使用 Amaxa Nucleofector 转染人类神经干细胞

您好，我是 Steve。我在加州大学欧文分校病理学系 Flanagan 博士的实验室工作。今天我将向您演示如何使用 Maxis 核因子转染人类神经前体细胞。

首先，您需要准备大量的细胞。建议至少准备一个完全汇合的 T25 培养瓶，因为本实验方案要求非常高的细胞密度，因此您至少需要一百万个细胞。首先，我将使用细胞解离缓冲液将细胞从培养表面脱离，然后进行细胞计数。

有关该操作步骤，请参见我的包装方案。在转染实验中，我之所以更倾向于使用amaxa，是因为amaxa为特定细胞类型开发了定制化的转染方案，就我而言，是针对神经干细胞的。该方案效果非常好。

它具有非常高的转染效率和非常高的细胞存活率。现在我们开始吧。接下来，我准备进行转染实验。

因此，在进行此次转染之前，我已将组织培养皿用纤维蛋白原过夜包被。之后，我在其中加入了生长培养基。目前，培养皿正放在培养箱中，等待加入细胞。

此外，我已经准备好了所有的试剂、DNA 载体以及转染溶液，它们目前都放在冰上待用。我已准备好开始进行转染实验。

因此这是M max核因子，在将其放入超净台之前，我将使用70%乙醇对其进行消毒，然后用纸巾擦拭干净。我刚刚已完成计数，总共获得400万个细胞，并将其接种。现在我已准备好开始转染。

首先，我将移除细胞所处的培养基。这里是我的细胞沉淀，接下来我会用抽吸法去掉其中的培养基。我会尽量彻底地移除所有培养基，因为我不希望在转染培养基中残留任何蛋白质等物质，以免影响转染实验的操作流程。

我已经去除了绝大部分培养基，现在将用 100 µL 特制的小鼠神经干细胞核因子溶液重悬该细胞沉淀。Mxa 公司提供一种用于转染小鼠神经干细胞的转染溶液，但他们没有针对人神经干细胞的产品；我们发现使用小鼠细胞的转染液效果非常好。因此，我将加入 100 µL 这种小鼠神经干细胞核效应物溶液。

我将充分重悬细胞沉淀，确保没有细胞团块残留，从而获得基本均匀的细胞悬液。因此，我将用移液器上下吹打约10次。

现在我认为我已经得到了一个相当均一的混合液，接下来我将把它转移到一个1.5 mL的离心管中。我使用的是P1000移液器，并确保将全部溶液转移进去。现在，我已将400万个细胞重新悬浮于小鼠转染溶液中，接下来我将加入5 µL的载体。

所以一直以来我都将其保持在冰上，直到现在。首先，我将吸取五微升。

现在我将使用一个设定为约50微升的P200移液器，将细胞与载体充分混匀。我将上下吹打10次。好的，这样就准备好了。

我已准备好进行转染。接下来，我将打开一个新的离心管，并取用 amaxa 公司提供的专用移液器。

因此，我将取下管盖，轻轻向上提拉此混合液。然后将移液枪完全插入管中，并缓慢挤出溶液。接下来，我将打开最大核因子，设置参数为 33 0 3 3，然后按回车键。

然后将电转杯放入电转杯架中，再旋转转轮，现在我已准备好进行转染。但在开始之前，我会确保预先准备好温热的培养基，以便在转染后立即加入到细胞中。转染结束后立即将温热的培养基加入电转杯中，有助于提高细胞的存活率。

现在我将准备一个 P 1000 移液器。同时，我还要取出目前正放在培养箱中的培养基，以便能够立即将细胞转移到培养基中。现在我再次按下回车键，操作完成。

如您所见，转染成功的一个标志是出现这层非常厚的气泡。接下来，我将向小管中加入500微升预热的培养基。这样就补充了细胞迫切需要的培养液，然后我将使用同一支MX移液枪将细胞从小管中转移出来。

因此，它们目前处于高度应激状态。所以，我将直接把它们放入更多预热的培养基中。最后一步，我将用更多预热的培养基冲洗Q vete，以确保所有细胞都被收集出来，然后将其放入同一孔L中，并立即将培养板放入培养箱中。

在此图像中，我们看到已转染一种进入细胞核因子的人类神经前体细胞，这些细胞被接种在带有网格的盖玻片上。即使在转染后两天，我们仍可通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达观察到约 50% 的转染效率。今天我向您展示了如何使用 Xis 核因子对人类神经前体细胞进行转染。

祝您的转染实验顺利。