利用周期性单轴应变对干细胞进行机械刺激

您好，我是宋力（Song Li），加州大学伯克利分校生物工程系的副教授。我是凯尔·卡平斯基（Kyle Kapinsky），加州大学伯克利分校生物工程专业的博士研究生。

今天我们将介绍一种利用周期性单轴应变对干细胞进行机械刺激的实验方案。我们实验室的研究重点是细胞与组织工程，尤其是心血管系统相关领域。我们对干细胞的力学生物学特性感兴趣，因为其具有若干潜在的应用价值。

其一是我们希望了解机械因素对发育过程的影响，例如胚胎发育。其二是我们关注如何在体外或肠道反应中控制干细胞的分化。第三，我们感兴趣的是干细胞在体内对心血管机械因素的响应，例如移植后的情况。

为了研究上述所有因素，我们设计了一种定制的生物反应器，可在其中将细胞接种到弹性膜上，随后在特定时间内，以特定应变和特定应变率对这些膜进行拉伸。接下来，我们将逐步介绍实施该实验方案所需的所有操作步骤。使用实验室用肥皂（任何洗涤剂均可），在膜的两侧涂抹肥皂，充分擦洗，以清除膜表面可能存在的任何碎片或污染物，避免任何可能干扰细胞生长的物质残留。

我仅用手进行此操作。当我觉得两侧都已清理得比较干净后，再用清水冲洗一次。接下来，我需要确保其完全无菌，并去除所有微小颗粒物。

因此，我将取此膜并将其放入含有70%酒精的烧杯中，确保完全浸入。随后，可将整个烧杯放入超声仪中，超声处理10分钟。

现在，我们将微图案膜放入方形培养皿后，需要进行验证，以确保图案面确实朝向我们。因此，我将用一个装有酒精的喷瓶，轻轻喷洒在膜的上表面。现在你可以看到液体正向下流动，并显现出那些沟槽结构。

因此可以确认，图案面朝上，且已正确放置方向。现在我们已完成过夜紫外照射步骤，可以看到所有腔室、腔室框架以及膜本身均已放置在生物安全柜内，并已在紫外线下静置过夜。这是我们的最终灭菌步骤。

现在，我需要对所有膜进行等离子体处理，我将一次取出一到两张膜，保持在无菌培养皿中，并将其转移至等离子体处理仪。现在真空压力已释放，我可以打开腔室。需要再次说明的是，此过程并非完全无菌，但稍后我们会再次进行处理。

因此，为了使血浆保持在原位，需要相对快速地操作，此时应使用镊子。再次强调，这一步骤非常关键：务必确保不要掉落膜或改变其方向。

目前，只有膜的上表面经过了等离子体处理，我将把它重新放回相对无菌的培养皿中，使经等离子体处理的一面朝上，盖上盖子，然后转移到超净台中。现在膜已经完成等离子体处理，我将把它放回超净台内，并用2%的明胶（质量体积比）进行处理。

可以看出，溶液仍然沿着图案的方向向外扩散。由于经过了等离子体处理，该表面具有很强的亲水性，因此溶液会铺展开来，而不会形成液滴。如果你不小心将膜的朝向放反了，溶液会立即在表面铺展，你就会意识到自己弄错了膜的处理面。

因此，请确保溶液均匀铺开。完成所有膜的处理后，只需关闭通风橱并开启紫外线照射30分钟。此时，膜表面覆盖的明胶已在紫外线下作用半小时，时间足以使明胶充分吸附至膜表面。

此时，我想用无菌 PBS 将膜清洗两次。我通常在方形培养皿中加入约 10 mL PBS，用手轻轻晃动进行洗涤，注意避免触碰膜的表面，然后吸去 PBS。我会重复此步骤一次。第二次清洗后，将膜保留在 PBS 中，这有助于润滑膜，使其更容易装入培养室。如果让膜变干，膜更容易撕裂或破损。

这是第二次洗涤。再次抽吸一次，以确保膜上的所有明胶都被去除。然后将膜置于约10毫升无菌PBS中。

如果同时处理多张膜，请对每一张膜重复此过程。完成之后，即可进行组装。取一个框架，该框架实际上由两个部件组成，但通常已预先组装好。

其中一块是这里的 T 形部件，另一块是框架的一部分，用于固定膜本身。因此，框架还有第二个部件，形状如下所示。可以看到它上面有这样一个凹槽。

垫圈将插入此处以固定膜的位置。第二个部件具有用于另一个垫圈的第二条凹槽，以便固定膜的两侧。取此部件，将其如此放置在框架上，翻转框架，然后取一个高压灭菌螺丝。

将螺丝插入顶部，可先用手稍微拧紧，然后再使用六角扳手将其完全拧紧。此时，我已经组装好了框架，膜将像这样覆盖在框架的底面，就好像我的手是膜一样。这意味着我需要将经过图案化处理、或经过等离子体处理以及明胶处理的一侧朝下。

我希望图案面朝上放置。因此，如果我不小心将其翻转，导致明胶面朝下，这将对实验造成严重问题。因此，在组装时，我需要让图案面朝上，但实际组装时我会先倒置进行。

因此，当我取出膜时，需确保有图案的一面朝下。取一张膜，记住此时有图案的一面是朝上的。我将其从PBS中取出，并像这样铺在支架上。

目前两侧基本持平。可以用手指触碰膜的边缘，但尽量不要触碰另一侧。现在我已将其这样翻转过来，图案面朝下，这有利于更方便地进行组装。取两个垫圈并放入 PBS 中。

我通常将其来回滚动。这样可以润湿整个垫圈，就像我用 PBS 润滑膜一样，使垫圈得到润滑。如果在干燥的膜中使用干燥的垫圈，就更容易发生错位或滚动。

我开始操作时，会先将一侧稍微拉得比另一侧更长一些，因为当你插入垫圈时，如果我从这一侧插入垫圈，它会将膜往这个方向拉，导致另一侧变得稍短。因此，先从一个略微缩短的一端开始。取一个垫圈，将其横向放置，使两侧长度大致相等。

然后用均匀的压力按压，使用拇指或拇指尖，但此时不要用指甲，因为容易意外划破膜并将其撕裂。因此，插入后，我实际上会取用镊子的背面，用它来向下按压。同样要注意，不要用力过猛或打滑而触碰到膜，因为此时可能意外将其划伤或撕裂，一旦发生这种情况，就必须更换新的膜并重新开始。

现在一侧已经插入，但另一侧仍然松动。因此，将装置翻转，取另一个垫圈，确保其湿润，并像之前一样将其放置在上方。然后，我通常使用镊子夹住膜并稍微拉伸，因为如果膜太松，就会产生过多松弛，导致无法观察到细胞。

因此，你需要让膜保持紧绷，但不要过度拉伸。如果预先拉伸，会影响实验结果，因为膜本身已经处于张力状态，容易撕裂；当你压下垫圈时，会施加一点张力。此时，膜看起来已经相当紧绷了。

可能一侧有点松，但我会马上调整。再次使用均匀的压力，仅用拇指尖或手指尖轻轻按压。此时你可以看到一侧已经相当紧绷了。

它完全平直地延伸到另一侧。膜在那个位置有一点松弛，会微微卷起。因此，我将像之前一样，缓慢而均匀地将这一侧完全压入垫圈中。

可以看到，这样已基本消除了其中的松弛部分。我们刚刚完成了对框架和膜背面30分钟的紫外照射，现在需要将所有膜翻转过来，以便对正面进行紫外照射，确保所有表面完全无菌。此时，我们还将指定某些腔室用于拉伸实验或作为对照。

因此，您可以看到，我已经标记好了我的培养室，分别为对照拉伸、对照拉伸。而拉伸培养室需要多一个螺丝，因此我已将拉伸培养室的额外螺丝放置在此处盖子内侧的上方。

只需取下框架并将其翻转。如果是拉伸培养室，则需要更换其中几颗螺丝；而如果是对照培养室，则所有部件保持不变。

当这个条形结构来回移动时，膜本身不会被拉伸，而是随着条形结构一起移动。如果我希望膜发生拉伸，则需要将框架的另一端固定在腔室底部，使其保持静止。此时，当条形结构仅在框架的这一部分移动时，就会带动膜来回运动。

为此，请取下额外的螺丝，将其插入框架这一部分的螺丝孔中。使用六角扳手将螺丝拧紧。注意不要过度拧紧，因为这些聚苯乙烯单腔室略显脆弱，过度紧固可能导致腔室破裂；只需拧至框架部分不会移动即可。

然后，当你拧入第一颗螺丝后，可以松开这颗固定框架两部分的螺丝，注意不要将螺丝掉落到膜上，否则可能会破坏你已接种在上面的明胶。因此，当我将其拧得较松后，取出六角扳手，用镊子夹住螺丝，将其放入第二个螺丝孔中。然后再次使用六角扳手，拧紧第二颗螺丝。

因此，当用两颗螺丝固定好该框架部件后，我就搭建好了一个用于拉伸的腔室。当这个横杆在拉伸装置中来回移动时，你可以看到膜本身确实会被拉伸。我喜欢实际操作几次，以确保我的膜没有问题。

如果由于某种原因膜出现裂纹并撕裂，我现在就能在实验开始前发现，并可以更换另一张膜。因此，将这个移至一旁，取出下一个，而本例中标记为对照室。对于对照室，我只需将其翻转即可。

现在将其放入机器后，它将前后移动而不会拉伸。然后根据你所拥有的培养室和膜的数量重复此过程。每个培养室均需进行拉伸控制，然后关闭罩盖，并对膜的上表面进行30分钟的紫外照射。

我们刚刚完成了对所有培养室以及膜上框架顶部的紫外线照射，持续30分钟。现在所有物品均已灭菌并组装完毕，可以开始接种细胞。本实验中，我将接种间充质干细胞，这些细胞来自直径10厘米的培养皿。

因此，对于每一张膜，尤其是当我在使用带有图案的膜（如此处所示）时，可以仅在有图案的方形区域内进行细胞接种。我只希望在该有图案的区域上接种细胞。如果使用的是无图案的膜，也应大致在相同的区域进行接种，以避免液体过于靠近边缘。

如果液体过于靠近边缘，可能会溢出，导致细胞在真正接种完成前就死亡。而在接种区域，你需要接种适量的细胞。因此，当我进行实验时，希望该区域的细胞能够达到较高的汇合度。

因此，如果我使用一个10厘米的培养皿，我希望该区域上的细胞密度约为汇合度的三分之一。在这种情况下，对于间充质干细胞，大约需要250,000个细胞。具体数量会因所使用的细胞类型不同而有所变化。

我已经将细胞从培养板上收集下来，并将其重悬于适当体积的溶液中。我需要将1毫升的细胞悬液分别加入每张膜上。在此情况下，每毫升溶液中含有约250,000个间充质干细胞。

因此，我使用一个P-1000移液器，并确保溶液充分混匀。我将移液器上下吹打几次，吸取1 mL溶液。我需要确保仅在该图案化区域进行接种，因此我缓慢地接种，并在该图案化区域内以小液滴形式滴加。

实际上你可以观察到，由于这是一种特定的模式，探头会沿此方向形成微小的椭圆形轨迹，因为它确实在感知这些凹槽。因此，它们不是完整的圆形，在本例中更接近椭圆形。

然后观察此区域的四周，但暂时不要过于靠近边缘。我不希望移液过远，导致移液枪中的溶液全部排出。接着使用移液枪将溶液均匀铺展至接近边缘的区域，注意不要超出。

我不希望未划线区域有任何细胞，而且靠近你这一侧的边缘稍微难以处理。因此，我通常会小心地旋转培养皿，处理最后这条边缘。这样应该能使细胞分布得相当均匀。

现在它们都已坐好。但你要小心不要将任何细胞洒出。因此，注意不要将手从上方快速掠过，也不要移动得太快。

然后将其移开。我想盖上盖子，仅将细胞种子轻轻提起置于上方。为此，使用这个盖子，盖子上实际上有两个不同的孔。

这一侧有一个较深的孔，另一侧有一个较浅的孔，用于通入气体。你需要确保较深的孔与这里的T形部分对齐，否则如果使用较浅的孔，会过于紧密。

因此以这种方式放置，即可覆盖整个小室。然后对剩余的所有小室重复此操作，并将装置置于生物安全柜中静置30分钟，使细胞沉降至底部并开始附着于膜上。之后，我们将用胶带封好所有小室，转移至生物安全柜或培养箱中，继续孵育1小时，使细胞在膜上完全贴壁。

好的，我们刚刚让细胞在膜上静置了半个小时。现在需要将细胞暴露于37摄氏度和5% CO₂的环境中，这需要将细胞放入培养箱中。因此，我需要将细胞从超净台转移至培养箱。

为此，您只需确保操作时格外小心，不要将小室向任何方向倾斜，否则细胞溶液可能会滑落，导致必须重新开始。现在，细胞已在培养箱中的小室内孵育一小时，细胞已牢固地贴附在表面。

此时，我已将培养室从培养箱中取出，并小心地放回超净台内，搬运时需格外谨慎，如同之前一样，避免膜上的培养基洒出。接下来，需要向拉伸培养室中加入 20 mL 培养基。

在这种情况下，我使用了一种特殊的培养基组合，因为该体系略容易受到污染，而这种培养基经过精心设计，可有效防止污染。我使用的是DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素，再额外加入1%的抗真菌剂（fungi zone），以防止真菌污染。取20 mL培养基，我将小心地将其加入拉伸培养室中。

我们可以观察到培养基并未从膜本身脱落，并已添加至腔室末端，从而使培养基先流经膜下方，再覆盖到膜的上方。操作时应缓慢进行，以免对细胞造成明显扰动。随后重新盖上盖子，并将盖子牢固地放置到位。

此时，您无需再担心扰动细胞或使其从膜上脱落，因此可以相对不那么小心地操作。您需要选择合适的应变程度。

这台机器的工作原理是：我们有一个旋转的轮子，轮子上连接着一根臂杆，该臂杆的长度可以根据插入轮子中心的预制件的不同而改变。因此，当轮子旋转时，臂杆会来回移动，从而带动平台来回运动，而这些腔室则固定在该平台上。

因此，它们也会随之来回移动。所以，如果我想施加 5% 的应变，我会使用一个预制的标有“5”的部件，该部件具有特定的预计算长度，可使臂部到达正确的位置。然后，我将该部件插入轮子的中心，再安装臂部，确保其牢固就位，并使用六角扳手拧紧以完成最终固定。

因此，当一切就位后，设备处于零位，所有部件均已锁定。现在我们就可以安装腔室了。这些就是我刚刚转移过来的腔室。

将细胞置于上方，小心地将其放入单一位置，并确保横杆锁定到位。需确保将其向此方向推入，以使其锁定在零位。切勿将其完全推回，以免预拉伸膜。

然后用此处的紧固件将其固定到位，以防止其移动。接着拨动开关使其启动。可以看到，刚开始时会有一个轻微的跳动。

有时会发生这种情况，它会卡住，但通常之后就会运行得相当顺畅。现在所有条形图都在来回移动，频率为每秒60个周期。因此下方显示为600。

实际应为 60.0。如果需要，您可以更改频率。因此，当细胞在您的系统中受到机械应力刺激后，我们通常持续处理约两到五天，但您也可以根据需要缩短或延长处理时间。

当实验完成并达到某种明确的终点后，可以取出小室，利用膜上的细胞来研究不同的问题。我们通常采用多种技术，包括微阵列、二维凝胶电泳。我们还通过PCR检测基因表达，或通过蛋白质印迹法检测蛋白质表达。

除了仅裂解细胞外，您还可以直接在膜上对细胞进行染色，以检测特定蛋白质的免疫荧光，甚至可以将细胞从膜上释放出来，再进行染色并通过流式细胞仪进行分析。因此，您可以开展多种不同的操作，检测多种不同的目标。当然，如果需要使用不同类型的微图案膜、不同材料或不同涂层等，该装置本身也存在多种不同的变体形式，您可以通过各种方式对此进行优化和调整。