Name: 测定在异种细胞表面的化学感应受体的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 学习利用活细胞染色技术在HEK293T细胞中检测化学感应受体的表面表达。该方法结合免疫荧光显微镜，为研究GPCR和异源细胞中的受体定位提供了可靠的实验方案。

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感谢Matsunami实验室成员对本文手稿的审阅。

1. 实验步骤：
该实验流程共需3天完成，分为三个步骤：细胞转移、转染和免疫细胞化学，每天进行一步。前两天的细胞转移和转染操作必须在超净台内的无菌条件下进行。
第1天：转移HEK293T细胞用于表面表达检测。
<ol>
<li>转移培养基（M10）：在无菌条件下，将最低必需培养基与10%（体积比）胎牛血清混合。</li>
<li>在100 mm培养皿中将细胞培养至所需汇合度，具体取决于需要准备的培养皿数量。确定待转移细胞的比例至关重要，以避免细胞过度生长或过于稀疏：例如，从一个100%汇合的100 mm培养皿中，可将约3%的细胞转移至35 mm培养皿，以获得后者约30%的汇合度。</li>
<li>在细胞转移前，于无菌超净工作台内，用无菌多聚赖氨酸（1 mg/mL）包被22 × 22 mm的玻璃盖玻片，并将每张盖玻片有包被面朝上放入各35 mm细胞培养皿中用于接种细胞（图1）。让溶液干燥5–10分钟。在此期间，可根据需要开启超净台内的紫外光源对盖玻片进行灭菌。多聚赖氨酸有助于异源细胞黏附于盖玻片表面。</li>
<li>转移细胞时，吸除100 mm培养皿中的原有培养基，小心加入8 mL无菌PBS洗涤，随后吸除PBS，并加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化；当细胞从皿底脱落时，加入5 mL M10以终止酶反应。吹打混悬细胞，并将所需体积转移至无菌锥形管中，在200×g离心5分钟以沉淀细胞。吸除含有胰蛋白酶-EDTA的上清液，保留细胞沉淀。为将细胞接种至35 mm培养皿，每皿加入1 mL M10，吹打重悬以充分分散细胞，然后向每皿加入1 mL重悬细胞液。于37°C、5% CO2条件下过夜培养。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="TLC流程图；显示样品点样、展开和显色的色谱方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 用多聚赖氨酸包被22 × 22 mm玻璃盖玻片，并将每张有包被面朝上放入各35 mm培养皿中。</li>
</ol>
第2天：转染HEK293T细胞。
<ol>
<li>转移后18-24小时，细胞即可用于待检测受体的转染。使用克隆于哺乳动物表达载体pCI中的受体和RTP1S，通过Qiagen Miniprep Kit从细菌培养物中提取，具体操作参照之前描述的方案4。使用N端带有20个氨基酸长视紫红质表位标签的受体，以利于免疫染色。</li>
<li>每次转染使用1000 ng受体构建体、250 ng RTP1S构建体和50 ng绿色荧光蛋白。按照生产商说明书，使用Lipofectamine 2000进行转染。</li>
</ol>
第3天：免疫细胞化学染色以可视化细胞表面标记的受体。
<ol>
<li>开始前，配制染色和洗涤溶液，并将其冷却至 4°C。染色液：最低必需培养基（Minimum Essential Medium），45 mL；胎牛血清（Fetal Bovine Serum），5 mL；HEPES（1M），500 μL（终浓度 10 mM）；叠氮化钠（Sodium Azide）（1.5M），500 μL（终浓度 15 mM）。洗涤液：HBSS，500 mL；HEPES（1M），5 mL（终浓度 10 mM）；叠氮化钠（Sodium Azide）（1.5M），5 mL（终浓度 15 mM）。上述两种溶液均可在 4°C 保存以供重复使用。将所需抗体用染色液稀释 100 倍，配制抗体溶液。</li>
<li>转染后约 24 小时开始进行气味受体的表面染色免疫化学实验。进行活细胞染色时，实验装置必须冷却至 4°C：准备一个较大的容器装满冰，并将冰面拍平以尽可能使其均匀；将一个托盘置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒托盘表面。裁剪一块略小于托盘长度的 Parafilm 膜，将其贴附于已喷洒乙醇的托盘表面，以获得光滑的操作平面。使用镊子逐个将含有转染细胞的玻璃盖玻片转移至 Parafilm 膜上，细胞面朝上。从盖玻片的一角小心地加入 100 μL 冷的初级染色液，使其覆盖整个盖玻片表面（图 2）。待所有盖玻片均覆盖抗体溶液后，盖上托盘以防止溶液在空气中干燥。在 4°C 下孵育 45–60 分钟。</li>
<li>初级孵育结束后，迅速将盖玻片转移回原 35 mm 培养皿中（内含培养基）。吸除培养基，从培养皿边缘轻轻加入 2 mL 预冷的洗涤液，避免因冲洗导致盖玻片上的细胞脱落。吸除洗涤液，重复此步骤两次，共完成三次洗涤。第三次洗涤结束后，保留洗涤液，不要吸除。</li>
<li>在染色液中配制二抗溶液，将盖玻片从洗涤液中转移至同一托盘中新贴附的 Parafilm 膜上。如同初级孵育步骤，从盖玻片一角小心地加入 100 μL 二抗溶液，使其均匀覆盖每个盖玻片。在 4°C 下孵育 30–45 分钟后，将盖玻片重新转移回原 35 mm 培养皿中的洗涤液中。再次按照前述方法清洗盖玻片三次。</li>
<li>最后一次洗涤后吸除洗涤液，加入 2 mL 预冷的 1% 甲醛溶液。将细胞在冰上用预冷的 1% 甲醛溶液固定 15 分钟。</li>
<li>使用封片剂 Mowiol 将盖玻片细胞面朝下封固于洁净的显微镜载玻片上，操作时需谨慎排除所有气泡（图 3）。待 Mowiol 表面干燥后，通过在表面滴加蒸馏水并立即吸除的方式轻轻清洗盖玻片。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="纳米涂层过程示意图，显示液体在基底表面沉积形成薄膜。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 图 2. 每个盖玻片上覆盖 100 μL 冷的初级染色液。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="载玻片制备过程，显微镜载玻片设置，逐步操作，样品压平，实验室技术。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 图 3. 使用 Mowiol 封片剂将盖玻片细胞面朝下封固于洁净的玻璃显微镜载玻片上。</li>
</ol>
2. 典型结果：
活细胞染色可实现对细胞表面蛋白的可视化观察，例如在共转染受体与分子伴侣时（本例中为气味受体 Olfr62 与受体转运蛋白 RTP1S）（图 4）。受体的细胞表面染色表现为点状染色模式（图 4B，插图）。若染色操作不当，可能导致背景噪声升高，使观察者难以区分真实的表面染色信号与噪声。 <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="利用 GFP 进行 Olfr62 和 RTP1S 表达分析的荧光显微镜成像结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 图 4. 受体与分子伴侣共转染后，可通过活细胞染色实现细胞表面蛋白的可视化。单独转染气味受体 Olfr62（A），以及共转染 Olfr62 与 RTP1S 分子伴侣（B）。GFP 表达水平用作转染对照（A' 和 B'）。

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

每一步操作都必须谨慎进行，以确保获得明显且特异的表面染色效果。整个染色过程必须在低温（冰上）进行，放置盖玻片的托盘在使用前必须预先冷却，以确保细胞保持存活状态。此外，固定步骤是在表面染色过程结束后进行的。这一点与胞内染色有显著区别：在胞内染色中，固定需在染色前完成，以便使细胞膜通透，利于一抗和二抗进入细胞。必须尽量减少盖玻片暴露于空气中的时间，防止细胞干燥；因此，在处理多个盖玻片时，向盖玻片上添加抗体溶液、将盖玻片转移至洗涤液、以及更换洗涤液等操作都应迅速完成，并逐一进行。
根据所使用的表位标签和抗体，可能需要调整孵育时间、洗涤次数以及抗体的稀释倍数。通过增加抗体稀释倍数、增加洗涤次数或缩短孵育时间，可以避免背景噪声。

<table><tbody><tr><td>盖玻片 22 × 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>含 L-谷氨酸、Earle&amp;rsquo;s 盐和碳酸氢盐</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 1×</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>不含钙和镁</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 35 × 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

在异源细胞中检测化学感受受体的表面表达

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

气味的丰富世界由嗅觉感知。小鼠的嗅觉由约1200种G蛋白偶联受体（GPCRs）1介导，这些受体被假定可结合挥发性气味分子，并通过与G蛋白Gαolf偶联，将胞外信号转化为胞内信号。气味分子与受体的结合被认为遵循组合编码原则，即一种气味分子可结合多个受体，而一个受体也可不同程度地结合多种气味分子2。对于大多数GPCRs，利用异源细胞已可方便地开展生化、信号转导及配体结合研究。然而，长期以来，异源细胞无法用于气味受体的研究，因为转染后这些受体无法有效转运至细胞表面。Saito等人已证明，单次跨膜的受体转运蛋白（Receptor Transporting Protein, RTP）家族分子伴侣在嗅觉感觉神经元中高表达，当与气味受体共转染时，可在异源细胞中促进气味受体向细胞表面的转运3。为了在异源细胞中开展受体的生化检测，首先必须确定该受体在细胞系中是否具有较强的表面表达。这可通过共过表达受体与分子伴侣RTP1S，随后进行活细胞染色，特异性地标记受体的胞外结构域或位于胞外结构域的标签，实现荧光检测。本文展示了一种可用于便捷检测HEK293T细胞表面气味受体的活细胞染色实验方案。此外，该方法也可用于其他化学感受受体或GPCRs表面表达的检测。

本文展示了一种用于活细胞染色的实验方案，可方便地检测气味受体在HEK293T细胞表面的表达。此外，该方法也可用于检测其他化学感受受体或G蛋白偶联受体（GPCRs）在细胞表面的表达。

气味的缤纷世界由嗅觉感知。小鼠的嗅觉由约1200种G蛋白偶联受体介导……

本实验的总体目标是演示如何通过在 HEK 293T 细胞中进行活细胞染色来检测化学感应受体在细胞表面的表达。该目标首先通过将细胞接种于培养皿中预先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被的盖玻片上实现。实验的第二步是在 HEK 293T 细胞中转染 DNA。第三步是使用一抗和荧光染料标记的二抗对活细胞进行染色。该实验步骤的最后一步是固定染色后的细胞并加盖盖玻片。最终，可通过免疫荧光显微镜观察到受体在细胞表面的定位结果。该方法使我们能够检测化学感受受体是否被转运至异源细胞（如 HEK293T 细胞）的细胞表面。本方法的可视化演示将展示为确保细胞存活并实现细胞自身染色所需严格遵循的关键步骤。初次使用该方法的研究人员可能会发现盖玻片的转移、操作和封片步骤较为困难。然而，经过数次练习后，该技术将变得容易掌握。采用使用 cgen 柱的改良方案，可纯化受体及受体的血浆 DNA。将运输蛋白 RT TP 的基因克隆至百万拷贝表达载体 PCI 中，以确保在免疫染色时，受体蛋白在 C 末端带有由 20 个氨基酸组成的短表位标签，从而促进细胞的黏附。用每毫升一毫克的多聚赖氨酸对盖玻片进行编码处理，将盖玻片放置于35毫米细胞培养皿中，涂层面朝上，在无菌超净台内自然晾干。将HTK293T细胞以约30%的密度接种于1毫升M10培养基中，确保盖玻片与培养皿之间无气泡残留，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育18至24小时。每次转染前，配制DNA混合物，包含1000纳克受体质粒、250纳克RTP1s质粒和50纳克GFP质粒。根据制造商说明书，使用lipectomy 2000转染细胞。通过向M 10中添加叠氮化钠和hippies制备染色液。该染色液可在4°C保存数月。接下来，配制含有15毫摩尔叠氮化钠和10毫摩尔HEPES的洗涤缓冲液。该洗涤缓冲液在冷的HBSS中可于4摄氏度保存数月。为了在低温条件下进行染色，请准备一个装有parfum的托盘并置于冰上冷却5分钟。将转染细胞的玻璃盖玻片从盖玻片边缘小心转移至多聚甲醛中，细胞面朝上。在染色液中加入100 µL冷的稀释后的一抗，轻柔滴加。室温孵育60分钟。随后，在原始的35 mm培养皿中，通过交替加入和吸出冷洗涤液的方式洗涤细胞。重复两次。同样，加入SI三抗，孵育30分钟。在35毫米培养皿中洗涤三次。最后，用预冷的1%多聚甲醛溶液固定细胞，注意避免产生气泡。用移液器吸取适量封片剂，将盖玻片细胞面朝下封固在显微镜载玻片上，并用蒸馏水冲洗盖玻片表面，以去除盐结晶沉积。通常情况下，使用OL FFR 62和RTPs进行单细胞表面受体染色时，会观察到偶联抗体产生的荧光信号呈点状分布。掌握该技术后，可在短短两个半小时至三小时内完成32至40个盖玻片的染色。在同时处理多个盖玻片时，为防止细胞干燥，必须逐个转移并开始抗体孵育。

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神经科学

测定在异种细胞表面的化学感应受体的表达

来源：de March, C. A. 等. 气相气味分子对体外气味受体激活的实时监测。J. Vis. Exp.

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