Name: 人类神经干细胞转染与Amaxa Nucleofector (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学习使用Amaxa Nucleofector电穿孔技术转染人类神经干细胞的方法。该方案通过优化细胞密度和电穿孔条件，实现高效基因递送，为神经发育生物学研究提供可靠的技术基础。

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作者谨此感谢橙县研究学院儿童医院国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士提供 hNSPC 培养物。

注意：请参考 Passaging Human Neural Stem Cells 文章（<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a>）和 Counting Human Neural Stem Cells 文章（<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a>），了解如何重悬和计数 hNSPCs。
准备
<ol>
<li>确保有足够数量的细胞可用于转染（每种待转染的 DNA 需要数百万个细胞）。</li>
<li>在转染前一天晚上，用 10 µg/ml 人纤维连接蛋白包被组织培养皿，用于接种转染后的细胞。在开始转染实验前，移除纤维连接蛋白，用 PBS 清洗培养皿，并向其中加入培养基。将培养皿放入 37°C 组织培养孵箱中以预热培养基。同时，另取 1 ml 培养基放入孵箱中预热至 37°C。</li>
<li>将待转染的 DNA 以及转染溶液（来自 Amaxa）置于冰上。</li>
</ol>
转染
<ol>
<li>用 PBS 洗涤一定数量的细胞（我们通常每次转染使用约 5 × 10⁶ 个细胞）。通过离心（1000 rpm（约 200×g）离心 5 分钟）收集细胞，尽可能吸除 PBS，并将细胞沉淀重悬于 100 µl 转染试剂盒提供的转染溶液中。将细胞悬液转移至 1.7 ml 的离心管中。</li>
<li>向细胞悬液中加入 5 µl DNA（每次转染约 5–10 µg DNA），轻轻混匀。</li>
<li>使用 Amaxa 微量移液器将细胞-DNA 混合物转移至 Amaxa 转染杯中。确保下一步已准备好 1 ml 预热的培养基。同时，将含有培养基的细胞培养皿从培养箱中取出，放入组织培养超净台中。</li>
<li>将转染杯放入 Nucleofector 仪器中，顺时针旋转旋钮，选择程序“A-033”，然后按下 Enter 键。</li>
<li>成功的转染表现为转染杯溶液表面出现一层非常致密的气泡。向转染杯中加入 500 µl 预热的培养基，使用 Amaxa 微量移液器将转染后的细胞转移至含有预热培养基的培养皿中。用更多预热的培养基冲洗转染杯，并将冲洗液一并加入同一培养皿中。将含有细胞的培养皿放入 37°C 组织培养箱中继续培养。</li>
</ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

本方案描述了一种相对快速且高效的hNSPCs转染方法。采用此方法，我们获得的初始转染效率约为35%。通过该程序转染的细胞可用于短期研究（瞬时转染细胞），或在使用筛选剂以建立稳定转染细胞群体的情况下用于长期研究。我们已成功获得稳定转染的细胞，其中约70%的细胞表达外源蛋白。在瞬时转染的hNSPCs中，我们观察到外源蛋白的表达可持续约7天。

<table><tbody><tr><td>核转染装置</td><td>工具</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠神经干细胞核转染试剂盒</td><td>试剂</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 amaxa nucleofector 转染人类神经干细胞

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

转染原代哺乳动物神经细胞（如人神经干细胞/前体细胞，hNSPCs）时，使用常规阳离子脂质转染试剂常导致细胞存活率低且转染效率不佳。其他将目的基因导入细胞的物理方法，如“基因枪”或显微注射，也受限于细胞存活率低以及转染细胞数量少的问题。利用病毒载体将外源基因导入原代细胞的策略，则受到构建病毒载体所需时间长、劳动强度大以及潜在安全问题的限制。本文介绍一种使用Amaxa公司的Nucleofector电转染装置和技术对hNSPCs进行转染的逐步操作方案，该方案所采用的电脉冲参数和缓冲液体系均针对神经干细胞的转染进行了专门优化。使用本方案，我们实现了约35%的初始转染效率，并在稳定转染后达到约70%的效率。该方案包括：将大量hNSPCs与待转染的DNA在适当的缓冲液中混合，随后使用Nucleofector装置进行电穿孔。

将目的基因导入细胞是阐明其在体内功能的一种强大方法。本方案描述了一种利用Amaxa公司生产的Nucleofector电穿孔装置转染人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）培养物的高效方法。

使用 Amaxa Nucleofector 转染人类神经干细胞

转染原代哺乳动物神经细胞（如人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs））时，使用常规阳离子脂质转染试剂……

您好，我是 Steve。我在加州大学欧文分校病理学系 Flanagan 博士的实验室工作。今天我将向您演示如何使用 Maxis 核因子转染人类神经前体细胞。首先，您需要准备大量的细胞。建议至少准备一个完全汇合的 T25 培养瓶，因为本实验方案要求非常高的细胞密度，因此您至少需要一百万个细胞。首先，我将使用细胞解离缓冲液将细胞从培养表面脱离，然后进行细胞计数。有关该操作步骤，请参见我的包装方案。在转染实验中，我之所以更倾向于使用amaxa，是因为amaxa为特定细胞类型开发了定制化的转染方案，就我而言，是针对神经干细胞的。该方案效果非常好。它具有非常高的转染效率和非常高的细胞存活率。现在我们开始吧。接下来，我准备进行转染实验。因此，在进行此次转染之前，我已将组织培养皿用纤维蛋白原过夜包被。之后，我在其中加入了生长培养基。目前，培养皿正放在培养箱中，等待加入细胞。此外，我已经准备好了所有的试剂、DNA 载体以及转染溶液，它们目前都放在冰上待用。我已准备好开始进行转染实验。因此这是M max核因子，在将其放入超净台之前，我将使用70%乙醇对其进行消毒，然后用纸巾擦拭干净。我刚刚已完成计数，总共获得400万个细胞，并将其接种。现在我已准备好开始转染。首先，我将移除细胞所处的培养基。这里是我的细胞沉淀，接下来我会用抽吸法去掉其中的培养基。我会尽量彻底地移除所有培养基，因为我不希望在转染培养基中残留任何蛋白质等物质，以免影响转染实验的操作流程。我已经去除了绝大部分培养基，现在将用 100 µL 特制的小鼠神经干细胞核因子溶液重悬该细胞沉淀。Mxa 公司提供一种用于转染小鼠神经干细胞的转染溶液，但他们没有针对人神经干细胞的产品；我们发现使用小鼠细胞的转染液效果非常好。因此，我将加入 100 µL 这种小鼠神经干细胞核效应物溶液。我将充分重悬细胞沉淀，确保没有细胞团块残留，从而获得基本均匀的细胞悬液。因此，我将用移液器上下吹打约10次。现在我认为我已经得到了一个相当均一的混合液，接下来我将把它转移到一个1.5 mL的离心管中。我使用的是P1000移液器，并确保将全部溶液转移进去。现在，我已将400万个细胞重新悬浮于小鼠转染溶液中，接下来我将加入5 µL的载体。所以一直以来我都将其保持在冰上，直到现在。首先，我将吸取五微升。现在我将使用一个设定为约50微升的P200移液器，将细胞与载体充分混匀。我将上下吹打10次。好的，这样就准备好了。我已准备好进行转染。接下来，我将打开一个新的离心管，并取用 amaxa 公司提供的专用移液器。因此，我将取下管盖，轻轻向上提拉此混合液。然后将移液枪完全插入管中，并缓慢挤出溶液。接下来，我将打开最大核因子，设置参数为 33 0 3 3，然后按回车键。然后将电转杯放入电转杯架中，再旋转转轮，现在我已准备好进行转染。但在开始之前，我会确保预先准备好温热的培养基，以便在转染后立即加入到细胞中。转染结束后立即将温热的培养基加入电转杯中，有助于提高细胞的存活率。现在我将准备一个 P 1000 移液器。同时，我还要取出目前正放在培养箱中的培养基，以便能够立即将细胞转移到培养基中。现在我再次按下回车键，操作完成。如您所见，转染成功的一个标志是出现这层非常厚的气泡。接下来，我将向小管中加入500微升预热的培养基。这样就补充了细胞迫切需要的培养液，然后我将使用同一支MX移液枪将细胞从小管中转移出来。因此，它们目前处于高度应激状态。所以，我将直接把它们放入更多预热的培养基中。最后一步，我将用更多预热的培养基冲洗Q vete，以确保所有细胞都被收集出来，然后将其放入同一孔L中，并立即将培养板放入培养箱中。在此图像中，我们看到已转染一种进入细胞核因子的人类神经前体细胞，这些细胞被接种在带有网格的盖玻片上。即使在转染后两天，我们仍可通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达观察到约 50% 的转染效率。今天我向您展示了如何使用 Xis 核因子对人类神经前体细胞进行转染。祝您的转染实验顺利。

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人类神经干细胞转染与Amaxa Nucleofector

尽管基因修饰技术已取得近期进展，人类胚胎干细胞（HESCs）的转染仍是一个不稳定的过程。据我们所知，目前尚未有报道关于系统性且高效转染人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。本文中，我们描述了高效转染和核转染人类iPSCs的可靠方案。...

转染和核转染人诱导性多能干细胞

TALEN介导的靶向基因整合：利用工程化序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入hiPSCs

本视频展示了将基因修饰的造血祖细胞直接重编程为神经干细胞的过程。造血祖细胞表达的转录因子触发了一系列分子事件，促进其转化。随后使用特定的培养基来筛选并扩增诱导产生的神经干细胞。...

造血祖细胞直接重编程为神经干细胞

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。...

锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。...

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。...

人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。...

从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

学习使用Amaxa Nucleofector电穿孔技术转染人类神经干细胞的方法。该方案通过优化细胞密度和电穿孔条件，实现高效基因递送，为神经发育生物学研究提供可靠的技术基础。

使用 Amaxa Nucleofector 转染人类神经干细胞

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