Name: 大鼠主动迟发型超敏反应（DTH）的诱导和监控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: 学习在Lewis大鼠中诱导迟发型超敏反应（DTH）的实验方法，使用KLH抗原与弗氏佐剂乳化液进行免疫接种，并通过肿胀测量监测炎症反应。该技术为研究T淋巴细胞介导的免疫应答提供了可靠的动物模型。

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1. 乳剂的制备
<ol>
<li>乳剂是抗原（迟发型超敏反应可针对多种抗原诱导产生：卵清蛋白、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白等）的水溶液与完全弗氏佐剂按1:1比例混合而成。必须将抗原加入佐剂中，而不能反向操作！！！ </li>
<li>制备和注射乳剂时会有较多损耗，因此务必比所需量多准备1.5至2倍。 </li>
<li>将抗原溶解于生理盐水中，配制成2 mg/ml的溶液。不要过滤，以免损失聚集物！！！ </li>
<li>取完全弗氏佐剂H37Ra（Difco，货号# 231131）置于试管中，高速涡旋。在持续涡旋的同时逐滴加入抗原。待全部抗原加入后，继续涡旋5分钟以上。混合物应变为乳白色。 </li>
<li>将乳剂装入玻璃注射器，并用18G连接桥（Fisher货号# 14-825-17L）连接另一玻璃注射器。来回推动乳剂直至变得粘稠（5-10分钟）。最好使用两个5 ml注射器。若所需乳剂超过5 ml，应使用多组5 ml注射器。 </li>
<li>乳剂可在注射器中于4°C保存3周。</li>
</ol>
2. 大鼠的免疫
<ol>
<li>将乳剂在注射器中混合几分钟，然后转移至用于注射的注射器中。使用23G针头和带有鲁尔锁扣的3 ml注射器，在尾根部1-2个位点皮下注射200 ml。</li>
</ol>
3. 在背部进行抗原攻击
<ol>
<li>免疫后第7天，剃除大鼠背部两处毛发，分别在一处皮内注射20 ml浓度为1 mg/ml的抗原溶液，另一处注射生理盐水（或无关抗原）。切勿过滤抗原溶液，以免丢失可增强炎症反应的聚集体。 </li>
<li>为避免动物移动，应将大鼠进行麻醉。使用27G ½针头和1 ml注射器进行皮内注射，每次注射需更换针头。 注意：为了获得更精确的测量结果，攻毒实验也可在耳廓进行，而非背部。详见视频 <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325</a> </li>
</ol>
4. DTH 的测量
<ol>
<li>注射部位将开始发红并出现肿胀，这是炎症的迹象。使用直尺或更佳的游标卡尺测量炎症区域的直径。&nbsp;肿胀程度通常在24至72小时内达到峰值。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+monitoring+of+adoptive+delayed-type+hypersensitivity+in+rats.">Induction and monitoring of adoptive delayed-type hypersensitivity in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 8, (2007).</li></ol>

作者是 Airmid 公司的联合创始人和顾问。

为了更精确地测量DTH反应，我们建议用抗原刺激大鼠耳廓。随后可通过测量相关抗原刺激耳与仅用生理盐水或无关抗原刺激耳之间的耳部肿胀差异来评估反应。图1展示了耳部刺激的操作示范。

<table><tbody><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;rsquo;s佐剂 H37Ra</td><td>试剂</td><td>Difco 实验室</td><td>231131</td><td>由 Fisher 以目录号 DF 311-360-5 分销</td></tr><tr><td>钥孔血蓝蛋白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-5654</td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5503</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 玻璃注射器</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-10 B</td><td>每批5 ml乳剂需要两个5 ml注射器</td></tr><tr><td>18G 金属桥</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-17L</td><td></td></tr><tr><td>Lewis大鼠</td><td>动物</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>7至9周龄的雌性大鼠</td></tr><tr><td>23G 1&quot; 针</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826 AA</td><td>在大鼠之间更换针头是最佳做法</td></tr><tr><td>3 ml 鲁尔锁型注射器</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-63</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>试剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 普通尖端注射器</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-257-154</td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2&quot; 针头</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>电动无线修枝剪</td><td>工具</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-32130</td><td>在背部抗原攻击前对大鼠进行剃毛。</td></tr><tr><td colspan="5">使用无菌溶液、试剂和注射器。玻璃注射器和18G连接管可高压灭菌。首次操作试剂前请阅读材料安全数据表，并佩戴适当的个人防护装备。</td></tr></tbody></table>

大鼠主动迟发型超敏反应（dth）的诱导与监测

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润到免疫系统已致敏抗原的注射部位。该炎症反应的特征是抗原攻击部位出现红肿。DTH是评估免疫抑制剂体内疗效的便捷模型。皮肤DTH可通过过继转移抗原特异性T淋巴细胞，或通过抗原主动免疫后，在特定皮肤区域进行皮内抗原攻击以诱导炎症反应。DTH反应可针对多种抗原诱导产生，例如卵清蛋白、结核菌素、破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白（KLH）。
本文演示如何在Lewis大鼠中诱导主动迟发型超敏反应（DTH）。首先，我们将制备含有我们感兴趣的抗原KLH的水包油型乳剂，将其溶于完全弗氏佐剂中，并将该乳剂皮下注射至大鼠体内。此步骤可启动免疫系统，使其产生针对KLH的记忆T细胞。七天后，我们将在大鼠背部进行皮内攻击：一侧注射KLH，另一侧注射无关抗原卵清蛋白（ovalbumin）。炎症反应将在16至72小时后显现，通过测量红肿区域的大小来评估DTH反应的严重程度。

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应。本文演示如何在Lewis大鼠中诱导主动DTH反应，并监测其炎症反应过程。

大鼠主动迟发型超敏反应（DTH）的诱导与监测

迟发型超敏反应（DTH）是一种由CCR7-效应记忆T淋巴细胞介导的炎症反应，这些细胞会浸润抗原注射部位……

您好，我是Christine Beaton。我在加州大学欧文分校生理学与生物物理学系的George Chandy实验室工作。今天我将向您演示如何在大鼠中诱导主动迟发型超敏反应（DTH）。为此，我将制备一种乳剂，其中包含作为抗原的KLH和弗氏佐剂。随后，我将该乳剂注射到Lewis大鼠尾根部，以诱导大鼠产生针对KLH的免疫反应。一周后，我将用KLH对大鼠进行攻击，并通过测量肿胀程度来评估迟发型超敏反应（DTH）。这是攻击位点，我们在实验室中利用该位点来观察PO通道阻滞剂对诸如迟发型超敏反应（DTH）等炎症反应的影响。以下是我将用于制备乳剂的不完全弗氏佐剂，我也可以使用完全弗氏佐剂。这是KLH的石英，它是我今天使用的抗原，我这里有一份浓度为每毫升2毫克的溶液。在PBS中，我将使用这个5毫升的注射器取出不完全佐剂，并将其转移到一个15毫升的离心管中。然后，我将把该管放在涡旋振荡器上，在涡旋的同时，将我的抗原一滴一滴地加入佐剂中。然后我将涡旋混合5分钟。之后，我将用该混合物填充这支5 mL玻璃注射器，必须使用玻璃注射器，因为佐剂容易腐蚀塑料。我们发现5 mL注射器最适合制备乳剂。过小或过大效果都不好。当我将混合物吸入注射器后，我会使用这个金属连接桥，将这支玻璃注射器与另一支5毫升的玻璃注射器连接起来。然后，我将对注射器施加压力，使混合物尽可能快速地在两支注射器之间来回转移，直到混合物变得非常坚硬，即乳剂完全硬化，此时即可用于注射。因此，我将加入2.5 ml的佐剂。首先注入空气，以便更顺利地将佐剂完全排出，然后将全部佐剂加入试管中。接下来，我将取2.5 ml该混合物，并在涡旋振荡器上进行混匀。由于我取了2.5毫升的佐剂，因此我也会取2.5毫升的KLH。当我一滴一滴加入时，你会看到混合物的颜色发生变化，逐渐变白。现在我已经将全部抗原加入到了佐剂中。接下来，我将把混合物涡旋振荡5分钟。但由于我不希望一直用手拿着离心管5分钟，因此我会将其用胶带固定在涡旋振荡器上。目的是在管内产生涡旋，但速度不宜过快，以免液体溢出。我将保持此状态5分钟。五分钟后，我将停止涡旋，此时混合物呈白色。我取出离心管。哎呀。此时混合物已完全呈白色，但仍然较为稀薄。为了使混合物更利于注射，我将把全部混合物转移至一支5毫升玻璃注射器中。这些注射器已经过高压灭菌。我将一支完整的注射器连接到桥接装置上，而另一支注射器则仅连接其筒身。我将活塞留在外面，然后将混合液倒入上方的注射器中。接着，我会将所有液体转移至下方的注射器。之后，我需要推动此处存在的气泡，将其排出。因此，我将断开顶部的注射器，并推动气泡。气泡很难看到，但就在这里。因此，我推动气泡。我还会将其从桥接处推出，然后重新连接顶部的注射器。确保所有连接处都紧密无漏后，我将把混合物从一个注射器推入另一个注射器。起初操作较为容易，但很快混合物会变得难以推动。因此，随着时间推移，今晚的操作变得越来越困难，我不想破坏乳剂层，所以我只是转动我的注射器。有时所需时间更长，这因不同乳剂而异。这可能取决于温度和湿度水平。但我想我的乳剂已经准备好了，它比我刚倒入时要浓稠得多。它完全呈白色，且仅有一相。乙酸环己胺（ACO）相与油相绝不应出现分层现象。现在可以进行注射了。此时浸泡液已准备好用于注射。注射时，我将每个笼舍注射 200 µL。为此，我将使用3毫升的注射器。我选用鲁尔锁头式注射器，以确保针头不会脱落，因为乳剂可能非常黏稠，难以注射。至于针头，我会尽量选用最细的型号，只要能让乳剂顺利通过即可。我发现20 mL的3G注射器用于这种乳剂已经足够。对于更粘稠的乳剂，可能需要使用更大的注射器。现在我们的操作方式是：一人固定大鼠，另一人进行注射。为了确保最大程度的安全，即使这些大鼠非常温顺且已习惯被人抓握，抓持大鼠的人员仍需佩戴防啮齿类动物牙齿咬穿的手套，以确保绝对安全，避免被大鼠咬伤。我将所有乳剂装入一支玻璃注射器中，然后将空的玻璃注射器从连接桥上断开。在此位置，我换上一支带有螺口的3毫升塑料注射器。现在我转移的乳化液体积超过单次注射所需量。我将气泡推至前端。由于每次注射需要 200 µL，因此我在注射器中保留 300 µL。我断开连接桥，将针头安装到塑料注射器上，然后吸取液体以填充针头，并将推杆推至200微升处，这样可确保针头内无气泡。现在我们已准备好进行注射。因此，我们需要确保大鼠不会移动。我们抓住大鼠，用一只手的一根手指放在肩部上方，另一根手指放在肩部下方，然后用另一只手固定后肢和尾巴，在此处的 flank 部位注射若干微升，再在另一侧 flank 注射若干微升。上周，我使用含有 KLH 作为抗原的乳剂对大鼠进行了免疫。今天，我将在大鼠背部通过皮内注射的方式给予KLH（我的抗原）和卵清蛋白（一种相关抗原）进行免疫刺激。但在此之前，我需要先将大鼠背部的毛发剃除，以便进行皮内注射。我使用的是普通的电动剃须刀。是的，我在每只大鼠之间都会更换针头，以确保针头不会变钝。这使得皮内注射变得容易得多，尤其是当我需要注射每种抗原20微升的小体积时。我已经将两种抗原注射到了所有大鼠体内，接下来会让它们在笼子中留置至明天。明天我们将能够观察到炎症反应。因此，注射部位会出现红肿，我们可以通过测量炎症部位的直径来评估炎症程度。昨天，我通过皮内注射的方式，在大鼠背部注射了相关抗原KLH和无关抗原牛血清白蛋白（albumin）。现在过了24小时，我将观察这些大鼠，检查是否出现了炎症反应。因此，我预期仅在KLH注射部位出现炎症，炎症将表现为红肿和肿胀。在观察到炎症后，我将通过直接测量炎症区域的直径来评估其范围。此处为KLH注射部位，可以明显看到存在显著的炎症反应。与正常皮肤相比，该部位非常红且肿胀。现在我们再观察注射白蛋白的另一部位，可以看到此处的注射点，但并无明显红肿。因此阴性对照是有效的。现在我将测量炎症部位的大小。为此，我将使用一把普通的直尺，并以毫米为单位进行测量。此处为6毫米，我再进行第二次测量。这个肿胀的直径为五毫米。红肿非常轻微，需要测量，但几乎只有一毫米。因此，我在这里向您展示的是如何用抗原制备乳剂，如何用该乳剂对大鼠进行免疫，然后在一周后使用用于免疫的抗原以及相关抗原进行攻击，以及如何在使用部位和Chan实验室中观察并测量炎症程度。我们经常使用该技术作为一种简单的检测方法，以测定钾离子通道阻断剂对大鼠炎症的影响。

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