在小鼠海马切片培养物中通过单细胞电穿孔进行基因表达

从小鼠大脑的海马切片开始，在培养皿中的培养物插入物上培养。

切割包含切片的插入物并将其固定在显微镜下的电穿孔室中。

用含有电压门控钠通道阻滞剂的缓冲液灌注腔室，以抑制过度激发并防止细胞毒性。

含有具有目标基因的质粒的移液器放置在切片附近。

接近目标海马神经元时保持正压以防止移液器堵塞，直到形成膜凹坑。

切换到负压以与膜形成密封。

正压和负压之间交替，以尽量减少细胞损伤。

应用电穿孔脉冲瞬时透化膜，促进质粒进入。

保持正压的同时取出移液器，并对相邻的靶神经元重复电穿孔。

电穿孔切片转移到新鲜插入片段中并孵育以允许目标基因表达。

要制备用于电穿孔的切片培养物，请将感兴趣的培养物插入装有 900 微升培养基的单独 3 厘米培养皿中，并将培养物放入台式二氧化碳培养箱中。接下来，将新鲜培养物插入物与每个插入物一毫升切片培养基在3.5厘米培养皿中预孵育至少30分钟，并用10%漂白剂对电穿孔装置的管线进行灭菌五分钟。

注结束时，用离子高压灭菌水冲洗管线至少30分钟，然后用含有0.001毫摩尔河豚毒素的过滤灭菌aCSF灌注。将电穿孔器脉冲设置为负 5 伏的幅度、方形脉冲、500 毫秒的序列、50 赫兹的频率和 500 微秒的脉冲宽度。用 5 微升含质粒的内部溶液填充玻璃移液器，然后轻弹和敲击吸头多次以去除任何滞留的气泡。

使用解剖显微镜确认吸头未损坏，并将移液器吸头牢固地连接到电极上。当吸头与 aCSF 接触时，记录电穿孔器的移液器电阻读数。要分离切片培养物，请用锋利的刀片切割培养物插入膜，并使用锐角镊子小心地将切片培养物转移到电穿孔室中。

然后用切片锚固定培养位置。对于感兴趣细胞的电穿孔，通过嘴对移液器施加正压，并使用三维旋钮控制将移液器吸头纵到切片培养物表面附近。用显微镜观察培养物，用尖端接近目标细胞，保持施加正压，直到细胞表面形成凹坑。

凹坑后，快速用嘴施加温和的负压，使移液器吸头和质膜之间形成松散的密封。膜会稍微进入移液器。应观察到移液器的初始电阻增加约 2.5 倍，如扬声器音调增加所示。

快速重新施加正压，使酒窝重新形成。然后立即完成至少两个压力循环，如刚才演示的那样，不要暂停。在最后一次压力脉冲之后，保持负压一秒钟。

当扬声器的音调达到稳定的音高顶点时，使用脚踏板快速脉冲电穿孔器。电穿孔后，在不施加压力的情况下轻轻地将移液器从细胞中缩回约100微米，然后重新施加正压，在接近下一个细胞之前验证电阻是否与基线读数相似。当所有感兴趣的细胞都电穿孔后，将切片培养物转移到制备的新鲜培养物之一中，并将插入物置于35摄氏度下长达三天。