Name: 微流控装置重新创建一个肿瘤微环境 em在体外 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: 学习使用软光刻技术制造微流控芯片，在体外重建三维肿瘤微环境以测试化疗药物。该方法可量化药物扩散系数并评估细胞凋亡，为癌症药物筛选提供更准确的体内模型。

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本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 # 1R01CA120825-01A1、马萨诸塞大学阿默斯特分校协作生物医学研究（CBR）项目以及对 Bhushan J. Toley 提供的伊森伯格奖学金的支持。我们衷心感谢 James Schafer 作为本视频的摄像师、解说员和编辑所做出的宝贵贡献。

1. 器件制备
弹性体材料中微流控结构的复制基于Duffy等人1所描述的方法。
<ol>
	<li>按9:1的质量比混合硅弹性体试剂盒（Dow Corning，Midland, MI）中的弹性体（聚二甲基硅氧烷；PDMS）和固化剂，浇注于母模上形成4 mm厚的层。脱气以去除气泡，并在60°C下固化5小时。将固化的PDMS从模具上剥离，得到具有流道结构的弹性体印章。</li>
	<li>使用安装在台钻上的1.5 mm活检打孔器（Miltex，York, PA）在进样口和出样口位置打孔。清除残留碎屑。</li>
	<li>将印章的结构面和洁净的玻璃载片置于氧气等离子体刻蚀仪中进行8分钟的氧气等离子体处理。立即使处理后的表面相互接触，以形成键合。将组装件置于载片加热器上，在60°C下保持至少5小时，以增强键合强度。</li>
	<li>使用连接在带凸齿的雌性鲁尔锁接头（Qosina，Edgewood, NY）上的雄性鲁尔锁接头，将内径为0.032"的PTFE管（Cole Parmer，Vernon Hills, IL）连接至进样口和出样口。</li>
	<li>使用关闭阀和Y型连接器（Upchurch Scientific，Oak Harbor, WA；图1）搭建流动装置。将装置固定在显微镜上。使用20G 1.5"针头（BD Bioscience，Rockville, MD）将注射器连接至管路。</li>
</ol>
2. 均一球形体的形成
类球体通过悬滴法形成2,3。
<ol>
	<li>在无菌细胞培养罩内对细胞进行胰蛋白酶消化处理。</li>
	<li>将胰蛋白酶消化后的细胞以 2000 rpm 离心 5 分钟，并重悬于 6 ml 新鲜培养基中。将储备液稀释至所需终浓度（见表 1）。</li>
	<li>取下 48 孔板的盖子，将其倒置并放置于已灭菌的罩内。盖子上每个孔对应的圆形区域清晰可见。向 48 孔板的每孔中加入 1 ml 无菌水以维持湿度。使用微量移液器将 20 μl 稀释后的细胞悬液滴加至每个圆形区域。小心地将盖子翻转并盖回 48 孔板上，确保液滴不接触孔的边缘。</li>
	<li>将 48 孔板置于 37°C 培养一定天数（见表 1）。每个悬滴中将形成一个球状体。</li>
</ol>
3. 将球状体引入装置
本节请参考图1和表2。
<ol>
	<li>通过向流入端注入70%乙醇冲洗装置，对装置进行灭菌。随后用PBS冲洗，再用HEPES缓冲的细胞培养基冲洗。将培养基注射器SF保留在管路上。</li>
	<li>用注射器SP吸取2-3个类球体，轻敲注射器以去除气泡，然后将其连接至装置的装填入口。</li>
	<li>打开入口阀VPin，关闭VFin；打开出口阀VPout，关闭VFout。将装填注射器垂直放置，针头朝下；观察类球体沉降至注射器底部并进入针头的鲁尔锁接头处。推动装填注射器的推杆，观察类球体进入管路并流入装置。由于仅装填出口阀处于打开状态，类球体将进入装置腔室，并被后端的支柱截留（图2）。</li>
	<li>关闭入口阀VPin和出口阀VPout。将注射器SF安装在注射泵上。打开阀VFin和阀VFout，以3 μl/min的流速将培养基注入装置。</li>
</ol>
4. 凋亡检测试剂（CaspGLOW）的引入
将类球体装入小室后，孵育最多24小时以建立营养梯度和微环境，然后再引入凋亡检测试剂或治疗药物。由于小室中的组织在顶部和底部均与不可渗透的壁接触，因此在组织厚度（0.15 mm）方向上不存在营养梯度。孵育24小时后，沿组织厚度方向的所有细胞层均具有等效性，唯一的异质性存在于远离流动通道的方向上。
<ol>
	<li>关闭 VFin，停止注射泵，将注射器 SF 从泵上取下，并更换为装有含 0.25 μl/ml CaspGLOW Red Active Caspase-3 标记物（Red-DEVD-FMK；Biovision，Mountain View, CA）培养基的注射器。</li>
	<li>手动将 0.7 ml 该溶液推注通过装置，以确保完全置换旧培养基。将注射器重新安装至泵上，恢复流体流动，并打开 VFin。在 5–8 小时内，凋亡检测试剂会扩散至组织中，并在发生凋亡的区域发出更强的荧光。此后所有流入装置的溶液均需维持该浓度的凋亡检测试剂。</li>
</ol>
注意：
<ol class="lroman">
	<li>可通过获取第 6 节所述的荧光线性强度分布来确认组织异质性。该分布应显示出细胞凋亡的空间梯度，从而证实组织在细胞活力方面具有异质性。</li>
	<li>也可使用 CaspGLOW Green 活化型 Caspase-3 标记物（Fluorescein-DEVD-FMK；Biovision）检测细胞凋亡。该标记物含有绿色荧光素 fluorescein，而非红色荧光素罗丹明（rhodamine）。</li>
</ol>
5. 治疗剂的引入
<ol>
	<li>按照步骤 4.1–4.2 的操作流程，引入含有凋亡检测试剂的 10 μM 盐酸多柔比星（Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）。</li>
	<li>持续灌注治疗剂溶液一段固定时间后，关闭阀门 VFin 并停止注射泵。将处理用注射器更换为含有凋亡检测试剂的新鲜培养基注射器，在显微镜下持续监测组织的同时，让新鲜培养基灌注 24–36 小时。</li>
</ol>
6. 时间序列显微镜观察及药物扩散系数的估算
为了获得最纯净的荧光数据，应将显微镜聚焦于组织的底层细胞来采集所有图像。由于在垂直方向上不存在营养梯度（见第4节），底层细胞能够很好地代表其上方所有其他层的细胞状态。
<ol>
	<li>整个采集过程使用 IPLab 中的自定义脚本实现自动化BD Bioscience，美国马里兰州罗克维尔）。以10倍放大倍数每30分钟采集一次紧密堆积类球体的透射光和荧光图像（图3A）。在加入Dox之前，先采集背景荧光图像。由于腔室尺寸较大（1000 μm x 300 μm），获取两张相邻的图像并进行拼接4.</li>
	<li>为了数学估算药物扩散系数，第一步是使用 ImageJ 生成阿霉素荧光的平均线性强度分布曲线。选择一个矩形感兴趣区域（ROI），覆盖微流控腔室中的组织。利用“Plot Profile”命令生成平均荧光强度随距流动通道距离变化的分布曲线。对最多 3 个不同的时间点重复此操作。</li>
	<li>在加入Dox之前获取背景荧光图像，以测量组织的自发荧光。从获得的荧光强度曲线中减去平均背景荧光强度，并将每条曲线除以其对应的最大强度进行归一化，以获得 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="静力平衡 ΣFx=0 示意图，力的平衡分析，物理概念，矢量表示" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="c">(x,t)（图3B）。</li>
	<li>下一步是评估有效扩散系数 D 肿瘤组织内阿霉素（Dox）的扩散可通过以下方程表示5 
	<img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="扩散方程 \( \tilde{c}(x,t) = \text{erfc}\left(\frac{x}{2\sqrt{D \cdot t}}\right) \) 公式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
	其中 erfc 是互补误差函数， x 是从通道到组织内部的距离，且 t 为加入Dox后的时间（参见图3）。在每个考虑的时间点使用以下迭代方案：
		<ul>
			<li>猜测一个值 D</li>
			<li>在每个位置计算方程的右侧 x</li>
			<li>计算两侧之间的残差平方和</li>
			<li>修改 D 以减少残留</li>
		</ul>
	</li>
	<li>对每个时间点获得的D的最优值进行平均，以估算阿霉素（Dox）在组织中的平均有效扩散系数。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
微流控装置提供了尺寸为 1 mm × 0.3 mm × 0.15 mm 的光学可及培养腔室，用于三维肿瘤组织的生长。多细胞肿瘤类球体被注入这些腔室，并由后端两个滤柱固定保留。悬滴法可使多个细胞系快速形成大小和形状均一的类球体。类球体在该装置上成功培养长达 3 天。腔室内的生长伴随着类球体内部微环境的可重复性改变。靠近流道区域的细胞凋亡较少，而组织深层的细胞凋亡水平较高。该装置被用于估算阿霉素在肿瘤组织中的扩散系数。测得的扩散系数为 8.75 × 10-7 cm2s-1，与先前报道的人类乳腺癌中 9.1 × 10-7 cm2s-1 的数值一致6。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞系</td>
			<td>所需细胞浓度</td>
			<td>孵育时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS174T</td>
			<td>300 cells/μL</td>
			<td>2-3 天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D</td>
			<td>750 cells/μL</td>
			<td>3-4 天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>150 cells/μL</td>
			<td>5-6 天</td>
		</tr>
	</tbody>
</table> 
表1. 悬滴法球状体的参数
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>部件</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF</td>
			<td>流动注射器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP</td>
			<td>装柱注射器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VFin</td>
			<td>流动入口阀</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPin</td>
			<td>装柱入口阀</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VFout</td>
			<td>流动出口阀</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPout</td>
			<td>装柱出口阀</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 流动装置中的注射器和阀门
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="培养室流动示意图，显示用于细胞生长的流体动力学装置，包括阀门和管路连接件。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 流动装置示意图 VFin 和 VFout：流体入口和出口阀门；VPin 和 VPout：装载入口和出口阀门；SF 和 SP：流动和装载注射器。当类球体被注入培养室时，使用装载注射器以及装载入口和出口阀门；之后则使用流动注射器及流体入口和出口阀门来灌注培养基。
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="显示滤柱和培养基流动方向的球体培养室示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 装置上培养室中被捕获球体的示意图。 一个球体随液体流入装置上的培养室，并被培养室后方的两根滤柱阻挡而滞留。
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="显示阿霉素扩散及荧光强度图的微流控装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 装置中肿瘤组织内的阿霉素扩散。A. 组织透射光与红色荧光图像的叠加图，显示阿霉素（红色）的位置和浓度。比例尺为250 μm。B. 阿霉素荧光的归一化线性强度分布图。

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

肿瘤中的血管系统稀疏且发育不良7,8。存在一些距离血管较远（>100 μm）的区域，无法通过血管系统获得营养物质和药物9。这种异质性微环境导致许多化疗药物的疗效受限10。本文开发的微流控装置在体外重现了具有增殖、静止以及凋亡或坏死细胞特征的异质性肿瘤微环境。靠近通道的细胞保持活性，但因扩散受限，在远离通道的区域形成营养缺乏并导致细胞凋亡。该流动通道模拟血管，而球形结构则代表肿瘤内邻近血管的一个小区域。
在将类球体引入装置时，需确保打孔的入口干净且无碎屑，因为任何对组织流动的阻碍都可能导致腔室填充失败或类球体断裂。在引入类球体的过程中，装填注射器需手动操作。流速必须尽可能保持最低，以避免将类球体推过腔室后方的支柱。与所有微流控装置一样，在操作过程中必须采取一定措施以避免系统中产生气泡，尤其是在更换注射器时。每次更换注射器时剪去一小段管路将有助于避免气泡的产生。
目前正在进行对设备的改进，以实现在单次实验中使用多个腔室和多种处理条件。 
我们认为，这些设备可用于研...

<table><tbody><tr><td>硅胶弹性体试剂盒</td><td>埃尔斯沃思胶粘剂</td><td>184 型硅胶弹性体试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 活检穿孔器</td><td>MedexSupply</td><td>MTX-33-31AA</td><td>1.5 mm</td></tr><tr><td>PTFE 管</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-31</td><td>0.032&quot; ID</td></tr><tr><td>雄性鲁尔锁接头</td><td>Qosina</td><td>65111</td><td></td></tr><tr><td>带倒刺的雌性鲁尔锁接头</td><td>Qosina</td><td>11556</td><td></td></tr><tr><td>截止阀</td><td>Idex Health and Science</td><td>P-721</td><td></td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>Idex Health and Science</td><td>P-513</td><td></td></tr><tr><td>20G 1.5&quot; 针</td><td>BD 生物科学</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>CaspGLOW 荧光素</td><td>Biovision 公司</td><td>K183-25</td><td></td></tr><tr><td>CaspGLOW 红色</td><td>Biovision 公司</td><td>K193-25</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44583</td><td></td></tr><tr><td>LS174T</td><td>ATCC</td><td>CCL-188</td><td>人结肠癌细胞系</td></tr><tr><td>T47D</td><td>ATCC</td><td>HTB-133</td><td>人导管癌细胞系</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>人乳腺腺癌细胞系</td></tr></tbody></table>

用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

我们开发了一种微流控装置，可模拟药物向体外三维异质性肿瘤组织的递送及其系统性清除过程。由脉管系统输送的营养物质无法到达肿瘤的所有区域，从而形成了包含存活细胞、静止细胞和坏死细胞等多种细胞类型的异质性微环境。由于这种异质性，许多抗癌药物难以有效渗透并治疗所有类型的细胞。癌细胞的单层培养模型无法模拟这种异质性，使得在合适的体外模型中测试抗癌药物变得困难。我们的微流控装置采用软光刻技术以PDMS材料加工而成。通过悬滴法形成的多细胞肿瘤球体被插入装置上的矩形腔室中，并在一侧通过持续灌注培养基加以维持。装置上腔室的矩形结构在组织内建立了线性梯度。利用荧光染料对组织内凋亡的异质性进行定量分析。装置上的肿瘤模型用荧光化疗药物阿霉素（doxorubicin）处理，并通过延时显微镜监测药物在组织中的扩散过程，进而估算其有效扩散系数。悬滴法可快速从多种癌细胞系形成均一的球体。该装置支持球体生长达3天之久。靠近流动培养基的细胞凋亡程度较低，而远离通道的细胞则表现出更高的凋亡水平，从而准确模拟了肿瘤中邻近血管区域的微环境特征。所估算的阿霉素扩散系数与既往报道的人类乳腺癌中的数值一致。鉴于药物在实体瘤中的渗透与滞留情况直接影响其疗效，我们认为该装置是研究药物行为及开发新型抗癌疗法的重要工具。

我们介绍了用于构建和运行一种可重现异质性肿瘤微环境的微流控装置的实验流程 体外采用荧光染色法对肿瘤组织内细胞凋亡的变异性进行定量分析，并评估化疗药物阿霉素在肿瘤组织中的有效扩散系数。

我们开发了一种微流控装置，可模拟药物向异质性三维肿瘤组织的递送及系统性清除过程……

本实验的总体目标是展示一种微流控装置的制备与操作方法，该装置可在体外模拟肿瘤微环境，并用于化疗药物的测试。此即为该微流控装置。该装置在以下领域具有应用价值：可在体外便捷地进行化疗药物测试。该设备在测试三维肿瘤组织时可提供一致且准确的结果，能够非常精确地模拟体内肿瘤。肿瘤存在于三维微环境中，因此能够在三维微环境中进行测试具有重要意义。该实验步骤的第一步是组装设备，包括使用软光刻技术制备微流控芯片、在进出口处打孔、将芯片键合至玻片，并连接用于流体进出的管路。接下来，采用悬滴法生成均一的多细胞肿瘤类球体，用于后续装置实验。随后将类球体引入装置中，并加入凋亡检测试剂和化疗药物。最后进行延时显微成像，继而通过数学方法估算药物扩散系数，以定量评估化疗药物的渗透能力。最终，可通过延时荧光显微镜观察获得结果，显示组织中微环境的异质性形成以及药物通过扩散进入组织的过程。抗癌药物在实体瘤中渗透受限是其疗效失败的重要原因。目前大多数抗癌药物检测模型均无法模拟实体瘤的三维特性。我们开发了一种微流控装置，包含持续灌注的三维肿瘤组织。该模型能更准确地模拟药物向实体瘤的递送及其系统性清除过程。多细胞肿瘤类固醇是三维肿瘤组织的一种成熟模型。在此实验中，采用悬滴法生成类固醇，用于微流控装置。该方法可在较短时间内形成一致的类固醇结构。在体外利用三维组织对化疗药物进行测试，相较于单层细胞，可更高效地筛选药物。按九比一的质量比混合硅弹性体中的PDMS和固化剂。然后将该混合物倒入模具上，形成厚度为四毫米的PDMS层。通过在60摄氏度下固化五小时以去除气泡。将固化的PDMS从模具上剥离，以获得具有流道结构的弹性体印章。然后使用安装在钻头上的1.5毫米活检打孔器，压制出入口和出口的孔洞，并清除所有碎屑。将印章的特征面和一块洁净的玻璃载玻片置于氧气等离子体中处理八分钟。在氧气等离子体刻蚀仪中，立即将处理过的表面接触，以形成两者之间的键合。将组装体置于载玻片加热器上，在60摄氏度下保持至少五小时。为了增强连接，将内径为 0.032 英寸的 PTFE 管牢固连接至微流控装置的入口和出口。使用带螺纹接头的公端连接器与带倒钩的母端连接器相接，这些特定连接器可确保管路轻松穿过且不易断裂。最后，利用截止阀和 Y 型连接器搭建流体通路系统，并将装置固定在显微镜上。装置安装完毕后，将管路连接至相应的入口和出口，以完成整个流体系统的搭建。如图所示，该配置可方便且灵活地将类球体装入装置，或通过装置引入培养基流动以完成装载。打开肿瘤装载入口阀 VPN 和装载出口阀 VP out，培养基即可通过入口流入培养室，培养室内的柱状结构将固定肿瘤位置，使培养基得以流过。关闭装填阀，打开流体入口阀 VF in 和流体出口阀 VF out，以开始形成均匀的 PHE。在培养罩内采用悬滴法对冰冻细胞进行胰蛋白酶消化。从离心机中取出经胰蛋白酶处理后的细胞。参照表一，将储备液稀释至所需浓度。接着，取下48孔板的盖子并将其倒置。在无菌操作台中，向每孔加入一毫升无菌水。为保持湿度，将20微升稀释后的细胞溶液滴加到盖片上的每个圆形区域。使用微量移液器小心地将盖片翻转，并将其覆盖在培养板上，确保液滴不接触孔的边缘。将培养板置于37°C条件下孵育。根据所使用的特定细胞，参见表一以确定孵育时间，每个悬滴中将形成类固醇。首先通过流体入口用70%乙醇冲洗装置以进行灭菌。随后依次用PBS和H-E-P-E-S缓冲的细胞培养基冲洗。将中等大小的注射器留置，连接至管路。接着，吸取两到三份类固醇至注射器中，轻敲注射器以排出气泡。为去除气泡，请将注射器连接至装置的填料入口。打开进样阀 VPN，关闭 VFN，打开出样阀 VP out 并关闭 VF out。将装填注射器垂直放置，针头朝下。观察类固醇逐渐沉降至注射器底部，并进入针头的鲁尔锁接头处。推动装填注射器的活塞，观察PHE进入管路并流入装置，此时仅装填出口阀处于打开状态。类固醇将进入装置的腔室，并被腔室后端的柱状结构截留。一旦进入腔室，S类球体将顺应腔室的形状，并形成矩形几何结构。关闭进样阀 VPN 和出样阀 VP，将流动注射器 SF 安装到注射泵上。该泵由计算机通过注射泵程序控制，打开进样阀 VFN 和出样阀 VF，以每分钟 3 µL 的流速开始向装置中注入培养基。将类球体孵育24小时后，引入细胞凋亡检测试剂。在引入细胞凋亡检测试剂、检测剂或治疗剂之前，需让类球体平衡最多24小时，以建立营养梯度和微环境。然后关闭阀门VFN。停止注射泵。将注射器从泵中取出，并更换为含有培养基的注射器，其中添加了 0.25 µL/mL 的 CASP 氛红活性 Caspase-3 标记物。通过手动向装置内推注 0.7 mL 该溶液，冲洗装置。然后将注射器安装到泵上。重新启动流动并打开阀门 VFN。在五到八小时内，cask glove red 活性 cph 第三相将扩散至组织中，并在凋亡区域发出更亮的荧光。在此浓度下，凋亡检测试剂在所有后续的流动溶液中均保持稳定。在引入凋亡检测试剂后五到八小时加入阿霉素。通过灌流将该处理从系统中清除。添加化疗药物时，按照凋亡检测的操作步骤引入10 µM盐酸阿霉素。然后将处理用注射器更换为含有0.7毫升培养基的注射器。继续以恒定时间输注治疗剂。随后关闭阀门VFN并关闭注射泵。将处理用注射器从注射泵上取下，更换为装有0.7毫升培养基的注射器。让新鲜培养基持续流动24至36小时，同时在显微镜下连续监测组织。时间 lapse 显微成像的整个采集过程通过IP lab中的自定义脚本实现自动化，每30分钟以10倍放大倍数采集一次PAX Foid的透射光和荧光图像。为了数学估算药物扩散系数，第一步是使用Image J生成docs荧光的平均线性强度分布曲线。选择一个矩形兴趣区域（ROI），使其覆盖腔室中的组织。使用剖面图命令生成距离流道不同位置的平均荧光强度分布曲线。对最多三个不同的时间点重复此操作。随后，从获得的强度分布曲线中减去平均背景荧光强度，并使用各自的最大强度对每条曲线进行归一化处理，从而得到归一化浓度 C 随距离 X 和时间 T 的变化关系。其中 C 表示阿霉素的归一化浓度，其值介于 0 到 1 之间。下一步是评估阿霉素在肿瘤组织内的有效扩散系数。扩散可用以下方程表示，其中 ERFC 为互补误差函数。X 表示从通道进入组织的距离，T 表示阿霉素引入后的时间。在每个考虑的时间点使用以下迭代方案：首先猜测一个 D 值，然后在每个位置计算等式右侧的值 X，接着计算两侧之间误差平方和，并调整 D 以最小化残差平均值。在每个时间点获得的 D 的最优值，用于估算阿霉素在组织中的平均有效扩散系数。微流控装置提供了尺寸为 1 毫米 × 0.3 毫米 × 0.15 毫米的光学可及培养腔室，用于三维肿瘤组织的生长。悬滴法可利用多种细胞系快速形成大小和形状一致的肿瘤类器官（PHE）。人食管上皮细胞（PHE）在该装置上成功培养了长达三天。腔室中的细胞生长伴随着微环境的可重复性改变。在PHE中，靠近流道附近的细胞凋亡较少，而组织更深处和更高区域的细胞凋亡较多。该装置用于估算阿霉素在肿瘤组织中的扩散系数。实验测得的数值与先前报道的人类乳腺癌中的数值一致。在将PHE通入装置时，必须格外注意保持无菌状态，因为该操作需在细胞培养环境之外进行。用足量乙醇喷洒罩子、注射器以及管路末端，以确保无菌。观看本视频后，您应了解药物在肿瘤中渗透受限的作用。我们展示了一种技术，用于模拟药物在三维肿瘤组织中的递送和系统清除过程，并量化其渗透程度。消除穿透性差的药物将显著简化癌症药物研发过程。

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科研

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生物工程

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用于重建肿瘤微环境的微流控装置体外

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