得的电流分解为……

本实验的总体目标是展示一种用于表征离子通道频率响应的技术，以实现同时测量多种通道类型中的电流流动。该目标首先通过生成将被纳入电压阶跃方案的噪声函数，并将其整合到刺激文件中来实现，这是在Clamp X软件中使用自定义波形所必需的步骤。实验的第二步是将刚刚创建的电压阶跃方案通过标准的全细胞电压钳技术施加于模型细胞，并记录所产生的电流。实验的第三步是计算细胞的电流-电压（IV）曲线，以及每个扫描片段中包含噪声函数部分的快速傅里叶变换（FFT）。该实验步骤的最后一步是将每个频率在所有电压步阶下的振幅分别与该细胞的 IV 曲线进行单独相关性分析。结果显示，没有任何频率与模型细胞的 IV 曲线表现出高度相关性。与现有的标准全细胞电压钳制等方法相比，该技术的主要优势在于，它可能提供一种无需使用药理学阻断剂或电压激活方案即可同时测量多种离子通道类型的方法。该方法有助于解答离子通道生理学领域中的关键问题，例如某种离子通道在组织中的表达水平对同一组织中其他类型离子通道活性的影响。本实验方案的第一步是创建一个包含所需频率成分的噪声函数。为此，首先需在频域中描述所需的频率成分。本研究中使用了1至15千赫兹之间的频率成分。然后利用MATLAB的IFFT函数计算逆快速傅里叶变换，将所选频率转换到时域，接着适当调整噪声函数的幅度。在本研究中，噪声函数被缩放两次，第一次使噪声函数的零到峰值振幅为 50 毫伏，第二次使其零到峰值振幅为 100 毫伏。下一步是使用 MATLAB 等程序创建刺激文件。刺激文件只是一个文本文件，其头部包含信息，用于精确指示钳制 X 八通道采集软件在每一时间点应使用的电压。首先创建刺激文件时，需创建一个文本文件，并在下方添加适当的文件头。在第一列中插入单次扫描的时间增量，时间增量应与测量时所用的采样间隔具有相同的时间间隔。本方案采用 200 千赫兹的采样率。对于每次扫描，在每个时间步长处插入所需的确切电压值。每一列被视为一个独立的扫描，因此对于一个从负150毫伏到正50毫伏、以5毫伏为增量的实验方案，应在时间列之后添加41列。指定的电压应包含钳制软件Clamp X中的噪声函数。每次实验都必须创建相应的实验方案，因此下一步是创建一个与先前生成的刺激文件兼容的测量方案。在Clamp X中，选择采集器编辑协议波形零菜单选项，该选项允许您将刺激文件与当前协议相关联。下一步是将定义的刺激施加于细胞。本方案使用具有并联RC电路的模型细胞。将模型细胞连接到测量设备，点击记录按钮并钳制X以执行操作。该实验计划用于对照目的。在收集数据后，务必包含一些不施加任何噪声函数的周期性测量；下一步是生成IV曲线并进行快速傅里叶变换。要计算单个记录的IV曲线，请使用记录中在时间上处于噪声函数作用范围之外的稳态部分，以测量电流幅值。如果在施加噪声函数时记录尚未达到稳态，则该噪声函数可能会干扰电流-电压（IV）曲线的计算，此时应使用对照记录。为计算每次电压阶跃的IV曲线，需对记录中插入噪声函数的部分进行快速傅里叶变换（FFT）。将每个电压阶跃对应的傅里叶变换结果组合成一个M×N矩阵，其中M为FFT中的频率点数，N为该配置中的电压阶跃数。矩阵中的每一行代表实验中所有电压步长下单个频率的FFT幅值。下一步是计算每个频率的相关系数，将每一行与先前生成的IV曲线进行相关性分析，并记录相关系数。接下来生成相关系数与频率的关系图，以直观显示与IV曲线高度相关的频率。此处展示的是未插入噪声函数时电压钳制测量的结果。在每次扫描的前20毫秒和最后20毫秒，电位保持在0毫伏的钳制电位。电压以5毫伏为步长，从负150毫伏逐步增加至正50毫伏。每个电压步阶持续80毫秒，为使图像更易于观察，图中仅包含每第五次扫描的结果。红色框表示若这些扫描中存在噪声函数，则噪声函数应被施加的时间段。该图与前一张图类似，但在电压阶跃开始后 40 毫秒处将噪声函数插入电压阶跃方案中，红色框标示了噪声函数插入的位置。噪声函数持续时间为 30 毫秒，包含 1 至 15 千赫兹之间的频率。该图显示了为模型细胞计算得到的电流-电压（IV）曲线。该电流-电压曲线呈线性，这是预期的结果，因为模型细胞是一个简单的并联RC电路。此图显示了每次扫描中未加入噪声函数时的FFT结果。在模型细胞的记录中，FFT的计算时间范围是插入噪声函数的时间段。直流分量（以红色突出显示）似乎模仿了IV曲线的形状。除直流分量外的所有频率的振幅均接近于零；为清晰起见，图中仅包含每第五次扫描的快速傅里叶变换（FFT）结果。当对叠加了噪声函数的记录数据进行FFT计算时，1至15千赫兹之间的频率呈现出明显的振幅。这些在常规电压钳实验中通常不存在的高频成分的出现，引发了一个问题：这些频率成分的幅值是否与电流幅值成比例地变化？接下来的三幅图展示了各个频率分量的振幅与记录的电流-电压（IV）曲线之间的相关系数。在第一幅图中，未使用噪声函数；在第二幅图中，噪声函数的峰值振幅为 50 毫伏；在第三幅图中，噪声函数的峰值振幅为 100 毫伏。请注意，在所有情况下，直流分量（即零赫兹处的响应）的相关系数均大于 0.99，因此与 IV 曲线几乎完全相关。此外，在所有三幅图中，其他频率的相关系数均未超过 0.5。另外，无论加入振幅为 50 毫伏还是 100 毫伏的噪声函数，该模式均未发生改变。这些结果表明，电压钳制电路本身以及噪声函数均不会在电流-电压（IV）曲线上引入高相关性。在将该技术应用于含有离子通道的样本时，此验证至关重要。本图重现了IV曲线，以展示两组频率数据之间存在或不存在的相关性。本图中，标记为“实际IV”的模型电池的IV曲线是与红色虚线重叠的点线。红色虚线表示直流分量，其与实际IV曲线的相关系数为0.995。第三条曲线显示为锯齿状线条，对应一个随机选择的4.399千赫频率，相关性较低。该直线与 IV 曲线的相关系数为 0.3212。这些结果表明，根据本验证，测量设备和噪声函数本身不会导致任何频率与电流幅度相关。因此，本文提出的方法——在电压钳实验期间的电压阶跃中插入噪声函数——可首先应用于仅含单一离子通道类型的膜制备物，随后扩展至包含多种通道类型的制备物。单离子通道实验的结果可采用本文提出的快速傅里叶变换（FFT）和相关性分析进行分析。该分析可用于鉴定其振幅与特定通道类型特异性相关的频率。已有充分证据表明，多个速率常数在离子通过不同通道的传导过程中发挥作用。因此，一旦确定了这些频率，它们将与某一特定通道类型高度相关，而与其他通道类型的关联性极低。随后可利用这些频率，通过该流程同时估算多种通道类型测量值的当前贡献。还可采用其他方法，如药理学阻断和预脉冲，以回答其他问题，例如当离子通道处于阻断或失活状态时，其频率响应特性如何变化。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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