成年鼠神经干细胞的分离和扩大使用神经干含量

这个视频协议演示，从成年小鼠脑室周围地区产生和扩大神经干细胞的神经球的含量测定方法，并提供技术见解，以确保可以实现重复性的神经球文化。

以下实验的总体目标是使用 neuro sphere 测定分离和扩增成年小鼠神经干细胞。这是通过首先获得成年小鼠大脑，然后在显微镜下解剖大脑，去除隔膜和分离脑室周围组织来实现的。然后将组织切碎并胰蛋白酶成病以获得单细胞悬液。

然后将细胞接种在神经干细胞培养基中进行培养。嗨，我叫 Hassan Ali，我正在与佛罗里达大学麦克奈特脑研究所的 Brent Reynolds 博士一起工作。今天，我将演示如何从成年小鼠大脑中分离和扩增神经干细胞。

让我们去实验室开始吧。麻醉两到四只成年小鼠，进行颈椎脱位并用 70% 乙醇冲洗头部。将动物斩首，用小尖剪刀剪出正中尾骨，露出头骨。

去除多余的宫颈组织后，通过将尖剪刀的每个刀片放入眼眶腔中，在眼眶之间进行冠状切口。以枕骨大孔为切入点，沿矢状缝合线纵向切开颅骨。小心不要损伤底层大脑，确保刀片尽可能浅。

同样，使用框架和大酒瓶，也沿着头骨的侧面进行切割。使用弯曲的镊子，抓住并向外覆盖在每个半球上的头骨，以露出大脑。然后用小刮刀将大脑舀入含有下摆的 50 ml 管中。

重复此过程，直到收获所有大脑。将大脑转移到 PC 两个罩后，从 50 ml 管中取出下摆并更换为新的下摆，以去除血液和头发等污染物。像这样执行三次洗涤。

然后将大脑转移到一个 10 厘米长的培养皿中，其中包含下摆。将大脑置于解剖显微镜下，并用细弯曲的镊子从舷侧握住每个大脑，将其平放在其腹面上。使用另一组镊子，去除嗅球。

然后旋转大脑以露出腹侧，并在视交叉水平垂直于大脑进行冠状切口。将大脑的 roel 部分放在一个单独的带下摆的培养皿中。放置大脑的喙部，以便您可以看到切割面。

使用尖头镊子握住大脑，然后用另一组镊子取出隔膜。使用细镊子识别纹状体、胼胝体和脑室周围区域。从每一侧解剖出侧脑室周围的薄组织层。

确保排除 sal 薄壁组织和胼胝体。将解剖的组织拉入新标记的 10 厘米无菌玻璃培养皿中。重复此过程，直到所有大脑都被显微解剖。

使用手术刀刀片将混合组织切碎一到两分钟，直到只剩下非常小的碎片。使用 1 ml 预热胰蛋白酶，清洗手术刀刀片以收集任何附着的组织。再加一毫升胰蛋白酶。

清洗培养皿的底部以收集组织。将组织转移到 15 ml 锥形 2 中，以免留下任何组织。用第三 ml 胰蛋白酶清洗培养皿的底部，以将任何其他组织转移到 15 ml 试管中。

将试管放入 37 度水浴中 7 分钟。酶孵育结束时，向消化组织中加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，上下移液以确保胰蛋白酶灭活，然后以 700 RPM 或 110 G 离心 5 分钟使组织悬液沉淀。用真空吸走上清液并丢弃。

然后将细胞重悬于 150 μL 无菌神经干细胞基础培养基中。将移液器重置为 200 微升，将吸头靠在管式移液器底部上下 3 到 7 次，以打碎团块，直到获得乳白色的悬浮液。过度移液会导致细胞死亡。

再加入 9.8 ml 培养基，使总体积达到 10 ml。将悬浮液通过 40 微米的细胞过滤器放入 50 ml 试管中，以去除碎屑或未相关的碎片。然后以 700 RPM 的浓度离心 110 G 细胞，沉淀 5 分钟。

用真空吸尘器吸走 S natin 和 resus。将细胞悬浮在 1 ml 完全神经干细胞培养基中。由于我们有来自两个大脑的细胞，因此取 9 ml 完全神经干细胞培养基并转移到 15 ml 试管中。

混合从两个小鼠大脑获得的 1 ml 细胞。然后转移至装有 9 ml 完全神经干细胞培养基的 15 ml 试管中。然后加入 BFGF，终浓度为 10 ng/ml EGF，终浓度为 20 ng/ml，1 μL/ml 0.2% 肝素。

然后混合完全神经干细胞培养基中的细胞。用生长因子将 5 ml 悬浮液充分转移到每个 T 25 培养瓶中。通常，将从一个大脑获得的细胞接种到一个装有 5 ml 完全神经干细胞培养基的 T 25 培养瓶中。

含生长因子。标记每个培养瓶并转移至 37 摄氏度、含 5% CO 的培养箱中 7 至 10 天。7 到 10 天后，在显微镜下评估培养瓶。

此时，球体的直径应为 150 至 200 微米，并准备好通过。收集每个培养瓶的内容物并将其转移到 15 ml 锥形管中。离心管，去除上清液，将沉淀与 1 ml 预热胰蛋白酶混合，置于 37 度水浴中 3 分钟。

胰蛋白酶后，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂并充分离心混匀。再次去除上清液，将细胞重悬于 1 ml 完全 North 干细胞培养基中。取 10 微升细胞悬液，加入 90 微升三胺蓝中。

将悬浮液充分混合，并将 10 μL 将其转移到血细胞仪中。执行 cell Count。将总共 10 ml 完全护士干细胞培养基转移到 15 ml 试管中，以便能够接种两个 T 25 培养瓶。

然后混合细胞并加入适量的细胞，使总密度为每毫升 50， 000 个细胞或每 T 25 培养瓶 250， 000 个细胞。然后如前所述添加生长因子，包括 E-G-F-B-F-G-F 和肝素。混合悬浮液并转移至 T 25 培养瓶中，每个培养瓶的总体积为 5 MLS。

最后，将培养瓶放入 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中以生成球体。这是铺板后 3 天原代培养的一个例子。这是原代神经球培养的一个例子 七天后。

如您所见，有各种大小的球体。神经球呈相位明亮或明亮，并变得更加球形。随着尺寸的增加。

还有碎片。碎片的数量取决于多种因素，例如显微解剖和组织制备。碎片常见于原代成体神经球培养物中。

这些是通道的例子。7 天后 1 个成年神经球。同样，有大小不一的球体，但碎片要少得多。

球体的外围表现出微尖峰，这在健康的球体中很明显。如果让球体长得太大，它们可能会因细胞死亡而在中心变暗并且难以解离。我们希望您会发现此视频有用。

请记住，不要让球体长得太大，因为它们可能会附着在基质上并分化，而且很难将它们传代培养。您需要每 7 到 10 天传递一次长矛，具体取决于它们的大小和外观。祝你的实验好运。