用于研究透明质酸与癌细胞相互作用的微图案化表面

癌症的侵袭和进展涉及一种模态细胞表型，该表型受到肿瘤微环境中生长因子、细胞因子及细胞外基质成分的复杂调控。透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种间质细胞外基质成分，已知可通过增强肿瘤细胞的侵袭性生长以及血管生成来促进肿瘤进展，这一过程涉及HA与其细胞表面受体的相互作用。CD44是HA的主要受体，其介导的信号转导事件可促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，从而增加转移扩散。本研究旨在探讨外源性HA对癌细胞黏附、迁移和生长的影响。

采用标准光刻技术制备具有微图案的弹性体印章，随后利用该印章在玻璃基底上形成氨基硅烷分子的图案化阵列。接着通过碳二亚胺化学反应将透明质酸（HA）共价连接至微图案化的氨基硅烷表面，从而形成HA的微图案。随后可将培养的癌细胞接种于HA微图案上，利用光学显微镜、扫描电子显微镜或免疫荧光显微镜等高分辨率成像技术，观察癌细胞与外源性透明质酸之间的相互作用。

本视频文章中介绍的微图案羟基磷灰石（HA）表面制备方法，有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如进一步阐明外源性透明质酸在癌症进展中的作用。为制备用于在载玻片上压印HA的微图案聚甲基硅烷（Polymethyl Zane）或聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，首先使用镊子夹取一片新的硅片。

然后在实验台水槽上方，使用洗瓶用乙醇冲洗晶圆，并用气流吹干。关闭室内灯光。

然后使用镊子将晶圆转移至匀胶机中，用移液管盖住至少80%的晶圆表面，并涂覆SU-2025负性光刻胶，先以600 RPM转速旋涂10秒，再以3000 RPM转速旋涂30秒。接着将涂有光刻胶的晶圆转移至加热板上，在95摄氏度下前烘3分钟。随后从加热板上取下晶圆，静置冷却1分钟。

将带有目标图案的预制掩模置于涂有光刻胶的晶圆上方，并用紫外光照射 20 秒。随后，将晶圆转移至加热板，在 110 °C 下硬烘 6 分钟。

打开光源，从加热板上取下晶圆。此时应使用移液管可见明显的图案。用SU-8光刻胶显影液冲洗三次后，再用显影液小心冲洗晶圆，最后用乙醇冲洗。

如果有白色残留物存在，用光刻胶显影液重复冲洗，或直接将晶圆浸入显影液中两分钟，然后再次用乙醇冲洗，再用水清洗，并用大口径吹气装置中的气流吹干。对于本实验所示的晶圆，按10:1的质量比混合PDMS弹性体溶液与固化剂，22克已足够。将混合液倒入离心管中，在900 RPM转速下离心五分钟。

为去除任何气泡，将带有图案的晶圆放入大小合适的培养皿中。倒入足量的PDMS溶液，使其完全覆盖晶圆，厚度约为四分之一英寸。如果晶圆表面存在气泡，将其置于真空干燥器中，直至气泡消失。

在室温下固化过夜，以形成互补的弹性印章。如果PDMS在12小时后仍未完全固化，将晶圆置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟。小心地将PDMS从晶圆上剥离。

然后使用剃刀将印章切割至所需尺寸。将印章放入盛有乙醇的玻璃容器中，最好置于塑料支架内，超声处理15分钟。这些硅片可多次使用，以制备新的弹性印章，从而在玻璃表面特定区域共价固定ha。

首先，根据随附文本中的说明，使用等离子清洗仪清洁所有待用载玻片。载玻片清洗完毕后，用镊子将其从等离子清洗仪中取出，放入塑料培养皿中，备用。

接下来，在15毫升聚苯乙烯离心管中配制用于点样到玻片上以结合透明质酸（HA）的氨基硅烷溶液。用95%体积分数的乙醇新鲜配制5毫升总体积、3%体积分数的3-氨基丙基三甲氧基硅烷（A-P-T-M-S）溶液，在室温下静置反应5分钟。

在此期间，A-P-T-M-S 通过水解反应转化为一种醇。接着，仅接触边缘，将 PDMS 印模图案朝上放置于旋涂机卡盘上。使用移液管将 A-P-T-M-S 覆盖于图案表面。

然后以3,500 RPM的转速将A-P-T-M-S在印章表面旋涂30秒。将PDMS印章从旋涂机中取出后倒置，使图案面朝下，将PDMS印章的一端置于载玻片中心，并轻轻按压，使整个印章与载玻片表面完全接触，持续一分钟。接着，轻轻取下PDMS印章，让带有A-P-T-M-S图案的载玻片在室温下静置。

30分钟后，用乙醇冲洗图案表面，并用气流吹干。将PDMS印章超声处理15分钟，以去除多余的A-P-T-M-S。然后将载玻片置于115摄氏度的加热板上加热一小时，以烘干表面并除去多余水分。

用乙醇冲洗，并用镊子夹住以空气吹干。将带有图案的载玻片转移至玻璃培养皿中。使用移液管将新配制的聚乙二醇（PEG）或PEG衍生物溶液完全覆盖在载玻片表面，该溶液将作为包围图案的非黏附区域。

在75摄氏度孵育45分钟后，倒掉多余的聚乙二醇盐水溶液。然后用镊子夹住玻片，先用甲苯冲洗图案化玻片表面，再用水冲洗，最后用气流吹干。将玻片置于加湿的玻片盒中。

然后将盒子放入生物安全柜中，并打开紫外灯照射一小时，进行杀菌消毒。自此步骤开始，后续操作均应在生物安全柜内进行。为保持操作台外部无菌，配制一毫升10毫摩尔的无菌水性透明质酸溶液。

一种乙基-三-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC），浓度为5毫摩尔，以及羟基琥珀酰亚胺（hydroxy CIN aide）和50微克/毫升。无菌荧光素标记的透明质酸（HA）EDC是一种零长度交联剂，可与透明质酸的羧基反应生成胺反应性中间体。由于该中间体易发生水解，因此加入NHS以提高碳二亚胺反应效率。

接下来，将200微升无菌HA溶液分装液滴加至图案化玻璃表面，直至覆盖整个图案区域。然后关闭载玻片盒，以保护载玻片免受光照。由于HA溶液会与微图案化的A-P-T-M-S中的伯胺发生反应，在HA中间体与A-P-T-M-S的伯胺之间形成稳定的MI键，因此应将图案化基底置于超净台中静置16至24小时，期间避免扰动。

第二天使用APA移液管吸除HA溶液。用PBS洗涤载玻片，然后在表面覆盖含1% BSA的PBS溶液，孵育一小时。此时表面已准备好用于细胞培养。

将HA微图形表面置于无菌培养皿中，用于在HA微图形表面上进行细胞培养。在1毫升细胞培养基中，以每18.75平方厘米玻璃表面接种0.4至1×10⁶个癌细胞的密度，加入单细胞悬液，小心覆盖玻片表面。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿化培养箱中。注意避免培养基溢出，细胞应在24小时内完成贴壁，可通过倒置光学显微镜观察确认。

细胞培养表面可维持长达五天。在标准培养箱条件下，每隔一天更换一次培养基。可使用倒置光学显微镜观察细胞形态和生长情况。

随后可应用其他细胞检测方法来分析此处示例中细胞对HA表面的响应。通过荧光显微镜观察并成像可视化HA图案表面。J荧光强度分析表明HA的图案发生解聚。

HA微图案表面可用于研究癌细胞与外源性HA的相互作用。图中展示了癌细胞在HA微图案表面上的黏附情况。结肠癌和乳腺癌细胞在培养24小时后均优先黏附于HA斑块区域。利用扫描电子显微镜进行高分辨率成像，可用于分析培养细胞与固定化HA表面之间的相互作用。

在此扫描电子显微照片中，可见结肠癌细胞与HA的相互作用，右侧显示更高放大倍数下的图像。此处展示了在HA表面培养的乳腺癌细胞，右侧同样显示更高放大倍数下的图像。该分析明确表明存在黏附性突起，这些突起可增强癌细胞在HA微图案上的铺展。

观看本视频后，您应能充分了解如何制备 HA 微图案表面，并将其应用于研究癌细胞的响应。