胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

海马和皮层神经元已被广泛用于研究中枢神经系统神经元的极化、轴突和树突发育以及突触的形成与功能。培养这些神经元的优势在于，在极低密度的二维基质上，它们能够 readily 发生极化，形成形态 distinct 的轴突和树突。本视频演示了一种分离、培养和转染胚胎期小鼠海马及皮层神经元的技术，该方法通过核转染（nucleofection）实现，可在神经元发育早期（铺板后约4至8小时）即启动荧光标记融合蛋白的表达，并且荧光标记蛋白的表达可在培养神经元中持续维持超过两个月。该技术使得研究人员能够研究蛋白质在早期发育事件（如轴突发育）以及后期事件（如突触形成和突触可塑性）中的功能。

首先从出生后第1至第3天的小鼠大脑皮层半球中分离胶质细胞，并将其接种于培养瓶中。当胶质细胞融合度达到70%至100%时，再将其重新接种至玻璃盖玻片上。

随后，从 E 15.5 小鼠中分离海马或皮层神经元，并通过核转染法将编码荧光融合蛋白（如红色荧光蛋白）的质粒转入神经元。转染后的神经元接种于成像培养皿中，用于短期研究。对于长期培养，将带有胶质细胞的玻璃盖玻片倒置于海马或皮层神经元培养物上，以提供营养支持，随后可对单个神经元进行成像，以显示融合蛋白在神经元轴突或树突中的动态定位。

大家好，我是埃里克·登特（Eric Dent），威斯康星大学麦迪逊分校的解剖学助理教授。今天，我的三名本科生——克里斯·韦泽尔曼（Chris Wezelman）、杰森·布韦（Jason Bwe）和德里克·隆巴德（Derek Lombard）——将演示一种分离、接种并维持皮层和海马神经元短期与长期培养的操作方法。这些神经元培养物可用于研究神经元发育过程中荧光融合蛋白的动态变化，涵盖从最初的神经突生长，到轴突和树突发育，直至突触形成的各个阶段。

为准备成像用的腔室，需使用小鼠胚胎海马和皮层神经元。从底部钻有15毫米孔且已去除所有毛刺的35毫米培养皿开始。将石蜡与凡士林按3:1比例混合，置于锥形管中，通过放入沸水浴中加热使其熔化。

然后使用小号画笔涂抹培养皿底部小孔周围的区域。注意在各孔之间搅拌石蜡-凡士林混合物，因为该混合物会分层。将盖玻片覆盖在小孔上。

所有培养皿制备完成后，将其放入80摄氏度的烘箱中，直至石蜡混合物完全融化，大约需要10分钟。随后将培养皿取出并置于平坦表面上，让石蜡混合物静置至少一分钟，使其凝固。

将培养皿倒置并置于通风橱下。打开紫外灯照射30分钟，以对皿盖内侧和培养室底部进行灭菌。接下来进行包被。

将盖玻片置于含多聚赖氨酸（poly D-lysine）的培养 chamber 中孵育一小时。随后，用无菌滤过去离子水彻底冲洗包被后的盖玻片三至五次，以去除残留的硼酸缓冲液。最后一次冲洗后，使用真空泵干燥 chamber。这些盖玻片可立即使用，或存放于组织培养室中以备后续使用。

包被的培养腔应在制备后一周内使用，以便进行长期培养。皮质胶质细胞饲养层需在继续进行皮质或海马解剖前两至三周开始制备。将四只出生后1至3天（P1–P3）小鼠的脑组织置于含有冷解剖液的培养皿中，并将其放置于解剖显微镜下。

去除嗅球、两个大脑半球以及脑膜。将半球转移至一个不含培养基的新培养皿中。使用干净无菌的剃刀刀片，将皮层尽可能切碎。

然后用塑料移液管将切碎的组织转移至含有12毫升冷解离液的50毫升锥形管中。加入胰蛋白酶和DNase，使其终浓度分别为0.25%和0.1%。在37°C水浴中孵育10分钟，期间间歇性轻轻旋转混匀。

孵育结束后，将离心管从水浴中取出，在移入组织培养超净台前用70%乙醇彻底清洁管壁。用移液器反复吹打皮质组织。

用10毫升移液管吹打约10至15次，或直至大部分组织块消失，将试管放回水浴中继续孵育10分钟，并间歇轻轻摇动。再次用70%乙醇彻底清洁试管，并将其移回组织培养操作台。

用移液器将皮层组织上下吹打。与之前相同，使用5毫升移液器加入15毫升预热的胶质细胞培养基，于1000 RPM离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于20毫升新鲜胶质细胞培养基中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后将500万至750万个细胞接种于每75平方厘米培养瓶中含15毫升胶质细胞培养基的培养液中。接种后，将细胞置于37°C培养箱中培养，从第一天开始，此后每两到三天轻轻敲击培养瓶外壁，使松动的细胞脱离培养瓶表面。

吸除培养基以及任何脱落的细胞，并更换为15毫升新鲜胶质细胞培养基。当培养瓶中的胶质细胞生长1至2周并即将达到100%汇合时，即可收获胶质细胞。为制备单个胶质细胞包被的盖玻片，首先将六片经硝酸清洗并灭菌处理的盖玻片放入培养皿中。

在10厘米培养皿中放入25毫米圆形盖玻片，用小号画笔在每张盖玻片上以等边三角形排列方式放置三滴石蜡与凡士林3:1的混合物。在盖玻片边缘处再放置两滴，用于将盖玻片固定在培养皿上。

将敞口培养皿用紫外光照射处理30分钟。将盖玻片用聚-D-赖氨酸包被1小时，然后用无菌滤过去离子水充分洗涤3至5次，晾干后从培养箱中取出胶质细胞。

弃去培养基，用五毫升预热的胰蛋白酶洗涤。向培养瓶中加入三毫升胰蛋白酶，在37摄氏度孵育一分钟。待细胞脱落后，加入五毫升胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用。

用移液器上下吹打10至15次，从烧瓶中移除GL。然后将培养基转移至15毫升锥形管中，在1000 RPM条件下离心8分钟。离心结束后，将细胞重悬于10毫升胶质细胞培养基中。

然后，将细胞计数后以每10厘米培养皿中12.5毫升胶质细胞培养基接种5 × 10⁵个细胞，培养基中含盖玻片。每两到三天更换一次新鲜预温的胶质细胞培养基，在神经元解剖前一天进行换液。移除胶质细胞培养基，并替换为无血清培养基。

稍后使用此胶质细胞条件培养基。在灌注皮层或海马神经元培养物时，加入 C 至终浓度为 5 µM。为防止胶质细胞增殖，按照制造商说明书推荐的量加入核转染试剂进行转染，然后将溶液升温至室温。

将含有 E 15.5 小鼠脑的培养皿置于冰冷的解剖液中。在解剖显微镜下，使用弯头钨针去除两侧新皮质。然后用显微镊子去除软脑膜，并将皮质组织转移至另一含有冰冷解剖液的新培养皿中。

使用小型虹膜剪刀沿大脑半球内侧可见海马和皮层。小心地去除海马，随后去除剩余的皮层。

对整窝小鼠的脑组织重复进行解剖操作。将海马体皮层分别放入装有1毫升冰冷解剖液的独立1.5毫升微量离心管中。在完成所有海马体皮层的解剖后，将离心管置于冰上。

向含有组织的微量离心管中加入 110 微升 2.5% 胰蛋白酶，将试管置于 37 摄氏度培养箱中孵育 20 分钟。使用 P1000 移液器尽可能吸除管中的液体。然后向每根试管中加入 1 毫升铺板培养基，通过轻轻倒置微量离心管来洗涤组织。

重复洗涤两次。最后一次洗涤后，加入1毫升铺板培养基。使用P1000移液器将组织块吹打15次。然后将上清液和细胞转移至一个新的15毫升锥形管中，该锥形管内含有4毫升铺板培养基，留下微离心管中残留的组织块。

将15毫升离心管以350转/分钟离心7分钟，离心结束后关闭刹车，弃去上清液，每管加入100微升预混的室温核转染溶液，用移液器轻轻吹打5次以混匀。随后，将100微升核转染溶液与细胞混合物转移至各新的微量离心管中，每管含有适量DNA（每次转染1至2微克DNA）；对于长期培养，标记的神经元将少于培养物中神经元总数的10%。

虽然每次转染加入 5 至 10 微克 DNA 可提高培养物的转染效率，但需将细胞悬液与 DNA 混合物加入电穿孔小室中。然后将小室放入电穿孔仪内。对于小鼠中枢神经系统神经元，将核转染仪程序设置为 oh 0 0 5。操作需迅速，向小室中加入 500 微升预热并平衡过的铺板培养基，然后将细胞悬液转移至新的 1.5 毫升微量离心管中。

加入足够的铺板培养基，使每次转染体系的总体积达到一毫升。细胞计数后，对于短期培养，每平方厘米接种三至五乘以十的三次方个细胞；对于长期培养，每平方厘米接种五至十乘以十的三次方个细胞，通常为五乘以十的五次方或一乘以十的六次方个细胞用于每次转染，以制备短期培养的细胞。

接种后一小时，用两毫升温热的、经二氧化碳平衡的无血清培养基淹没35毫米的培养皿。成像用培养腔室中的血清含量极低，低于0.5%。短期培养无需使用胶质细胞饲养层，也无需重新铺板。制备长期培养时，向无血清培养基中加入一毫升胶质细胞条件培养基。

取一个覆盖有甘油明胶的盖玻片，其上含有三个石蜡凡士林液滴，将其倒置覆盖在35 mm培养皿的15 mm孔上。然后加入1 mL培养基以维持长期培养。每两到三天更换三分之一的无血清培养基。

培养 5 至 7 天后，加入阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）至终浓度为 5 µM，以抑制胶质细胞增殖。以下为典型的活体海马神经元成对图像，分别显示微分干涉差（DIC）显微图像及其对应的荧光显微图像。这些细胞均已被转染了分别携带 EGFP、tubulin 和 DS Red2 的 PA 载体。

在第一阶段，神经元最初会贴附于基质，并在大约一天的时间内，从细胞体周围伸出片状的板状伪足和指状的丝状伪足。在第二阶段，这些初始突起将分化为多个从细胞体发出的神经突，通常长度保持在30至50微米左右。在第三阶段，其中一个神经突会随机地开始快速延伸，最终发育成为轴突。

其他神经突保持较短，被称为次要突起。大多数海马和皮层神经元在培养两到三天后进入第三阶段。在接下来的一到两周内，进入第四阶段，此时次要突起增粗、伸长并分支，发育成为树突，此处以绿色显示。与此同时，轴突在持续生长和分支的过程中逐渐变细，此过程持续约两到三周。

在培养过程中，树突通过形成树突棘而发生分化，树突棘是沿树突分布的小型突起。第五阶段的神经元在形态和大小上会有所差异，但大多数神经元应经历这一系列发育阶段。如果蛋白过表达干扰了神经元发育，转染的神经元可能无法顺利完成这些阶段。

此外，神经元可能不会经历全部发育阶段。如果盖玻片未彻底清洁或聚赖氨酸未能充分黏附，胶质细胞也可能大量增殖，尤其是在未使用C的情况下。这是一张两周龄培养物的相差显微图像，显示在长期培养中胶质细胞已过度生长并占据整个培养区域。

更换培养基过于频繁或不够频繁都可能影响神经元的存活能力。这是一张相位差显微镜图像，显示培养物中大多数神经元已经死亡，残存的神经元胞体缩小，突起出现串珠样变性。作为对比，这是一张培养两周后健康海马神经元的相位差显微镜图像。请注意其较大的胞体以及突起无串珠样改变。

此外，在此阶段，神经元的树突已增粗，并形成了大量复杂的轴突网络。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成整个胎鼠窝的胚胎分离、大脑皮层解剖、转染及接种。在进行该操作时，需特别注意，海马和皮层神经元对机械性损伤极为敏感。

此外，在分离神经元的过程中，保持溶液尽可能低温非常重要，以维持较低的代谢活性。通过该方法处理后，还可进行其他实验，如活细胞成像和神经元活动的生理记录，以回答更多科学问题，例如目的荧光融合蛋白如何在神经元的不同区域分布。若蛋白定位与突触活性变化相关，或这些蛋白的功能如何受到不同药理学处理的影响。