大鼠主动迟发型超敏反应（DTH）的诱导与监测

您好，我是Christine Beaton。我在加州大学欧文分校生理学与生物物理学系的George Chandy实验室工作。今天我将向您演示如何在大鼠中诱导主动迟发型超敏反应（DTH）。

为此，我将制备一种乳剂，其中包含作为抗原的KLH和弗氏佐剂。随后，我将该乳剂注射到Lewis大鼠尾根部，以诱导大鼠产生针对KLH的免疫反应。一周后，我将用KLH对大鼠进行攻击，并通过测量肿胀程度来评估迟发型超敏反应（DTH）。

这是攻击位点，我们在实验室中利用该位点来观察PO通道阻滞剂对诸如迟发型超敏反应（DTH）等炎症反应的影响。以下是我将用于制备乳剂的不完全弗氏佐剂，我也可以使用完全弗氏佐剂。

这是KLH的石英，它是我今天使用的抗原，我这里有一份浓度为每毫升2毫克的溶液。在PBS中，我将使用这个5毫升的注射器取出不完全佐剂，并将其转移到一个15毫升的离心管中。然后，我将把该管放在涡旋振荡器上，在涡旋的同时，将我的抗原一滴一滴地加入佐剂中。

然后我将涡旋混合5分钟。之后，我将用该混合物填充这支5 mL玻璃注射器，必须使用玻璃注射器，因为佐剂容易腐蚀塑料。我们发现5 mL注射器最适合制备乳剂。

过小或过大效果都不好。当我将混合物吸入注射器后，我会使用这个金属连接桥，将这支玻璃注射器与另一支5毫升的玻璃注射器连接起来。然后，我将对注射器施加压力，使混合物尽可能快速地在两支注射器之间来回转移，直到混合物变得非常坚硬，即乳剂完全硬化，此时即可用于注射。

因此，我将加入2.5 ml的佐剂。首先注入空气，以便更顺利地将佐剂完全排出，然后将全部佐剂加入试管中。接下来，我将取2.5 ml该混合物，并在涡旋振荡器上进行混匀。

由于我取了2.5毫升的佐剂，因此我也会取2.5毫升的KLH。当我一滴一滴加入时，你会看到混合物的颜色发生变化，逐渐变白。现在我已经将全部抗原加入到了佐剂中。

接下来，我将把混合物涡旋振荡5分钟。但由于我不希望一直用手拿着离心管5分钟，因此我会将其用胶带固定在涡旋振荡器上。目的是在管内产生涡旋，但速度不宜过快，以免液体溢出。我将保持此状态5分钟。

五分钟后，我将停止涡旋，此时混合物呈白色。我取出离心管。哎呀。

此时混合物已完全呈白色，但仍然较为稀薄。为了使混合物更利于注射，我将把全部混合物转移至一支5毫升玻璃注射器中。

这些注射器已经过高压灭菌。我将一支完整的注射器连接到桥接装置上，而另一支注射器则仅连接其筒身。

我将活塞留在外面，然后将混合液倒入上方的注射器中。接着，我会将所有液体转移至下方的注射器。之后，我需要推动此处存在的气泡，将其排出。

因此，我将断开顶部的注射器，并推动气泡。气泡很难看到，但就在这里。因此，我推动气泡。

我还会将其从桥接处推出，然后重新连接顶部的注射器。确保所有连接处都紧密无漏后，我将把混合物从一个注射器推入另一个注射器。起初操作较为容易，但很快混合物会变得难以推动。

因此，随着时间推移，今晚的操作变得越来越困难，我不想破坏乳剂层，所以我只是转动我的注射器。有时所需时间更长，这因不同乳剂而异。

这可能取决于温度和湿度水平。但我想我的乳剂已经准备好了，它比我刚倒入时要浓稠得多。

它完全呈白色，且仅有一相。乙酸环己胺（ACO）相与油相绝不应出现分层现象。

现在可以进行注射了。此时浸泡液已准备好用于注射。注射时，我将每个笼舍注射 200 µL。

为此，我将使用3毫升的注射器。我选用鲁尔锁头式注射器，以确保针头不会脱落，因为乳剂可能非常黏稠，难以注射。至于针头，我会尽量选用最细的型号，只要能让乳剂顺利通过即可。

我发现20 mL的3G注射器用于这种乳剂已经足够。对于更粘稠的乳剂，可能需要使用更大的注射器。现在我们的操作方式是：一人固定大鼠，另一人进行注射。

为了确保最大程度的安全，即使这些大鼠非常温顺且已习惯被人抓握，抓持大鼠的人员仍需佩戴防啮齿类动物牙齿咬穿的手套，以确保绝对安全，避免被大鼠咬伤。我将所有乳剂装入一支玻璃注射器中，然后将空的玻璃注射器从连接桥上断开。在此位置，我换上一支带有螺口的3毫升塑料注射器。

现在我转移的乳化液体积超过单次注射所需量。我将气泡推至前端。由于每次注射需要 200 µL，因此我在注射器中保留 300 µL。

我断开连接桥，将针头安装到塑料注射器上，然后吸取液体以填充针头，并将推杆推至200微升处，这样可确保针头内无气泡。现在我们已准备好进行注射。

因此，我们需要确保大鼠不会移动。我们抓住大鼠，用一只手的一根手指放在肩部上方，另一根手指放在肩部下方，然后用另一只手固定后肢和尾巴，在此处的 flank 部位注射若干微升，再在另一侧 flank 注射若干微升。上周，我使用含有 KLH 作为抗原的乳剂对大鼠进行了免疫。

今天，我将在大鼠背部通过皮内注射的方式给予KLH（我的抗原）和卵清蛋白（一种相关抗原）进行免疫刺激。但在此之前，我需要先将大鼠背部的毛发剃除，以便进行皮内注射。我使用的是普通的电动剃须刀。是的，我在每只大鼠之间都会更换针头，以确保针头不会变钝。

这使得皮内注射变得容易得多，尤其是当我需要注射每种抗原20微升的小体积时。我已经将两种抗原注射到了所有大鼠体内，接下来会让它们在笼子中留置至明天。明天我们将能够观察到炎症反应。

因此，注射部位会出现红肿，我们可以通过测量炎症部位的直径来评估炎症程度。昨天，我通过皮内注射的方式，在大鼠背部注射了相关抗原KLH和无关抗原牛血清白蛋白（albumin）。现在过了24小时，我将观察这些大鼠，检查是否出现了炎症反应。

因此，我预期仅在KLH注射部位出现炎症，炎症将表现为红肿和肿胀。在观察到炎症后，我将通过直接测量炎症区域的直径来评估其范围。此处为KLH注射部位，可以明显看到存在显著的炎症反应。

与正常皮肤相比，该部位非常红且肿胀。现在我们再观察注射白蛋白的另一部位，可以看到此处的注射点，但并无明显红肿。因此阴性对照是有效的。

现在我将测量炎症部位的大小。为此，我将使用一把普通的直尺，并以毫米为单位进行测量。此处为6毫米，我再进行第二次测量。

这个肿胀的直径为五毫米。红肿非常轻微，需要测量，但几乎只有一毫米。因此，我在这里向您展示的是如何用抗原制备乳剂，如何用该乳剂对大鼠进行免疫，然后在一周后使用用于免疫的抗原以及相关抗原进行攻击，以及如何在使用部位和Chan实验室中观察并测量炎症程度。

我们经常使用该技术作为一种简单的检测方法，以测定钾离子通道阻断剂对大鼠炎症的影响。