Name: 显微切割的黑寡妇蜘蛛丝绸生产腺体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习从黑寡妇蜘蛛腹部显微切割分离七种丝腺组织的方法，用于分子与生化研究。该技术可获取完整腺体样本，支持实时定量PCR和质谱分析，助力理解丝蛋白合成机制。

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本工作由美国国家科学基金会RUI基金（项目编号：MCB-0950372）资助，项目名称为“黑寡妇蜘蛛丝的分子表征”。

1. 麻醉蜘蛛并分离腹部
<ol>
	<li>将蜘蛛从玻璃罐转移到内衬塑料膜的纸盒中（图1A）。我们通常从木堆、车库或灌木丛中采集蜘蛛，并在实验室的玻璃罐中饲养。由于蜘蛛无法攀爬塑料内衬，因此这是一种有效的转移方法，可将蜘蛛从玻璃罐或咖啡罐转移到较小的样品瓶中，以便进行麻醉。在此过程中操作蜘蛛时，出于安全考虑，应佩戴两层乳胶手套或园艺手套。</li>
	<li>当蜘蛛位于内衬塑料膜的纸盒中时，从其后方接近，让蜘蛛滑入塑料培养管中。蜘蛛进入管内后，立即盖上塞子（图1B）。建议使用尺寸约为101.6 mm × 31.75 mm（长×直径）的样品管。这样可最大限度减少麻醉步骤所需的二氧化碳气体用量。</li>
	<li>以5–10 psi的压力通入二氧化碳气体，持续10分钟，使蜘蛛麻醉（图1C）。此剂量的气体仅能使蜘蛛失去活动能力约5分钟，因此麻醉后必须立即进行步骤1.4–1.5。</li>
	<li>将麻醉后的蜘蛛放入小型解剖皿中，用镊子将其调整为背面向上（红色沙漏斑纹朝下）。</li>
	<li>剪断连接头胸部与腹部的细柄状结构（即柄部），使腹部与蜘蛛其他部分分离（图1D）。将头胸部放入培养皿中，置于冰箱冷冻过夜，次日冻实后丢弃。移动头胸部时需小心，因为蜘蛛的毒牙位于该部位。</li>
	<li>用一根昆虫针将腹部固定在小型解剖皿内的Sylgard材料上。将昆虫针穿过剪断柄部后留下的孔洞（图1E），该位置通常可见液体渗出，易于识别。确保纺器（与柄部相对的一端）朝向解剖皿底部（即靠近操作者的一侧）。</li>
</ol>
2. 去除外骨骼
<ol>
	<li>使用一对显微剪刀从足柄切除处的孔开始，穿过外骨骼进行第一次切口，向两侧横向剪开，直至到达背侧（图1F）。用一对镊子将前部外骨骼片段掀开，并在此位置插入第二根固定针。插入第二根固定针后，将解剖托盘转向尾侧，与最初的横向切口呈90°角，继续剪切直至到达纺器（图1G）。此次切口应与初始的横向切口垂直或呈竖直方向。进行竖直切口时，切勿剪断纺器（位于沙漏状结构后方，呈圆形外观）。若未插入第二根固定针，在进行竖直切口时会导致腹部发生旋转。</li>
	<li>将腹部浸入解剖缓冲液（0.1 M 氯化钠，0.015 M 柠檬酸钠，0.1% 焦碳酸二乙酯）中。</li>
	<li>从初始的横向切口处开始，向后剥离剩余的外骨骼。完成此步骤后，脂肪组织应清晰可见（图1H）。</li>
</ol>
3. 蚕丝腺体的分离
<ol>
	<li>使用镊子开始剥离脂肪层（图1H）。脂肪呈白色至淡黄色。持续操作直至大部分脂肪被去除，丝腺清晰可见。管状腺由三对非常长的圆柱形管组成，大量存在于腹部腔内。大壶腹腺成对存在，为大型新月形壶腹，具有一条长而盘绕的远端尾部，以及一条向蜘蛛纺丝器方向延伸时逐渐变窄的近端导管。小壶腹腺在形态上与大壶腹腺非常相似，但明显更小。鞭状腺也成对存在，呈圆形且多叶状，具有一条向下延伸至纺丝器的小型圆柱形锯齿状导管。粘液腺（成对存在）为一个非常大的多叶状腺体，具有一条非常大的排泄导管，其上带有大型不规则的叶状结构。环状腺数量众多，形似短小的指状突起。梨状腺是腹部最小的腺体，具有许多紧密排列的圆柱形导管，形似扇形，具许多向下延伸至纺丝器的小排泄导管。</li>
	<li>我们建议按以下顺序移除腺体：管状腺、大壶腹腺、鞭状腺、小壶腹腺、粘液腺、环状腺，最后是梨状腺（图2A-B）。</li>
	<li>首先从管状腺开始，将其从其他腺体上小心分离——它们应位于其他腺体的上方（图2A）。一只蜘蛛体内有三对管状腺。使其自由漂浮，但仍通过导管与纺丝器相连。</li>
	<li>接下来，分离大壶腹腺。一只蜘蛛体内存在两个大壶腹腺。在移除过程中，确保导管仍与腺体相连（图2A）。</li>
	<li>继续将其余腺体彼此分离，操作时需小心，避免刺破任何腺体，尤其是粘液腺和鞭状腺。每个腺体应从其在体壁上的出口直至纺丝器全程自由漂浮。这些腺体也成对存在。用镊子夹住导管，小心拉扯，直至其从出口处断开，从而移除每个腺体。大壶腹腺、鞭状腺、小壶腹腺和粘液腺均成对存在。环状腺和梨状腺则具有更多对。</li>
	<li>用镊子夹住导管，小心拉扯，直至腺体从纺丝器附近的出口处断开。我们通常将腺体以湿润状态储存；但不会额外添加缓冲液。</li>
	<li>在移除腺体后，将其放入无菌且预先标记的1.5 ml微量离心管中。各单个腺体如图3A-G所示。将这些腺体保持在冰上，随后在液氮中快速冷冻。在液氮中快速冷冻后，置于-80°C保存。</li>
</ol>
4. 代表性结果
在分离不同腺体时，操作鞭状腺和复合腺需格外小心，因为这两种结构极易被镊子刺破或损伤。此外，值得注意的是，在分离前鞭状腺和复合腺在形态上非常相似，且常相互缠绕。为防止在分离过程中这些组织发生交叉污染，解剖者应仔细将这些结构分开。另外，在初次暴露产丝腺体时，由于环状腺和梨状腺体积较小且解剖位置较深，通常最难立即辨识。通常可见大量卵粒存在。此外，在分离梨状腺时还需格外小心，因为该组织具有极强的黏性，常会黏附于镊子上。若操作得当，可从一只蜘蛛中高度纯化地获取全部七种产丝腺体。通常，一次单只蜘蛛的解剖可获得微克量级的总RNA和蛋白质。图4展示了利用总RNA进行qPCR分析，检测仅在管状腺中表达的纤连蛋白基因TuSp1的mRNA水平的示例。图5和图6分别展示了利用腺体收集的蛋白裂解液进行的代表性实验，例如溶液内胰蛋白酶消化后进行质谱（MS）分析（也可用于MS/MS分析）或氨基酸组成分析。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="蜘蛛捕捉与检查过程；示意图展示 containment 和观察步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="甲虫神经外科实验，显示科学研究中的解剖阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1e"> 图1. 雌性黑寡妇蜘蛛的处理、麻醉以及腹部外骨骼的去除。A) 将蜘蛛转移至内衬塑料膜的纸盒中，以便将其移入较小的塑料小瓶。B) 将蜘蛛放入带塞的塑料小瓶中。C) 使用二氧化碳气体对蜘蛛进行麻醉。D) 使用显微剪刀将头胸部与腹部分离。E) 使用昆虫针将腹部固定在解剖盘中以实现固定。F) 用剪刀进行侧向切口，并用镊子将部分外骨骼掀开后的视野。G) 正对初始侧向切口进行垂直方向的切口操作。H) 去除外骨骼并暴露脂肪层。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="蜘蛛丝腺解剖结构示意图；管状腺、球状腺、梨状腺分类，生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 完整蜘蛛腹部中七种不同产丝腺体及其周围组织的可视化图示。A) 管状腺、大壶状腺、鞭状腺、凝胶状腺和小壶状腺组织在 12 倍放大下的图像。B) 球状腺和梨状腺在 12 倍放大下的图像。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="线虫图像A-D的静态平衡；生物体结构比较，显微分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="海洋生物显微图像；E-H。海洋生命形态的显微观察。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3e"> 图3. 从腹部取出的七种产丝腺体的照片。所有图像均以20倍放大倍数拍摄，仅腺泡状腺和梨状腺以40倍放大倍数拍摄。A）大壶腹腺；B）大壶腹腺和小壶腹腺（右侧），用于尺寸比较；C）管状腺；D）鞭状腺；E）聚集腺；F）腺泡状腺；G）梨状腺。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="TuSp1 mRNA表达量均一化后的柱状图；基因表达水平的数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 通过定量实时PCR（qPCR）检测不同丝腺（不包括梨状腺）中TuSp1 mRNA的表达水平，在提取各腺体总RNA后，获得丝基因TuSp1表达模式的代表性结果。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="质谱图；强度与质荷比的关系，详细展示蛋白质峰。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 对来自梨状腺的蛋白质提取物经溶液内胰蛋白酶消化后进行质谱分析的示例。注意：x2 表示谱图强度放大 2 倍。对应于 PySp1 纤连蛋白区域的肽离子质量用符号 # 标注。
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="管状腺氨基酸组成；氨基酸柱状图；蛋白质分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 从管状腺提取的蛋白质的氨基酸组成谱的典型结果。注意：ASX = Asp 和 Asn；GLX = Glu 和 Gln。蓝色表示具有极性侧链基团的氨基酸，而红色表示具有非极性侧链基团的氨基酸残基。

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们提供的黑寡妇蜘蛛丝腺显微解剖方法，是一种获取高纯度丝腺组织的有效手段。解剖过程可在1.5至3小时内完成，能够从结网型蜘蛛中分离出全部七种不同类型的丝腺。获得高纯度的丝腺样本使研究人员能够开展多种生物化学研究，包括利用质谱技术鉴定腺腔内容物中储存的新丝蛋白或分子伴侣蛋白、分析在不同类型腺体中选择性表达基因的mRNA水平，以及特定腺体的体外培养。 体外 研究蚕丝生产的机制。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>水中 0.1 M</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>水中 0.015 M</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>数码显微镜相机</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>软件 - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢镊子</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>昆虫针 #2</td></tr><tr><td>小型或大型解剖皿</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S 或 DD-90-S</td><td>52 mm 直径 × 18 mm 高（Sylgard 深度约 6 mm）或 93 mm × 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 培养管</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>尺寸为 31.75 mm 直径 × 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

黑寡妇蜘蛛丝腺的显微解剖

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

现代蜘蛛能够纺出具有多种生物学功能的高性能丝纤维，包括运动、捕食以及保护发育中的后代1,2。蜘蛛通过纺制多种不同类型的纤维来完成这些任务，这些纤维具有各异的力学性能。纤维类型的这种特化是通过进化出不同的丝腺实现的，这些丝腺作为小型生物工厂发挥作用。这些生物工厂负责制造并储存大量丝蛋白，以用于纤维的生产。通过一系列复杂的生化过程，这些丝蛋白在挤出时从液态转化为固态物质。
力学研究表明，蜘蛛丝的强度超过高抗拉强度钢3。对蜘蛛丝纤维结构与功能关系的分析表明，蜘蛛丝主要由蛋白质（即丝心蛋白）构成，这些蛋白质在其氨基酸序列中具有重复的模块结构4。通过对丝腺cDNA的翻译产物进行分析，研究人员正在逐步揭示赋予蜘蛛丝惊人抗张强度和延展性的共同分子特征。鉴于蜘蛛丝卓越的材料特性，全球各地的研究实验室正竞相深入了解并模拟其纺丝过程，以制备可用于商业、军事和工业领域的合成蜘蛛丝纤维。在实验室中人工纺制蜘蛛丝面临的主要挑战之一，是对纤维从丝腺挤出过程中所发生的生化过程进行全面理解。
本文介绍了一种从结网型黑寡妇蜘蛛中分离七种不同丝腺的方法，包括大壶状腺和小壶状腺[分别产生牵引丝和支架丝]5,6、管状腺[合成卵囊丝]7,8、鞭状腺[在结网蜘蛛中的功能尚不明确]、凝集腺[产生黏性丝]、梨状腺[产生附着盘丝]10以及aciniform腺[合成包裹猎物和卵囊的丝线]9。该方法基于使用二氧化碳气体对蜘蛛进行麻醉，随后将头胸部与腹部分离，并对腹部进行显微解剖以获取丝腺组织。在分离出不同类型的丝腺后，这些组织可用于提取多种大分子，以进行不同的生化分析，包括实时定量PCR、Northern印迹和Western印迹、质谱（MS或MS/MS）分析，以鉴定新的丝蛋白序列，筛选参与丝蛋白组装通路的蛋白质，或利用完整组织进行细胞培养或组织学实验。

本文介绍了一种从雌性黑寡妇蜘蛛腹部高效去除丝腺的策略。该方法能够快速分离出七种不同类型的丝腺，且纯度较高，对于研究蜘蛛丝生成和纤维组装的科研人员而言，这一过程至关重要。

现代蜘蛛能纺出具有多种生物学功能的高性能丝纤维，包括运动、捕食以及卵和幼体的保护……

本实验的总体目标是从蜘蛛的腹部分离出七种不同的丝腺，并利用这些组织进行分子和生化研究。首先使蜘蛛麻醉以完成该过程。实验的第二步是分离头胸部、胸节和腹部，并用昆虫针将腹部固定在一个小型解剖皿中。该操作流程的第三步是在外骨骼上做切口，以暴露产丝腺体。最后一步是取出不同的产丝腺体。最终，可通过分子生物学和生物化学方法（如定量实时 PCR 或质谱分析）获得结果，证明不同的产丝腺体表达 distinct 的丝 mRNA 或蛋白质。该方法将为蜘蛛生物学研究提供重要见解，揭示储存在丝腺中的蛋白质。这些蛋白质在军事、医学以及众多商业和工业领域具有广泛应用。当我们需要深入了解丝腺中储存的蛋白质时，便首次萌生了开展此项研究的想法。该技术的主要优势在于雌性黑寡妇蜘蛛的腹部非常大，便于分离出丝腺。初次使用该方法的研究者可能会遇到困难，因为在解剖过程中丝腺常常会破裂。此外，某些解剖结构也较难分离。直观演示对于良好的解剖操作至关重要。在开始解剖之前，将由 Kobe LaMattina、Tiffany Tootin、Blasingame 和 Y Shaw 进行操作示范。准备 500 毫升解剖缓冲液，其成分为 0.1 摩尔氯化钠、0.015 摩尔柠檬酸钠和 0.1% 碳酸氢乙酯。然后准备一个内衬塑料的纸箱，以容纳蜘蛛并防止其爬出。我们通常从木堆、灌木丛或车库中获取黑寡妇蜘蛛，并使用玻璃罐在实验室中饲养。获取蜘蛛后，在操作过程中将其从玻璃罐转移到纸箱中。为安全起见，佩戴两副乳胶手套或园艺手套。然后使用小型塑料培养管，从蜘蛛后方接近，将蜘蛛滑入管中，并立即塞紧管口。以 5 至 10 PSI 的压力向管内通入二氧化碳气体，持续 10 分钟，使蜘蛛麻醉。在蜘蛛仍处于麻醉状态的 5 分钟内，应完成腹部与头胸部的初步解剖分离。将麻醉后的蜘蛛放入小型解剖皿中。剪断连接头胸部与腹部的窄柄状结构——即茎突，以分离腹部。头胸部含有蜘蛛的螯牙，需妥善处理。小心取出放入培养皿中的头胸部，并冷冻过夜。丢弃前，通过观察腹腔液体渗出的位置，找到足细胞切割在蜘蛛腹部所形成的孔洞。使用一根解剖针，将针从孔洞插入腹部，以将腹部固定在解剖托盘上，调整蜘蛛的方向，使基座端远离解剖者，而纺器端朝向解剖者。使用一对显微剪刀，从足细胞剪切形成的孔处开始，沿外骨骼向两侧横向剪开，直至到达背侧。用镊子向后剥离前部外骨骼节段，并在此位置插入第二根固定针。接着，将解剖托盘相对于最初的横向切口旋转90度角。继续切割直至到达纺锤体。切口应与最初的侧向切口垂直。纺锤体位于沙漏结构下方，呈圆形外观。进行垂直切口时，切勿切断背纵肌。将腹部浸入解剖缓冲液中。从最初的侧向切口处开始，向后剥离剩余的外骨骼。完成此步骤后，应使用镊子清晰可见呈白色至淡黄色的脂肪组织。开始轻轻剥离脂肪层，直至大部分脂肪被去除，丝腺清晰可见。若存在卵子，应将其移除。此时，按以下顺序

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

显微切割的黑寡妇蜘蛛丝绸生产腺体

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