Name: 成年鼠神经干细胞的分离和扩大使用神经干含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 学习使用神经球培养法分离和扩增成年小鼠脑室周区神经干细胞。本方案提供可重复培养的技术要点，帮助研究人员建立稳定的神经干细胞培养体系。

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本工作获得了奥弗斯特里特基金会的资金支持。

第1部分：开始解剖前的基本准备：
<ol>
	<li>通过将 NeuroCult NSC 基础培养基与 NeuroCult NSC 增殖添加剂按 9:1 的比例混合，配制适量体积的完全 NSC 培养基。也可根据文献中公布的 NSC 生长培养基成分在实验室自行配制 NSC 培养基1。如果您的实验室在培养基配制方面经验不足，我们强烈建议使用 commercially available medium（商品化培养基），该培养基在出售前已针对 NSC 的生长进行了质量控制（例如 NeuroCult，Stem Cell Technologies）。</li>
	<li>将培养基置于 37°C 水浴中预热。</li>
	<li>为解剖和清洗操作，配制含高浓度抗生素（10%）的冷 HEPES 缓冲最低必需培养基（HEM）。或者，也可使用添加抗生素的 NSC 基础培养基用于此目的。</li>
	<li>将含抗生素的 30–40 ml 冷 HEM 分装至无菌 50 ml 离心管中，用于脑组织采集。</li>
	<li>需要若干个 10 cm 塑料培养皿用于解剖过程中放置脑组织，另需一个 10 cm 无菌玻璃培养皿用于盛放已解剖的组织。</li>
	<li>用于取出脑组织的手术器械（大剪刀、小尖头剪刀、大镊子、小弯头镊子和小刮勺）或用于组织解剖的器械（小镊子、弯头精细镊子和手术刀）需使用玻璃珠灭菌器在 250°C 下灭菌，或采用其他可用的高压灭菌方法进行灭菌。</li>
	<li>解剖显微镜用 70% 酒精擦拭，并置于生物安全柜（PC2 柜）内准备就绪。</li>
</ol>
第二部分：成年小鼠脑组织的采集与显微解剖：
<ol>
	<li>根据所在机构批准的动物实验方案，使用 3-4% 异氟烷麻醉或腹腔注射戊巴比妥钠（120 mg/kg），对 2-4 只成年（5-8 周龄）小鼠进行麻醉。</li>
	<li>实施颈椎脱位以确保动物不会遭受疼痛与痛苦。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠俯卧于吸水纸巾上，并用 70% 乙醇冲洗头部以消毒操作区域。</li>
	<li>使用大剪刀在颈脊髓区域稍上方处剪断头部以进行去头。</li>
	<li>使用小尖头剪刀沿中线从尾侧向头侧剪开皮肤，暴露颅骨。</li>
	<li>利用切开的皮肤边缘固定头部，将小剪刀的两个刀片分别插入两侧眼眶，于两眼之间做冠状切口。</li>
	<li>以枕骨大孔为入口，沿矢状缝做一条纵向切口，并在颅底与侧壁交界处做两条侧向切口。操作时应谨慎，通过做小切口并尽可能保持刀片角度平缓，避免损伤下方脑组织。</li>
	<li>用弯头镊子夹住覆盖半球的颅骨，向外剥离以暴露脑组织；然后用湿润的小刮匙将脑组织转移至含有 HEM 的 50 ml 离心管中。</li>
	<li>重复此操作，直至所有脑组织均被取出。</li>
	<li>将脑组织转移至 PC2 生物安全柜中，用足量冷的无菌 HEM 洗涤三次，以去除可能的污染物（如血液和毛发）。随后将脑组织转移至含有 HEM 的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>为分离前脑室周区域，将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下，调节至低倍放大。将脑组织腹面朝下平放，并用精细弯头镊子从尾侧固定。使用另一把弯头镊子去除嗅球。</li>
	<li>去除嗅球后，将脑组织旋转以暴露其腹面。</li>
	<li>在视交叉水平处做 90° 冠状切口，弃去脑组织的尾侧部分。</li>
	<li>重复此操作，直至所有脑组织均被切段。</li>
	<li>在较高倍镜下，将脑组织的头侧部分旋转，使切面朝上。首先使用精细弯头显微剪刀或弯头尖镊子去除并弃去隔区；然后切下侧脑室侧壁周围的一层薄组织，避免包括纹状体实质和胼胝体。将分离的组织收集至一个 10 cm 无菌玻璃培养皿中。</li>
	<li>重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。</li>
</ol>
第3部分：组织准备与细胞接种：
<ol>
	<li>使用手术刀片将混合组织切碎约1-2分钟，直至仅剩微小碎片。</li>
	<li>总共使用3 ml的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，将所有切碎的组织转移至一个15 ml离心管中。3 ml胰蛋白酶-EDTA足以良好消化来自最多8只小鼠的组织样本。</li>
	<li>将离心管置于37°C水浴中孵育7分钟。</li>
	<li>酶解孵育结束后，将离心管移回生物安全柜，并加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>用移液器反复吹打悬浮液以确保胰蛋白酶完全失活，随后在700 rpm（110 g）条件下离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将组织碎片重悬于150 μl无菌NSC基础培养基中。将移液器重新设定为200 μl，轻柔地反复吹打（3-7次），直至形成均匀乳白色的单细胞悬液。吹打次数取决于切碎组织中颗粒的大小（建议将组织切得尽可能细小，以增加胰蛋白酶作用的表面积）。过度或剧烈的机械解离可能导致神经干细胞和前体细胞死亡，从而降低神经球的形成能力。</li>
	<li>为去除碎片及未解离的组织块，向解离后的细胞悬液中加入NSC基础培养基，使总体积达到10-15 ml。将细胞悬液通过40 μm细胞滤网过滤至合适大小的离心管中，然后在700 rpm（110 g）条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>为进一步去除残留碎片，建议将沉淀重悬于10-15 ml NSC培养基中，并在700 rpm（110 g）条件下再次离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量完全NSC培养基中，该培养基需补充20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF以及1 μl/ml的0.2%肝素。</li>
	<li>将一只小鼠脑组织解离所得细胞接种至一个T25培养瓶中（含5 ml完全培养基）。将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养7-10天，期间应形成神经球。通常，一只小鼠脑组织可生成400-600个神经球。</li>
</ol>
第4部分：神经干细胞的传代与扩增：
<ol>
	<li>当神经球准备进行传代培养时（直径为 150–200 μm），将含有悬浮球体的培养基从培养瓶中移出，转移至适当大小的无菌组织培养管中，在室温下以 700 rpm（110 g）离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将神经球重悬于 1 ml 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。或者，也可采用文献中描述的机械解离或化学解离方法对神经球进行传代2,3。</li>
	<li>将细胞悬液置于 37°C 水浴中孵育 2–3 分钟，然后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>轻轻吹打细胞悬液，上下混匀，确保胰蛋白酶已完全失活。</li>
	<li>将细胞悬液以 700 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液后，将细胞重悬于 1 ml NSC 培养基中。</li>
	<li>取 10 μl 细胞悬液与 90 μl 台盼蓝混合，进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞以 5×104 个细胞/ml 的密度接种于完全 NSC 培养基中，培养基中需添加 20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF 和 1 μl/ml 的 0.2% 肝素。T25 培养瓶使用 5 ml 培养基，T75 培养瓶使用 20 ml，T175 培养瓶使用 40 ml。</li>
	<li>在 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5–7 天后，可形成次级神经球。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果：
在成年人大脑原代神经干细胞培养中，大多数细胞在2-3天后会死亡，但对生长因子有反应的前体细胞（包括干细胞和祖细胞）将增殖（图1），并在6-8天后形成未分化细胞集落。在这些培养物中，通常存在大量碎片，这些碎片可能呈球形，易与神经球混淆。碎片的多少直接取决于显微解剖和组织处理技术。真正的神经球在相差显微镜下呈亮相（透亮），且随着体积增大而变得更加圆整（见视频）。培养7-10天后，神经球应呈圆形但不致密，直径应在150至200 μm之间，在高倍镜下观察时边缘应具有刚性的微突起（图2）。若神经球生长过大，其中心区域的细胞会发生死亡，导致整体颜色变暗。过大的神经球难以解离，最终会贴壁并开始分化。
<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig1.jpg" alt="细胞分裂过程的显微镜图像；聚焦有丝分裂活性；四联图示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 原代成体NSC培养物在接种后3天的形态。箭头所示为增殖性NSC的小克隆。原始放大倍数：20x。
<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig2.jpg" alt="类球体形成；显微镜图像；三维细胞培养；癌症研究；细胞结构研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 接种后7天的成年神经球传代情况。注意球体边缘的微突起。原始放大倍数：20x。

<ol><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tissue+dissociation+protocol+for+scaled-up+production+of+neural+stem+cells+in+suspension+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors.</a> Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li>
<li>Messina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circ Res. 95, 911-921 (2004).</li>
<li>Ignatova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

神经球实验 2 在科研领域已受到广泛关注，不仅用于从中枢神经系统（CNS）4-5 分离和研究神经干细胞（NSCs），还用于从多种组织（如乳腺 6 和心脏 7）中分离其他类型的假定干细胞，并用于鉴定脑、乳腺和结肠肿瘤干细胞 8-9，表明该培养体系可应用于全身多种体细胞及肿瘤前体细胞群体。该方法的一些优势包括操作简便、可重复性强，以及能够在化学成分明确且无血清的培养基中，从少量组织甚至少量细胞扩增出数量无限的细胞。
需要强调的是，培养物中神经球的数量并不能代表干细胞的数量，因为神经球既可以来源于真正的干细胞，也可以来源于更局限的前体细胞10。为此，已建立一种检测方法，用于准确计数培养物中的神经干细胞11。
用于将神经球解离为单细胞悬液的方法包括机械法和酶解法。尽管机械法是最初的神经球解离方法2，但该方法需要丰富的操作经验，且其效率因操作者而异。如果由经验...

<table><tbody><tr><td>NeuroCult NSC 基础培养基</td><td>培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult NSC 增殖添加剂</td><td>培养基添加剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>筛具</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T80 培养瓶</td><td>培养器皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>HEM 组分</td></tr><tr><td>*蒸馏水</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>培养器皿</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>精细弯镊</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251&amp;#8208;35</td><td></td></tr><tr><td>小型精细镊</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272&amp;#8208;30</td><td></td></tr><tr><td>小型镊子</td><td>手术工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050&amp;#8208;10</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">*配制 HEM：取 1&amp;#215;10 L 的 MEM 粉剂包与 160 ml 的 1 M HEPES 混合，用蒸馏水定容至 8.75 L，调节最终 pH 至 7.4，并于 4&amp;#x00B0;C 保存。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

利用神经球实验分离与扩增成年小鼠神经干细胞

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

从成年小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞（NSCs）的方法最早由Reynolds和Weiss于1992年报道，该方法采用一种化学成分明确且无血清的培养体系，称为神经球检测法（neurosphere assay, NSA）。在此体系中，大多数已分化细胞类型在培养数天后死亡，而少数对生长因子有响应的前体细胞则在表皮生长因子（EGF）和/或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）存在条件下活跃增殖。这些细胞形成未分化细胞的克隆集落，称为神经球，神经球可进一步传代培养以扩增神经干细胞群体。此外，这些细胞可被诱导分化，生成中枢神经系统（CNS）的三大主要细胞类型，即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。该检测法为获得稳定、可再生的未分化中枢神经系统前体细胞提供了极为宝贵的工具，可用于 体外 研究以及治疗目的。
本视频演示了利用NSA方法从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞（NSCs）的技术，并提供了确保获得可重复性神经球培养的关键技术要点。该操作流程包括从成年小鼠体内取出大脑，显微解剖脑室周围区域，组织制备，并在NSA中进行培养。所获取的组织首先使用胰蛋白酶-EDTA进行化学消化，随后在NSC培养基中通过机械法解离，以获得单细胞悬液，最终接种于NSA中。培养7至10天后，获得的原代神经球即可进行传代培养，以扩增至后续实验所需的细胞数量。

本视频方案演示了从成年小鼠脑室周围区域分离和扩增神经干细胞的神经球实验方法，并提供了技术要点，以确保获得可重复的神经球培养结果。

从成年小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞（NSCs）的方法最早由 Reynolds 和 Weiss 于 1992 年采用……进行描述

以下实验的总体目标是利用神经球检测法分离并扩增成年小鼠神经干细胞。首先获取成年小鼠脑组织，随后在显微镜下解剖脑组织，去除隔区并分离脑室周围组织。然后将组织剪碎并进行胰蛋白酶消化，以获得单细胞悬液。随后将细胞接种于神经干细胞培养基中进行培养。大家好，我叫Hassan Ali，目前在佛罗里达大学麦克奈特脑研究所与Brent Reynolds博士合作。今天我将演示如何从成年小鼠脑组织中分离并扩增神经干细胞。让我们前往实验室并开始操作。麻醉2至4只成年小鼠，进行颈椎脱位，并用70%乙醇冲洗头部。将动物断头后，使用小型尖头剪刀沿中线从尾端向头端剪开，暴露颅骨。切除多余的颈部组织后，将尖头剪刀的刀片分别插入眼眶内，在两眼眶之间做冠状切口。以枕骨大孔为入点，沿矢状缝纵向剪开颅骨。操作时需小心，确保剪刀刀片尽可能浅层操作，避免损伤下方的脑组织。再次使用框架和大型器械，沿颅骨的外侧部分进行切割。使用弯头镊子夹住并从外向内剥离覆盖每个半球的颅骨，以暴露脑组织。然后使用小刮勺将脑组织舀入含有hem的50 ml离心管中。重复此操作，直至所有脑组织均被取出。将脑组织转移至PCR超净台后，移除50 ml离心管中的Hank's平衡盐溶液，并更换新鲜的Hank's平衡盐溶液，以去除血液、毛发等污染物。重复此清洗步骤三次。然后将脑组织转移至含有血清的10厘米培养皿中。将脑组织置于解剖显微镜下，用精细弯头镊子夹住脑组织侧面，使其腹面朝下平放。用另一把镊子去除嗅球。然后旋转脑组织以暴露其腹侧面，并在视交叉水平处垂直于脑组织做冠状切面。将脑组织的尾侧部分放入另一个含有Hank's平衡盐溶液（Hem）的培养皿中。将脑组织的头侧部分放置妥当，以便观察其切面。使用尖头镊子夹住脑组织，用另一把镊子去除隔区。用精细镊子辨认纹状体、胼胝体及室周区域。从每侧分离出侧脑室周围的一层薄薄的组织。务必剔除唾液腺实质和胼胝体。将解剖好的组织放入新标记的10厘米无菌玻璃培养皿中。重复此操作，直至所有脑组织完成显微解剖。使用手术刀片将汇集的组织切碎 1 至 2 分钟，直至仅剩微小碎片。用 1 ml 预热的胰蛋白酶冲洗手术刀片，以收集任何附着的组织。再用另一毫升胰蛋白酶。用胰蛋白酶冲洗培养皿底部以收集组织。将组织转移至15 ml离心管中，确保无组织残留。再用第三毫升胰蛋白酶冲洗培养皿底部，收集残留的任何组织并转移至15 ml离心管中。将试管放入37摄氏度水浴中孵育七分钟。酶解孵育结束后，向消化后的组织中加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，用移液器反复吹打悬浮液以确保胰蛋白酶失活，然后在700 RPM（或110 ×g）条件下离心五分钟，使组织悬浮液形成沉淀。用真空泵吸去上清液并弃去。然后将细胞重悬于150微升无菌神经干细胞基础培养基中。将移液器调至200微升，将吸头紧贴试管底部，上下吹打3至7次，以打散细胞团块，直至形成乳白色悬液。过度吹打可能导致细胞死亡。再加入 9.8 ml 培养基，使总体积达到 10 ml。将细胞悬液通过 40 微米细胞滤网过滤至 50 ml 离心管中，以去除碎片或未解离的组织块。随后在 700 转/分钟（110 ×g）离心 5 分钟，收集细胞沉淀。吸除 S natin 并重悬。将细胞悬浮于 1 ml 完全神经干细胞培养基中。由于我们有来自两个大脑的细胞，取 9 ml 完全神经干细胞培养基并转移至 15 ml 离心管中。将从两只小鼠脑组织中获得的1 ml细胞混合，随后转移至15 ml离心管中，并加入9 ml完全神经干细胞培养基。然后加入bFGF，使其终浓度为10 ng/ml，EGF使其终浓度为20 ng/ml，以及0.2%肝素1 μl/ml。然后将处于完全神经干细胞培养基中的细胞混匀，加入生长因子，将5 ml悬浮液转移至每个T25培养瓶中。通常情况下，从一个脑组织获得的细胞接种到一个T25培养瓶中，每瓶加入5 ml完全神经干细胞培养基。加入生长因子。标记每个培养瓶，并置于37摄氏度、5%CO₂的培养箱中培养7至10天。培养7至10天后，在显微镜下观察培养瓶中的情况。此时，细胞球的直径应达到 150 至 200 微米，可进行传代。收集每个培养瓶中的内容物，并转移至 15 ml 锥形管中。离心后弃去上清液，将沉淀物与 1 ml 预热的胰蛋白酶混合，置于 37°C 水浴中孵育 3 分钟。胰酶消化后，加入等体积的胰酶抑制剂，充分混匀后离心。再次移除上清液，将细胞重悬于1 mL完全培养基中。取10微升细胞悬液加入90微升台盼蓝溶液中。充分混匀悬浮液，取10微升加入血细胞计数板中，进行细胞计数。将总共10毫升的完全培养基转移至15毫升离心管中，以备接种两个T25培养瓶。然后混匀细胞，并加入适量细胞，使终浓度为每毫升50,000个细胞，或每T25培养瓶250,000个细胞。随后加入之前所述的生长因子，包括E-G-F、B-F-G-F和肝素。混匀细胞悬液后，转移至T25培养瓶中，每瓶总体积为5 mL。最后，将培养瓶置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中，以生成球体。此为接种后三天的原代培养示例。此为原代神经球培养七天后的示例。如您所见，存在各种大小的球体。神经球呈现相位明亮或发光状态，并且随着体积增大而变得更加圆整。还存在碎片。碎片的数量取决于多种因素，例如显微解剖和组织制备。在原代成年神经球培养中，碎片较为常见。这些是传代培养的示例。一个成年神经球在培养七天后的状态。同样存在大小不一的球体，但碎片明显减少。球体的边缘显示出明显的微小突起，这是健康球体的特征。如果球体生长过大，其中心可能因细胞死亡而变暗，并难以解离。希望您觉得本视频有用。请注意，切勿让类球体生长过大，否则它们可能会附着在基质上并发生分化，同时也将难以进行传代培养。您需要根据类球体的大小和形态，每7到10天传代一次。祝您的实验顺利。

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成年鼠神经干细胞的分离和扩大使用神经干含量

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本视频方案展示了一种基于流式细胞术技术，利用神经干细胞（NSCs）的物理特性（大小和内部粒度）及荧光特性，从可再生的神经干细胞来源中生成并随后纯化神经祖细胞的新方法。...

神经母细胞检测：一种利用流式细胞术从分化中的神经干细胞后代中生成并富集神经祖细胞的检测方法

该视频展示了从小鼠大脑胼胝下区分离和培养神经干细胞的过程。该过程包括组织解剖、酶解离散，以及在分化因子作用下进行培养，以发育为成熟的神经细胞。...

从小鼠胼胝下区分离与培养成年神经干细胞

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

建立成体神经干细胞（aNSCs）的培养体系，有助于研究并应用aNSCs进行治疗。胼胝体下区（SCZ）最近被确认为成年小鼠中一种新的成神经细胞形成区域。本文介绍了SCZ来源的aNSCs的分离、扩增和分化方法。...

从小鼠胼胝下区分离和培养成年神经干细胞

本文展示了在成年小鼠中建立的一种保留中央管微环境（该微环境容纳内源性神经干细胞（NSCs））的最小化脊髓损伤模型的操作方法。我们介绍了如何利用神经球形成实验来定量分析损伤后确定性神经干细胞和原始神经干细胞的激活与迁移情况。...

一种用于评估轻度脊髓损伤小鼠模型中内源性神经干细胞激活的神经球形成实验

本文介绍一种从E13小鼠胚胎神经节隆起中分离神经干细胞的新型显微手术技术。...

小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

本文详细描述了一种从出生后小鼠主要神经发生微环境来源的神经干细胞建立神经球培养物的实验方案。神经球可用于鉴定脑组织中的神经干细胞，从而估算前体细胞的数量。此外，这些三维结构可在诱导分化条件下接种，分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，进而用于细胞命运的研究。...

从出生后（P1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。...

从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

学习使用神经球培养法分离和扩增成年小鼠脑室周区神经干细胞。本方案提供可重复培养的技术要点，帮助研究人员建立稳定的神经干细胞培养体系。

利用神经球实验分离与扩增成年小鼠神经干细胞

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