Name: Micropatterned表面透明质酸与肿瘤细胞相互作用的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习利用微接触印刷和碳二亚胺化学技术制备透明质酸微图案表面，用于研究肿瘤细胞与透明质酸的相互作用。该方法结合高分辨率成像技术，有助于深入理解肿瘤微环境中透明质酸在癌症进展中的作用机制。

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作者感谢约翰斯·霍普金斯大学表面分析实验室的使用支持，该实验室由美国国家科学基金会资助，作为材料研究科学与工程中心的一部分。LED 是 IGERT 培训项目学员及美国国家科学基金会研究生奖学金获得者。本研究部分由美国国立卫生研究院资助项目 U54CA143868 支持。

1. 用于微图形印章制备的标准光刻法
<ol>
<li>用乙醇冲洗新的硅片，并用气流吹干。在整个过程中使用镊子操作硅片，以防止表面产生缺陷。</li>
<li>将硅片转移至旋涂仪，并在其表面覆盖 SU-2025 负性光刻胶。光刻胶应覆盖至少 80% 的硅片表面。先以 600 rpm 旋涂 10 秒，再以 3000 rpm 旋涂 30 秒。由于光刻胶对光敏感，从此时起应关闭室内照明。</li>
<li>将涂有光刻胶的硅片转移至加热板，在 95°C 下进行“前烘”3 分钟。从加热板上取下后，静置冷却 1 分钟。</li>
<li>将带有目标图案的预制掩模置于涂有光刻胶的硅片表面，并用紫外光（UV，350–450 nm）照射 20 秒。</li>
<li>将硅片转移回加热板，在 110°C 下进行“后烘”6 分钟。</li>
<li>打开灯光，将硅片从加热板上取下。此时应可观察到清晰的图案。</li>
<li>用 SU-8 光刻胶显影液小心冲洗硅片。用显影液冲洗 3 次后，再用乙醇冲洗。若仍有白色残留物，可重复使用光刻胶显影液冲洗，或直接将硅片浸入显影液中 2 分钟，随后再次用乙醇冲洗。最后用水清洗并用气流吹干。</li>
<li>按 10:1 的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶液与固化剂。在 900 rpm 下离心 5 分钟，以去除气泡。</li>
<li>将带有图案的硅片放入培养皿中，将 PDMS 倒在硅片上。若存在气泡，将其置于真空干燥器中抽真空数分钟，直至气泡消失。</li>
<li>在室温（RT）下固化过夜，形成互补的弹性体印章。若 12 小时后 PDMS 仍未完全固化，可将其置于 60°C 烤箱中加热 30 分钟。</li>
<li>小心地将 PDMS 从硅片上剥离。使用刀片边缘将印章切割至所需尺寸。在乙醇中超声处理 15 分钟。硅片可多次重复使用，以制备新的弹性体印章。</li>
</ol>
2. HA 微图案化
<ol>
<li>将载玻片放入等离子清洗仪中清洗5分钟。将所有载玻片放入腔室并抽真空5分钟，然后让少量氧气进入腔室。开启等离子清洗仪清洗5分钟。用镊子将载玻片从等离子清洗仪中取出，并放入培养皿中。</li>
<li>在进行等离子清洗的同时，将PDMS印章在乙醇中超声处理15分钟。</li>
<li>在15 mL离心管中配制新鲜的3% v/v 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）的95% v/v乙醇溶液。室温下反应5分钟，使其形成硅醇。</li>
<li>将PDMS印章图案面向上固定在旋涂仪卡盘上，并将APTMS溶液覆盖于图案表面。以3500 rpm旋涂30秒。操作时仅接触PDMS印章的侧面，避免触碰图案表面。</li>
<li>将APTMS溶液转移至经等离子清洗的玻璃表面：将印章图案面朝下置于玻璃一端，轻轻滑动并按压PDMS，使其完全与玻璃表面接触，持续1分钟。</li>
<li>轻柔取下PDMS印章，将带有图案的载玻片在室温下孵育30分钟。用乙醇冲洗图案表面，并用空气干燥。将PDMS印章再次超声处理15分钟，以去除残留的APTMS。</li>
<li>将表面在烘箱或加热板上于115°C加热1小时。用乙醇冲洗，并用空气干燥。</li>
<li>配制新鲜的20% v/v聚乙二醇（PEG）-硅烷溶液，即2-[甲氧基(聚乙二醇)丙基]三甲氧基硅烷的甲苯溶液。该溶液将作为包围图案区域的非黏附区域。</li>
<li>将带有图案的载玻片转移至玻璃培养皿中，在加热板上75°C条件下于PEG-硅烷溶液中孵育45分钟。依次用甲苯、水冲洗，并用空气干燥。</li>
<li>在生物安全柜中使用紫外杀菌照射消毒1小时。此后所有操作均应在生物安全柜中进行，以保持无菌状态。</li>
<li>配制无菌的透明质酸（HA）水溶液。 
10 mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC） 
5 mM N-羟基琥珀酰亚胺 
50 μg/mL 荧光素标记的HA</li>
<li>在无菌条件且避光的情况下，将HA溶液滴加到带有图案的玻璃基底上。图案化基底应静置16–24小时，避免扰动。</li>
<li>吸除HA溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后在PBS中加入1%牛血清白蛋白（BSA），覆盖表面并孵育1小时。此时表面已准备好用于细胞培养。</li>
</ol>
3. 在HA微图案化表面上进行细胞培养
<ol>
<li>根据制造商说明书培养 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞和 LS174T 结直肠癌细胞。</li>
<li>将癌细胞的单细胞悬液以每 18.75 cm2 玻璃表面积 0.4 至 1×106 个癌细胞的密度接种到固定化的透明质酸（HA）表面。在加湿培养箱（37 °C）中孵育，维持 5% CO2 的气体环境。细胞黏附应在 24 小时内发生，可通过倒置光学显微镜观察。</li>
<li>细胞培养表面在标准培养箱条件下可维持长达 5 天。每隔一天更换一次培养基。可通过倒置光学显微镜观察细胞形态和生长情况。可应用其他细胞检测方法分析细胞对 HA 表面的响应。</li>
</ol>
4. 代表性结果：


用于将透明质酸（HA）共价固定到APTES图案化玻璃载片上的碳二亚胺化学反应如图1A所示。EDC是一种零长度交联剂，可与HA的羧基反应生成胺类反应性中间体。由于该中间体易发生水解，因此加入NHS以提高碳二亚胺反应效率。当HA溶液与APTES微图案相互作用时，HA中间体与APTES的伯胺基团之间形成稳定的酰胺键。使用荧光显微镜观察HA图案化表面的示例以及ImageJ荧光强度分析结果展示了HA的图案化固定效果（图1B-C）。
HA 微图案化表面可用于研究癌细胞与外源性 HA 的相互作用。MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系和 LS174t 人结肠癌细胞系均优先黏附于 HA 微图案化区域（图 2）。利用扫描电子显微镜进行高分辨率成像，可用于分析培养细胞与固定化 HA 表面之间的相互作用（图 3）。
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="表面图案化示意图；μCP、PEG、HA在玻璃基底上；荧光显微镜图像；3D原子力显微镜（AFM）数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 透明质酸（HA）微图案化表面。（A）HA功能化表面构建过程的示意图；（B）荧光素（绿色）标记的HA微图案化表面的荧光图像；（C）使用ImageJ软件生成的3D像素分布图，显示离散的HA图案。比例尺 = 100μm。经Elsevier许可改编自9。
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="细胞生长比较显微图像，显示不同汇合度下的两种细胞培养物，实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 癌细胞在透明质酸微图案化表面的黏附。结肠癌（A）和乳腺癌（B）细胞在培养24小时后优先黏附于透明质酸（HA）斑块区域。经Elsevier许可改编自9。
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="扫描电镜显示细胞形态；A和B的两个放大倍数指示结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 癌细胞与HA的相互作用。（A）结肠癌细胞（A）在HA表面培养后的扫描电镜图像，左图为低倍放大，右图为高倍放大（左图方框区域）；乳腺癌细胞（B）在HA表面培养后的扫描电镜图像，左图为低倍放大，右图为高倍放大（左图方框区域）。

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

本文介绍的透明质酸（HA）微图形化方法可用于研究细胞与外源性HA的相互作用。已知HA在癌症进展中发挥关键作用1，但针对癌细胞在二维HA图案化表面相互作用的研究仍十分有限。对外源性HA微图案进行可控性研究，可实现对癌细胞黏附、生长和迁移的高分辨率可视化观察，有助于进一步阐明癌症发生发展的基本机制。
通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，我们开发了具有明确透明质酸（HA）图案的表面，用于研究癌细胞的相互作用。该方法可制备出图案一致的表面，适用于细胞培养及多种分析技术，包括但不限于免疫荧光染色、扫描电子显微镜观察、抑制实验、迁移实验等。
此外，光刻技术可轻松实现任意所需图案的微加工，从而控制透明质酸（HA）在特定应用中的固定化。例如，制备具有线性条纹的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，可将HA以线性阵列形式固定，有助于分析细胞沿图案化HA的迁移行为。
尽管我们主要利用该方法阐明癌细胞与透明质酸（HA）的相互作用，但该技术同样适用于研究其他细胞类型与HA...

<table><tbody><tr><td>SU-2025 光刻胶</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨丙基三甲氧基硅烷 (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [甲氧基(聚乙二醇)丙基] 三甲氧基硅烷 (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记透明质酸 (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>用 10 ml 去离子水重悬</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳腺癌细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t 结肠癌细胞</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究透明质酸与癌细胞相互作用的微图案化表面

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

癌症的侵袭与进展涉及一种运动性细胞表型，该表型受到肿瘤微环境中生长因子/细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的复杂调控。透明质酸（HA）是一种间质ECM成分，已知可通过增强肿瘤细胞的侵袭、生长和血管生成来促进肿瘤进展1。HA与其细胞表面受体CD44相互作用，可触发一系列信号转导事件，促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，从而增加转移扩散的风险2-3。HA是一种带负电荷、非硫酸化的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖重复单元组成。由于其重复的二糖单元上含有羧基和羟基，天然HA具有较强的亲水性，并易于进行化学修饰，例如引入硫酸基团以实现光反应性固定4-5。以往关于将HA固定于表面的研究，利用了HA及其硫酸化衍生物的生物抗性特性，以调控细胞在表面的黏附行为6-7。在这些研究中，细胞优先黏附于非HA图案化区域。
为了分析细胞与外源性透明质酸（HA）的相互作用，我们开发了具有图案化的功能化表面，可实现对癌细胞与HA相互作用的可控研究及高分辨率可视化。我们采用微接触印刷技术（uCP）在玻璃表面定义出离散的HA图案区域。通过“锚定”策略，利用碳二亚胺交联化学法将HA固定在表面8。玻璃表面经氨基硅烷微接触印刷后，与含有优化比例的EDC和NHS的HA溶液反应，从而在图案化阵列中实现HA的固定。将碳二亚胺化学法与mCP技术结合，可将HA特异性地固定在预定区域，制备出适用于体外（in vitro）研究的表面。结肠癌细胞和乳腺癌细胞均可自发地与HA微图案表面发生相互作用。癌细胞在24小时内发生黏附，并在48小时内出现增殖。利用HA微图案表面，我们证实癌细胞的黏附是通过HA受体CD44介导的。此外，HA图案化表面适用于扫描电子显微镜（SEM）观察，可对癌细胞在HA图案上的黏附突起和铺展进行高分辨率成像，从而分析癌细胞在外源性HA上的运动能力。

介绍了一种可实现癌细胞与外源性透明质酸（HA）相互作用高分辨率分析的新方法。通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，制备出图案化表面。

癌症的侵袭与进展涉及一种具有迁移能力的细胞表型，该表型受到生长因子/细胞因子以及细胞外基质的复杂调控……

癌症的侵袭和进展涉及一种模态细胞表型，该表型受到肿瘤微环境中生长因子、细胞因子及细胞外基质成分的复杂调控。透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种间质细胞外基质成分，已知可通过增强肿瘤细胞的侵袭性生长以及血管生成来促进肿瘤进展，这一过程涉及HA与其细胞表面受体的相互作用。CD44是HA的主要受体，其介导的信号转导事件可促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，从而增加转移扩散。本研究旨在探讨外源性HA对癌细胞黏附、迁移和生长的影响。采用标准光刻技术制备具有微图案的弹性体印章，随后利用该印章在玻璃基底上形成氨基硅烷分子的图案化阵列。接着通过碳二亚胺化学反应将透明质酸（HA）共价连接至微图案化的氨基硅烷表面，从而形成HA的微图案。随后可将培养的癌细胞接种于HA微图案上，利用光学显微镜、扫描电子显微镜或免疫荧光显微镜等高分辨率成像技术，观察癌细胞与外源性透明质酸之间的相互作用。本视频文章中介绍的微图案羟基磷灰石（HA）表面制备方法，有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如进一步阐明外源性透明质酸在癌症进展中的作用。为制备用于在载玻片上压印HA的微图案聚甲基硅烷（Polymethyl Zane）或聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，首先使用镊子夹取一片新的硅片。然后在实验台水槽上方，使用洗瓶用乙醇冲洗晶圆，并用气流吹干。关闭室内灯光。然后使用镊子将晶圆转移至匀胶机中，用移液管盖住至少80%的晶圆表面，并涂覆SU-2025负性光刻胶，先以600 RPM转速旋涂10秒，再以3000 RPM转速旋涂30秒。接着将涂有光刻胶的晶圆转移至加热板上，在95摄氏度下前烘3分钟。随后从加热板上取下晶圆，静置冷却1分钟。将带有目标图案的预制掩模置于涂有光刻胶的晶圆上方，并用紫外光照射 20 秒。随后，将晶圆转移至加热板，在 110 °C 下硬烘 6 分钟。打开光源，从加热板上取下晶圆。此时应使用移液管可见明显的图案。用SU-8光刻胶显影液冲洗三次后，再用显影液小心冲洗晶圆，最后用乙醇冲洗。如果有白色残留物存在，用光刻胶显影液重复冲洗，或直接将晶圆浸入显影液中两分钟，然后再次用乙醇冲洗，再用水清洗，并用大口径吹气装置中的气流吹干。对于本实验所示的晶圆，按10:1的质量比混合PDMS弹性体溶液与固化剂，22克已足够。将混合液倒入离心管中，在900 RPM转速下离心五分钟。为去除任何气泡，将带有图案的晶圆放入大小合适的培养皿中。倒入足量的PDMS溶液，使其完全覆盖晶圆，厚度约为四分之一英寸。如果晶圆表面存在气泡，将其置于真空干燥器中，直至气泡消失。在室温下固化过夜，以形成互补的弹性印章。如果PDMS在12小时后仍未完全固化，将晶圆置于60摄氏度的烘箱中加热30分钟。小心地将PDMS从晶圆上剥离。然后使用剃刀将印章切割至所需尺寸。将印章放入盛有乙醇的玻璃容器中，最好置于塑料支架内，超声处理1

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一种具有间质流的光聚合透明质酸-胶原侵袭性胶质瘤微环境模型

学习利用微接触印刷和碳二亚胺化学技术制备透明质酸微图案表面，用于研究肿瘤细胞与透明质酸的相互作用。该方法结合高分辨率成像技术，有助于深入理解肿瘤微环境中透明质酸在癌症进展中的作用机制。

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