Name: Nucleofection和胚胎小鼠海马和皮层神经元的原代培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 学习利用Nucleofection技术对小鼠胚胎海马和皮层神经元进行原代培养与转染的方法。该技术可维持荧光融合蛋白表达超过两个月，适用于研究轴突生长、突触发生及神经元发育过程中的蛋白质动态定位。

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所有实验程序均经威斯康星大学动物护理委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。我们感谢Katherine Kalil博士慷慨提供Nucleofector设备的使用。同时感谢Dent实验室成员对本实验方案提出的建议。本研究工作得到了NIH R01-NS064014基金、Dana基金会和Whitehall基金会对E.W.D.的资助支持。
Christopher Viesselmann、Jason Ballweg 和 Derek Lumbard 对本论文贡献相同。

1. 盖玻片和培养腔的制备
<ol>
<li>清洁盖玻片和培养腔的制备对于获得健康的细胞培养至关重要，这些步骤中的任何捷径都不应采取。</li>
<li>将盖玻片（12 mm 或 22 mm 圆形，德国玻璃 — Carolina Assistant 品牌）在专用玻璃瓶或烧杯中的浓硝酸（HNO₃）中浸泡过夜。</li>
<li>将盖玻片从硝酸中取出，并用去离子水彻底冲洗 5 至 7 次。</li>
<li>将盖玻片分开，并在层流罩或生物安全柜中干燥。干燥后，用紫外光照射 30 分钟进行灭菌。将灭菌后的盖玻片放入无菌培养皿中储存。若需将神经元直接接种于 12 mm 盖玻片上，则将盖玻片置于无菌 35 mm 培养皿中，并进入第 2 节操作。</li>
<li>通过在 35 mm 培养皿底部钻一个 15 mm 的孔（去除所有毛刺），并用石蜡与凡士林按 3:1 比例混合的封固剂将清洁的盖玻片密封，从而构建成像腔室。</li>
<li>在沸水浴中将锥形管内的石蜡/凡士林混合物融化。使用小号画笔，在培养皿底部围绕 15 mm 孔的区域均匀涂布。注意持续搅拌混合物，以防其分层。若混合物分离，会导致封固时凡士林浓度过高，当培养皿放入培养箱后会变得黏稠，从而引起盖玻片脱落。剩余的石蜡/凡士林混合物可在室温下保存。</li>
<li>将培养皿倒置放在平坦托盘上，将盖玻片覆盖在孔上。放入 80°C 烤箱中加热至石蜡混合物完全融化（约 10 分钟）。取出后平放，使石蜡混合物凝固。</li>
<li>将培养皿翻转过来，用紫外光对盖玻片内表面及腔室底部进行灭菌。</li>
<li>用 1.0 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（30 kDa）溶于硼酸盐缓冲液（0.1 M 硼酸钠，pH 8.5）中，在盖玻片或腔室的玻璃区域包被 1 小时。随后用大量组织培养级去离子水冲洗 3 至 5 次，确保完全去除硼酸盐缓冲液残留。干燥后立即使用，或储存腔室/盖玻片以备后续使用。我们通常在盖玻片制备后一个月内使用。</li>
</ol>
2. 神经元分离与培养基的制备
<ol>
<li>通过向组织培养级水中加入适量的10倍浓度HBSS和100倍浓度HEPES来配制解剖培养基（DM）。4°C保存。解剖过程中保持在冰上。</li>
<li>解剖前一天配制铺板培养基（PM）和无血清培养基（SFM）。PM由Neurobasal培养基、B27添加剂、2 mM谷氨酰胺、0.3%葡萄糖、37.5 mM NaCl和5%胎牛血清（FBS）组成。SFM由Neurobasal培养基、B27添加剂、2 mM谷氨酰胺、0.3%葡萄糖和37.5 mM NaCl组成。</li>
<li>仅配制解剖所需量，并将培养基瓶盖稍拧松，置于组织培养孵箱中过夜，使培养基的温度和CO2含量达到平衡。我们额外添加葡萄糖，并通过NaCl将渗透压调节至约310 mOsm。我们发现，在更接近生理状态的渗透压下（Neurobasal培养基的渗透压通常为205–245 mOsm），细胞培养效果更佳。</li>
</ol>
3. 长期培养用皮质胶质细胞饲养层的制备
<ol>
<li>若需制备长期培养物，应在进行皮层或海马组织分离前两到三周完成本步骤。</li>
<li>配制胶质细胞培养基（GM），包含 MEM、0.3% 葡萄糖、青霉素/链霉素和 10% 马血清。</li>
<li>将 P1-P3 小鼠幼崽置于冰上冷却 5 分钟以实施安乐死。将每只幼崽从冰上取出后，喷洒 70% 乙醇。用剪刀迅速断头。将完整脑组织移至含有冷 DM（步骤 2.1）的培养皿中。</li>
<li>去除两个大脑半球及脑膜。切除新皮层并转移至不含培养基的新培养皿中。共制备4个脑组织的新皮层。</li>
<li>用干净且无菌的剃刀刀片将皮层尽可能切碎，然后用塑料移液管将切碎的组织转移至含有12 mL冷DM的50 mL锥形管中。加入胰蛋白酶和DNase，使其终浓度分别为0.25%（1.5 mL）和0.1%（1.5 mL）。在37°C水浴中孵育 37°C 水浴10分钟，期间间歇性摇动。</li>
<li>将装有皮质组织的离心管取出，在移入组织培养操作台前用70%乙醇彻底清洁。用10 mL移液器反复吹打皮质组织约10–15次，或直至大部分组织块消失。</li>
<li>将试管放回 37°C 在水浴中再孵育10分钟，期间间歇性轻轻摇晃。</li>
<li>用70%乙醇彻底清洗试管，并将其放回组织培养操作台。用5 mL移液器将皮质组织上下吹打约10–15次，直至组织块消失。</li>
<li>加入15 mL预热的GM，以200×g（1000 rpm）离心10分钟。</li>
<li>弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于 20 mL 新鲜 GM 中，用血细胞计数板计数。接种 5–7.5×106 每75 cm²加入15 mL GM培养基的细胞2 烧瓶</li>
<li>培养一天后，以及此后每2-3天，通过轻敲培养瓶使其与手掌碰撞以松动未贴壁细胞。吸除培养基及脱落的细胞，并更换为15 mL新鲜生长培养基（GM）。</li>
<li>当培养瓶中的胶质细胞生长 1-2 周并达到约 70–100% 汇合度时，即可收获。为制备单个胶质细胞包被的盖玻片，将 6 片经硝酸清洗并灭菌的 25 mm 圆形盖玻片放入 10 cm 培养皿中，用小号画笔在每片盖玻片上以三角形排列方式滴加 3 滴石蜡/凡士林（3:1）混合物。将敞开的培养皿用紫外光照射处理 30 分钟。随后在硼酸盐缓冲液中加入 0.1 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（30 kDa），包被盖玻片 1 小时，然后用无菌组织培养级去离子水充分洗涤（3–5 次），晾干备用。</li>
<li>从培养箱中取出含胶质细胞的培养瓶，弃去培养基，用 5 mL 预热的胰蛋白酶/EDTA 溶液冲洗。移除胰蛋白酶/EDTA 溶液，再用移液器向培养瓶中加入 3 mL 新鲜预热的胰蛋白酶/EDTA 溶液。将培养瓶于 37°C 孵育 1 分钟 37°C 加入5 mL生长培养基以终止消化反应。</li>
<li>通过反复吹打10–15次将胶质细胞从培养瓶中吹下，随后将培养基转移至15 mL离心管中。在200×g（1000 rpm）下离心8分钟。弃去上清液，加入10 mL GM培养基，计数细胞后接种5×10⁵个细胞5 每10 cm培养皿中加入12.5 mL GM培养基，内含盖玻片上的细胞。</li>
<li>每2-3天更换一次新鲜的预热生长培养基（GM）。在神经元解剖前一天，移除GM并替换为无血清培养基（SFM）（见第2.2节）。在第4.12步对皮层或海马神经元培养物进行灌注时，使用此胶质细胞条件化SFM。</li>
</ol>
4. 皮层和/或海马解剖与电穿孔
<ol>
<li>取出适量的核转染溶液（Lonza），混合后在开始解剖前升温至室温。由于核转染溶液混合后有效期有限，我们仅针对每次制备配制所需用量（每次转染使用100 μL）。</li>
<li>使用CO2处死E15.5阶段的怀孕小鼠（以发现阴栓当天记为E0.5），将子宫取出并置于10 cm培养皿中。取出胎鼠，去头后放入冷DM溶液中（见第2.1节）。</li>
<li>将整个大脑取出并放入另一盛有冷DM的培养皿中，用弯头钨针分离两侧新皮层。用显微镊去除脑膜，将皮层组织转移至新的冷DM培养皿中。使用小型虹膜剪或Wecker剪分离皮层或海马组织，并将其放入已装有1.0 mL冷DM的1.5 mL离心管中。将该离心管置于冰上保存。</li>
<li>在完成所有皮层或海马组织的解剖后，向含有组织的离心管中加入110 μL 2.5%胰蛋白酶溶液，并将离心管置于37°C培养箱中孵育20分钟。</li>
<li>去除上清液，用1.0 mL PM溶液（见第2.2节）轻轻颠倒离心管以洗涤皮层或海马组织。重复洗涤两次，每次洗涤后在管中保留1 mL PM溶液。</li>
<li>使用P1000移液器将组织块吹打15次，将上清液/细胞转移至含有4 mL PM的新15 mL锥形管中，离心管中残留的未分散组织块弃去。</li>
<li>将15 mL离心管在20×g（350 rpm）条件下离心7分钟（关闭刹车）。弃去上清液，为每次转染加入100 μL预混并已平衡至室温的核转染溶液（Lonza）。用P1000移液器轻柔吹打5次使细胞重悬。</li>
<li>将100 μL核转染溶液/细胞混合物转移至新的1.5 mL离心管中，并加入适量DNA。对于长期培养，我们通常每转染使用1–2 μg DNA，但这仅能标记培养物中少量（<10%）的神经元。若需在短期培养中获得更高的转染效率，我们通常每转染使用5–10 μg DNA。当使用两种不同质粒共转染时，我们最多使用总量达40 μg的DNA。质粒储存于TE缓冲液中，浓度为1 μg/μL。</li>
<li>将细胞悬液/DNA混合物加入电转杯（Lonza）中，使用Nucleofector（Lonza）仪器并选择程序O-005（小鼠中枢神经系统神经元）进行电穿孔。</li>
<li>迅速操作，向电转杯中加入500 μL预热并已平衡的PM溶液，将溶液/细胞转移至新的1.5 mL离心管中。补加PM溶液使每次转染总体积达到1.0 mL。使用血细胞计数板计数细胞，并以3–5×103 个细胞/cm2密度接种用于短期培养，或以5–10×103 个细胞/cm2密度接种用于长期培养。</li>
<li>对于短期培养，在接种1小时后，向35 mm培养皿中加入2.0 mL预热并经CO2平衡的无血清培养基（SFM）。若使用盖玻片，我们先移除一半PM溶液，替换为SFM，再重复此步骤两次。无论是直接向成像培养皿中加满培养基，还是对盖玻片进行洗涤，最终均使培养体系中血清含量极低（<0.5%）。短期培养无需使用胶质细胞饲养层，也无需更换培养基。</li>
<li>对于长期培养，在初次接种1小时后，将一个覆盖有胶质细胞且带有三滴石蜡/凡士林的盖玻片翻转，覆盖在35 mm培养皿的15 mm孔上。随后向成像培养皿中加入2 mL来自胶质细胞培养皿的条件化SFM。为维持长期培养，每2–3天更换三分之一的SFM，并补充新鲜的、预热且经CO2平衡的SFM。</li>
</ol> 
5. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="神经元发育阶段，EGFP-Tubulin DsRed2 荧光显微镜图像，示意图，细胞过程" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 海马神经元在发育连续阶段的活细胞图像。 代表性活体海马神经元的成对图像分别显示为微分干涉相差图像及相应的荧光显微照片。这些细胞均使用含EGFP-Tubulin和DsRed2的pCAX载体进行转染。神经元在以下时间点进行成像 体外 （体外培养天数）：第1阶段（1DIV）、第2阶段（1DIV）、第3阶段（2DIV）、第4阶段（11DIV）和第5阶段（32DIV）。比例尺为 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本实验方案用于培养胚胎期小鼠海马和皮层神经元，是在Banker方案基础上改进而来，原始Banker方案使用大鼠神经元1,2。我们亦已将该方案成功应用于小鼠和仓鼠神经元的培养3,4,5,6,7。该方案对海马神经元和新皮层神经元均具有良好的培养效果，且与Meberg和Miller发表的某一方案相似8。通常情况下，我们选择海马神经元进行长期培养，因其特性明确，是更为成熟和广泛应用的模型系统。此外，海马神经元群体可能比新皮层神经元更为均一。然而，采用本方案培养的新皮层神经元同样能够良好存活并正常分化（未发表数据）。我们常规使用海马和新皮层神经元进行短期培养。此外，新皮层解剖所获得的神经元数量显著多于海马组织（每对皮层可获得约1.5×106个神经元，而每对海马仅获得约2.5×105个神经元），因此在进行如Western blot等需要较多材料的实验时，新皮层是更优的组织来源。
与任何原代培养一样，必须尽量缩短从动物死亡到细胞接种之间的时间。通常需要进行10至20次解剖操作，才能熟练掌握快速解剖和接种技术。此外，使用Lonza Nucleofector进行电穿孔时，操作必须迅速，因为神经元若在核转染缓冲液中停留过久，其活力会迅速下降。
我们的成像工作大部分采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行。这种显微镜技术仅能对盖玻片表面以下几百纳米范围内的结构进行成像。因此，我们经常观察的神经元区域，如轴突生长锥和树突棘，必须直接贴附在盖玻片上。为此，我们使用低密度培养体系，这种体系需要胶质细胞作为饲养层以维持长期培养。我们也曾尝试使用较高密度的培养（>2×104 个细胞/cm2），不添加胶质饲养层，发现这些神经元在较少换液的情况下仍能很好地存活。然而，这些神经元的树突棘通常距离基质过远，无法通过TIRFM进行有效成像，尽管它们可以很容易地通过宽场显微镜或共聚焦显微镜检测到。
在大多数研究中，我们在铺板前对神经元进行转染，并在培养中对荧光标记蛋白进行了长达三个月的成像观察。这种长期表达荧光标记蛋白的结果使我们确信，使用低浓度DNA（1–2 μg）不会在神经元中产生过表达相关的人为假象。然而，若使用高量DNA（10–20 μg），该方法也可用于研究蛋白的过表达。我们用于转染神经元的质粒通常包含EGFP或mCherry融合蛋白，尽管我们也单独使用DsRed2或EGFP标记神经元胞质。该电穿孔技术适用于多种载体。由于表达水平相对较高，且在短期和长期培养中神经元对该类质粒耐受性良好，我们更倾向于使用含有β-actin启动子、CMV增强子以及β-globin多聚腺苷酸尾的质粒（如pCAGGs或pCAX质粒）9。通常，蛋白在铺板后约4小时开始表达，并在10–24小时内达到可用于成像的水平10。我们已在短期培养中成功使用由CMV启动子驱动的质粒，但发现其可能导致高水平的过表达，从而在长期培养中引起神经元死亡。尽管如此，我们发现与高密度（非胶质细胞滋养）培养相比，低密度培养中胶质细胞的条件化处理有助于提高转染了CMV启动子驱动质粒的神经元的存活率。

<table><tbody><tr><td>硼砂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93356</td><td>将硼酸盐缓冲液在室温（RT）下保存。</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886-100mg</td><td>溶于0.1 M 硼酸盐缓冲液中。经无菌滤器过滤后，分装并储存在-80℃&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（10倍浓缩液）</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>DNase（10倍浓度）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095-080</td><td>4°C 下保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>HBSS（10倍浓度）</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>HEPES（100倍浓缩液）</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>4°C 下保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hyclone</td><td>SH3007403</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>4°C 下保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Neurobasal E (NB)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>4°C 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>B27添加剂（50倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>谷氨酰胺（100倍）</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>将分装样品于 -80 保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>NB 中的 30% 葡萄糖（100 倍浓缩液）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td>将葡萄糖溶解于NB中并进行无菌过滤。4 ℃保存。&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>NB 中的 3.75 M NaCl（100 倍浓缩液）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>将 NaCl 溶解于 NB 中并进行无菌过滤。4 ℃ 保存。&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td>将分装样品储存在 -80&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>石蜡/凡士林（3:1，质量比）</td><td>Fisher Scientific</td><td>石蜡 &amp;#8211; P31-500 石油 &amp;#8211; P66-1</td><td>在锥形管中混合，并于沸水中熔化。</td></tr><tr><td>浓硝酸（HNO₃）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A509-212</td><td>室温保存。可重复使用数次。若变黄则弃用。</td></tr><tr><td>5 mM 胞嘧啶 &amp;#8211;盐酸阿糖胞苷（AraC）在NB中（1000倍浓缩）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645</td><td>将AraC溶解于NB中，经无菌滤膜过滤，于-80℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_conent&quot;&gt;我们储存于 -80 的大多数试剂&amp;#x00B0;C 可在 -20 保存&amp;#x00B0;C 也是如此。在 -80 保存&amp;#x00B0;C 延长了其保质期，并使培养物更加稳定一致。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

海马和皮层神经元已被广泛用于研究中枢神经系统（CNS）神经元的极化、轴突/树突的生长以及突触的形成与功能。培养这些神经元的一个优势在于，它们能够在二维基质上以极低密度迅速建立极性，形成形态分明的轴突和树突。这一特性使其在揭示神经元发育多个方面的机制中极为有用。此外，通过为这些神经元提供胶质细胞条件化培养环境，它们能够持续发育，形成具有功能的突触连接，并在体外存活数月。本实验方案中，我们描述了一种分离、培养和转染胚胎小鼠海马及皮层神经元的技术。转染通过核转染法（nucleofection）在铺板前对神经元进行电穿孔导入DNA来实现。该方法的优势在于可在神经元发育早期（铺板后约4–8小时）即表达荧光标记的融合蛋白，从而研究蛋白质在极化、轴突发育及分支过程中的动态变化与功能。我们还发现，在铺板前进行一次转染即可在整个神经元生命周期内维持荧光标记融合蛋白的表达水平，足以满足成像需求。&gt; 培养2个月）。因此，该方法可用于研究中枢神经系统发育过程中蛋白质的定位与功能，且对神经元功能的干扰极小或几乎没有。

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。

海马和皮层神经元已被广泛用于研究中枢神经系统（CNS）神经元的极化、轴突/树突发育以及……

海马和皮层神经元已被广泛用于研究中枢神经系统神经元的极化、轴突和树突发育以及突触的形成与功能。培养这些神经元的优势在于，在极低密度的二维基质上，它们能够 readily 发生极化，形成形态 distinct 的轴突和树突。本视频演示了一种分离、培养和转染胚胎期小鼠海马及皮层神经元的技术，该方法通过核转染（nucleofection）实现，可在神经元发育早期（铺板后约4至8小时）即启动荧光标记融合蛋白的表达，并且荧光标记蛋白的表达可在培养神经元中持续维持超过两个月。该技术使得研究人员能够研究蛋白质在早期发育事件（如轴突发育）以及后期事件（如突触形成和突触可塑性）中的功能。首先从出生后第1至第3天的小鼠大脑皮层半球中分离胶质细胞，并将其接种于培养瓶中。当胶质细胞融合度达到70%至100%时，再将其重新接种至玻璃盖玻片上。随后，从 E 15.5 小鼠中分离海马或皮层神经元，并通过核转染法将编码荧光融合蛋白（如红色荧光蛋白）的质粒转入神经元。转染后的神经元接种于成像培养皿中，用于短期研究。对于长期培养，将带有胶质细胞的玻璃盖玻片倒置于海马或皮层神经元培养物上，以提供营养支持，随后可对单个神经元进行成像，以显示融合蛋白在神经元轴突或树突中的动态定位。大家好，我是埃里克·登特（Eric Dent），威斯康星大学麦迪逊分校的解剖学助理教授。今天，我的三名本科生——克里斯·韦泽尔曼（Chris Wezelman）、杰森·布韦（Jason Bwe）和德里克·隆巴德（Derek Lombard）——将演示一种分离、接种并维持皮层和海马神经元短期与长期培养的操作方法。这些神经元培养物可用于研究神经元发育过程中荧光融合蛋白的动态变化，涵盖从最初的神经突生长，到轴突和树突发育，直至突触形成的各个阶段。为准备成像用的腔室，需使用小鼠胚胎海马和皮层神经元。从底部钻有15毫米孔且已去除所有毛刺的35毫米培养皿开始。将石蜡与凡士林按3:1比例混合，置于锥形管中，通过放入沸水浴中加热使其熔化。然后使用小号画笔涂抹培养皿底部小孔周围的区域。注意在各孔之间搅拌石蜡-凡士林混合物，因为该混合物会分层。将盖玻片覆盖在小孔上。所有培养皿制备完成后，将其放入80摄氏度的烘箱中，直至石蜡混合物完全融化，大约需要10分钟。随后将培养皿取出并置于平坦表面上，让石蜡混合物静置至少一分钟，使其凝固。将培养皿倒置并置于通风橱下。打开紫外灯照射30分钟，以对皿盖内侧和培养室底部进行灭菌。接下来进行包被。将盖玻片置于含多聚赖氨酸（poly D-lysine）的培养 chamber 中孵育一小时。随后，用无菌滤过去离子水彻底冲洗包被后的盖玻片三至五次，以去除残留的硼酸缓冲液。最后一次冲洗后，使用真空泵干燥 chamber。这些盖玻片可立即使用，或存放于组织培养室中以备后续使用。包被的培养腔应在制备后一周内使用，以便进行长期培养。皮质胶质细胞饲养层需在继续进行皮质或海马解剖前两至三周开始制备。将四只出生后1至3天（P1–P3）小鼠的脑组织置于含有冷解剖液的培养皿中，并将其放置于解剖显微镜下。去除嗅球、两个大脑半球以及脑膜。将半球转移至一个不含培养基的新培养皿中。使用干净无菌的剃刀刀片，将皮层尽可能切碎。然后用塑料移液管将切碎的组织转移至含有12毫升冷解离液的50毫升锥形管中。加入胰蛋白酶和DNase，使其终浓度分别为0.25%和0.1%。在37°C水浴中孵育10分钟，期间间歇性轻轻旋转混匀。孵育结束后，将离心管从水浴中取出，在移入组织培养超净台前用70%乙醇彻底清洁管壁。用移液器反复吹打皮质组织。用10毫升移液管吹打约10至15次，或直至大部分组织块消失，将试管放回水浴中继续孵育10分钟，并间歇轻轻摇动。再次用70%乙醇彻底清洁试管，并将其移回组织培养操作台。用移液器将皮层组织上下吹打。与之前相同，使用5毫升移液器加入15毫升预热的胶质细胞培养基，于1000 RPM离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于20毫升新鲜胶质细胞培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后将500万至750万个细胞接种于每75平方厘米培养瓶中含15毫升胶质细胞培养基的培养液中。接种后，将细胞置于37°C培养箱中培养，从第一天开始，此后每两到三天轻轻敲击培养瓶外壁，使松动的细胞脱离培养瓶表面。吸除培养基以及任何脱落的细胞，并更换为15毫升新鲜胶质细胞培养基。当培养瓶中的胶质细胞生长1至2周并即将达到100%汇合时，即可收获胶质细胞。为制备单个胶质细胞包被的盖玻片，首先将六片经硝酸清洗并灭菌处理的盖玻片放入培养皿中。在10厘米培养皿中放入25毫米圆形盖玻片，用小号画笔在每张盖玻片上以等边三角形排列方式放置三滴石蜡与凡士林3:1的混合物。在盖玻片边缘处再放置两滴，用于将盖玻片固定在培养皿上。将敞口培养皿用紫外光照射处理30分钟。将盖玻片用聚-D-赖氨酸包被1小时，然后用无菌滤过去离子水充分洗涤3至5次，晾干后从培养箱中取出胶质细胞。弃去培养基，用五毫升预热的胰蛋白酶洗涤。向培养瓶中加入三毫升胰蛋白酶，在37摄氏度孵育一分钟。待细胞脱落后，加入五毫升胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用。用移液器上下吹打10至15次，从烧瓶中移除GL。然后将培养基转移至15毫升锥形管中，在1000 RPM条件下离心8分钟。离心结束后，将细胞重悬于10毫升胶质细胞培养基中。然后，将细胞计数后以每10厘米培养皿中12.5毫升胶质细胞培养基接种5 × 10⁵个细胞，培养基中含盖玻片。每两到三天更换一次新鲜预温的胶质细胞培养基，在神经元解剖前一天进行换液。移除胶质细胞培养基，并替换为无血清培养基。稍后使用此胶质细胞条件培养基。在灌注皮层或海马神经元培养物时，加入 C 至终浓度为 5 µM。为防止胶质细胞增殖，按照制造商说明书推荐的量加入核转染试剂进行转染，然后将溶液升温至室温。将含有 E 15.5 小鼠脑的培养皿置于冰冷的解剖液中。在解剖显微镜下，使用弯头钨针去除两侧新皮质。然后用显微镊子去除软脑膜，并将皮质组织转移至另一含有冰冷解剖液的新培养皿中。使用小型虹膜剪刀沿大脑半球内侧可见海马和皮层。小心地去除海马，随后去除剩余的皮层。对整窝小鼠的脑组织重复进行解剖操作。将海马体皮层分别放入装有1毫升冰冷解剖液的独立1.5毫升微量离心管中。在完成所有海马体皮层的解剖后，将离心管置于冰上。向含有组织的微量离心管中加入 110 微升 2.5% 胰蛋白酶，将试管置于 37 摄氏度培养箱中孵育 20 分钟。使用 P1000 移液器尽可能吸除管中的液体。然后向每根试管中加入 1 毫升铺板培养基，通过轻轻倒置微量离心管来洗涤组织。重复洗涤两次。最后一次洗涤后，加入1毫升铺板培养基。使用P1000移液器将组织块吹打15次。然后将上清液和细胞转移至一个新的15毫升锥形管中，该锥形管内含有4毫升铺板培养基，留下微离心管中残留的组织块。将15毫升离心管以350转/分钟离心7分钟，离心结束后关闭刹车，弃去上清液，每管加入100微升预混的室温核转染溶液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。随后，将100微升核转染溶液与细胞混合物转移至各新的微量离心管中，每管含有适量DNA（每次转染1至2微克DNA）；对于长期培养，标记的神经元将少于培养物中神经元总数的10%。虽然每次转染加入 5 至 10 微克 DNA 可提高培养物的转染效率，但需将细胞悬液与 DNA 混合物加入电穿孔小室中。然后将小室放入电穿孔仪内。对于小鼠中枢神经系统神经元，将核转染仪程序设置为 oh 0 0 5。操作需迅速，向小室中加入 500 微升预热并平衡过的铺板培养基，然后将细胞悬液转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。加入足够的铺板培养基，使每次转染体系的总体积达到一毫升。细胞计数后，对于短期培养，每平方厘米接种三至五乘以十的三次方个细胞；对于长期培养，每平方厘米接种五至十乘以十的三次方个细胞，通常为五乘以十的五次方或一乘以十的六次方个细胞用于每次转染，以制备短期培养的细胞。接种后一小时，用两毫升温热的、经二氧化碳平衡的无血清培养基淹没35毫米的培养皿。成像用培养腔室中的血清含量极低，低于0.5%。短期培养无需使用胶质细胞饲养层，也无需重新铺板。制备长期培养时，向无血清培养基中加入一毫升胶质细胞条件培养基。取一个覆盖有甘油明胶的盖玻片，其上含有三个石蜡凡士林液滴，将其倒置覆盖在35 mm培养皿的15 mm孔上。然后加入1 mL培养基以维持长期培养。每两到三天更换三分之一的无血清培养基。培养 5 至 7 天后，加入阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）至终浓度为 5 µM，以抑制胶质细胞增殖。以下为典型的活体海马神经元成对图像，分别显示微分干涉差（DIC）显微图像及其对应的荧光显微图像。这些细胞均已被转染了分别携带 EGFP、tubulin 和 DS Red2 的 PA 载体。在第一阶段，神经元最初会贴附于基质，并在大约一天的时间内，从细胞体周围伸出片状的板状伪足和指状的丝状伪足。在第二阶段，这些初始突起将分化为多个从细胞体发出的神经突，通常长度保持在30至50微米左右。在第三阶段，其中一个神经突会随机地开始快速延伸，最终发育成为轴突。其他神经突保持较短，被称为次要突起。大多数海马和皮层神经元在培养两到三天后进入第三阶段。在接下来的一到两周内，进入第四阶段，此时次要突起增粗、伸长并分支，发育成为树突，此处以绿色显示。与此同时，轴突在持续生长和分支的过程中逐渐变细，此过程持续约两到三周。在培养过程中，树突通过形成树突棘而发生分化，树突棘是沿树突分布的小型突起。第五阶段的神经元在形态和大小上会有所差异，但大多数神经元应经历这一系列发育阶段。如果蛋白过表达干扰了神经元发育，转染的神经元可能无法顺利完成这些阶段。此外，神经元可能不会经历全部发育阶段。如果盖玻片未彻底清洁或聚赖氨酸未能充分黏附，胶质细胞也可能大量增殖，尤其是在未使用C的情况下。这是一张两周龄培养物的相差显微图像，显示在长期培养中胶质细胞已过度生长并占据整个培养区域。更换培养基过于频繁或不够频繁都可能影响神经元的存活能力。这是一张相位差显微镜图像，显示培养物中大多数神经元已经死亡，残存的神经元胞体缩小，突起出现串珠样变性。作为对比，这是一张培养两周后健康海马神经元的相位差显微镜图像。请注意其较大的胞体以及突起无串珠样改变。此外，在此阶段，神经元的树突已增粗，并形成了大量复杂的轴突网络。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成整个胎鼠窝的胚胎分离、大脑皮层解剖、转染及接种。在进行该操作时，需特别注意，海马和皮层神经元对机械性损伤极为敏感。此外，在分离神经元的过程中，保持溶液尽可能低温非常重要，以维持较低的代谢活性。通过该方法处理后，还可进行其他实验，如活细胞成像和神经元活动的生理记录，以回答更多科学问题，例如目的荧光融合蛋白如何在神经元的不同区域分布。若蛋白定位与突触活性变化相关，或这些蛋白的功能如何受到不同药理学处理的影响。

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即用型冷冻神经元储备是评估突触功能的有力工具。本文介绍一种利用96孔板，从冷冻储备中建立简易低密度原代培养的方法。...

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