用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

本实验的总体目标是展示一种微流控装置的制备与操作方法，该装置可在体外模拟肿瘤微环境，并用于化疗药物的测试。此即为该微流控装置。该装置在以下领域具有应用价值：可在体外便捷地进行化疗药物测试。

该设备在测试三维肿瘤组织时可提供一致且准确的结果，能够非常精确地模拟体内肿瘤。肿瘤存在于三维微环境中，因此能够在三维微环境中进行测试具有重要意义。该实验步骤的第一步是组装设备，包括使用软光刻技术制备微流控芯片、在进出口处打孔、将芯片键合至玻片，并连接用于流体进出的管路。

接下来，采用悬滴法生成均一的多细胞肿瘤类球体，用于后续装置实验。随后将类球体引入装置中，并加入凋亡检测试剂和化疗药物。最后进行延时显微成像，继而通过数学方法估算药物扩散系数，以定量评估化疗药物的渗透能力。

最终，可通过延时荧光显微镜观察获得结果，显示组织中微环境的异质性形成以及药物通过扩散进入组织的过程。抗癌药物在实体瘤中渗透受限是其疗效失败的重要原因。目前大多数抗癌药物检测模型均无法模拟实体瘤的三维特性。

我们开发了一种微流控装置，包含持续灌注的三维肿瘤组织。该模型能更准确地模拟药物向实体瘤的递送及其系统性清除过程。多细胞肿瘤类固醇是三维肿瘤组织的一种成熟模型。

在此实验中，采用悬滴法生成类固醇，用于微流控装置。该方法可在较短时间内形成一致的类固醇结构。在体外利用三维组织对化疗药物进行测试，相较于单层细胞，可更高效地筛选药物。

按九比一的质量比混合硅弹性体中的PDMS和固化剂。然后将该混合物倒入模具上，形成厚度为四毫米的PDMS层。通过在60摄氏度下固化五小时以去除气泡。

将固化的PDMS从模具上剥离，以获得具有流道结构的弹性体印章。然后使用安装在钻头上的1.5毫米活检打孔器，压制出入口和出口的孔洞，并清除所有碎屑。

将印章的特征面和一块洁净的玻璃载玻片置于氧气等离子体中处理八分钟。在氧气等离子体刻蚀仪中，立即将处理过的表面接触，以形成两者之间的键合。将组装体置于载玻片加热器上，在60摄氏度下保持至少五小时。

为了增强连接，将内径为 0.032 英寸的 PTFE 管牢固连接至微流控装置的入口和出口。使用带螺纹接头的公端连接器与带倒钩的母端连接器相接，这些特定连接器可确保管路轻松穿过且不易断裂。最后，利用截止阀和 Y 型连接器搭建流体通路系统，并将装置固定在显微镜上。装置安装完毕后，将管路连接至相应的入口和出口，以完成整个流体系统的搭建。

如图所示，该配置可方便且灵活地将类球体装入装置，或通过装置引入培养基流动以完成装载。打开肿瘤装载入口阀 VPN 和装载出口阀 VP out，培养基即可通过入口流入培养室，培养室内的柱状结构将固定肿瘤位置，使培养基得以流过。

关闭装填阀，打开流体入口阀 VF in 和流体出口阀 VF out，以开始形成均匀的 PHE。在培养罩内采用悬滴法对冰冻细胞进行胰蛋白酶消化。从离心机中取出经胰蛋白酶处理后的细胞。

参照表一，将储备液稀释至所需浓度。接着，取下48孔板的盖子并将其倒置。在无菌操作台中，向每孔加入一毫升无菌水。

为保持湿度，将20微升稀释后的细胞溶液滴加到盖片上的每个圆形区域。使用微量移液器小心地将盖片翻转，并将其覆盖在培养板上，确保液滴不接触孔的边缘。将培养板置于37°C条件下孵育。

根据所使用的特定细胞，参见表一以确定孵育时间，每个悬滴中将形成类固醇。首先通过流体入口用70%乙醇冲洗装置以进行灭菌。随后依次用PBS和H-E-P-E-S缓冲的细胞培养基冲洗。

将中等大小的注射器留置，连接至管路。接着，吸取两到三份类固醇至注射器中，轻敲注射器以排出气泡。为去除气泡，请将注射器连接至装置的填料入口。

打开进样阀 VPN，关闭 VFN，打开出样阀 VP out 并关闭 VF out。将装填注射器垂直放置，针头朝下。观察类固醇逐渐沉降至注射器底部，并进入针头的鲁尔锁接头处。

推动装填注射器的活塞，观察PHE进入管路并流入装置，此时仅装填出口阀处于打开状态。类固醇将进入装置的腔室，并被腔室后端的柱状结构截留。一旦进入腔室，S类球体将顺应腔室的形状，并形成矩形几何结构。

关闭进样阀 VPN 和出样阀 VP，将流动注射器 SF 安装到注射泵上。该泵由计算机通过注射泵程序控制，打开进样阀 VFN 和出样阀 VF，以每分钟 3 µL 的流速开始向装置中注入培养基。

将类球体孵育24小时后，引入细胞凋亡检测试剂。在引入细胞凋亡检测试剂、检测剂或治疗剂之前，需让类球体平衡最多24小时，以建立营养梯度和微环境。然后关闭阀门VFN。

停止注射泵。将注射器从泵中取出，并更换为含有培养基的注射器，其中添加了 0.25 µL/mL 的 CASP 氛红活性 Caspase-3 标记物。通过手动向装置内推注 0.7 mL 该溶液，冲洗装置。

然后将注射器安装到泵上。重新启动流动并打开阀门 VFN。在五到八小时内，cask glove red 活性 cph 第三相将扩散至组织中，并在凋亡区域发出更亮的荧光。在此浓度下，凋亡检测试剂在所有后续的流动溶液中均保持稳定。

在引入凋亡检测试剂后五到八小时加入阿霉素。通过灌流将该处理从系统中清除。添加化疗药物时，按照凋亡检测的操作步骤引入10 µM盐酸阿霉素。

然后将处理用注射器更换为含有0.7毫升培养基的注射器。继续以恒定时间输注治疗剂。随后关闭阀门VFN并关闭注射泵。

将处理用注射器从注射泵上取下，更换为装有0.7毫升培养基的注射器。让新鲜培养基持续流动24至36小时，同时在显微镜下连续监测组织。时间 lapse 显微成像的整个采集过程通过IP lab中的自定义脚本实现自动化，每30分钟以10倍放大倍数采集一次PAX Foid的透射光和荧光图像。为了数学估算药物扩散系数，第一步是使用Image J生成docs荧光的平均线性强度分布曲线。选择一个矩形兴趣区域（ROI），使其覆盖腔室中的组织。

使用剖面图命令生成距离流道不同位置的平均荧光强度分布曲线。对最多三个不同的时间点重复此操作。随后，从获得的强度分布曲线中减去平均背景荧光强度，并使用各自的最大强度对每条曲线进行归一化处理，从而得到归一化浓度 C 随距离 X 和时间 T 的变化关系。其中 C 表示阿霉素的归一化浓度，其值介于 0 到 1 之间。

下一步是评估阿霉素在肿瘤组织内的有效扩散系数。扩散可用以下方程表示，其中 ERFC 为互补误差函数。X 表示从通道进入组织的距离，T 表示阿霉素引入后的时间。

在每个考虑的时间点使用以下迭代方案：首先猜测一个 D 值，然后在每个位置计算等式右侧的值 X，接着计算两侧之间误差平方和，并调整 D 以最小化残差平均值。

在每个时间点获得的 D 的最优值，用于估算阿霉素在组织中的平均有效扩散系数。微流控装置提供了尺寸为 1 毫米 × 0.3 毫米 × 0.15 毫米的光学可及培养腔室，用于三维肿瘤组织的生长。悬滴法可利用多种细胞系快速形成大小和形状一致的肿瘤类器官（PHE）。

人食管上皮细胞（PHE）在该装置上成功培养了长达三天。腔室中的细胞生长伴随着微环境的可重复性改变。在PHE中，靠近流道附近的细胞凋亡较少，而组织更深处和更高区域的细胞凋亡较多。

该装置用于估算阿霉素在肿瘤组织中的扩散系数。实验测得的数值与先前报道的人类乳腺癌中的数值一致。在将PHE通入装置时，必须格外注意保持无菌状态，因为该操作需在细胞培养环境之外进行。

用足量乙醇喷洒罩子、注射器以及管路末端，以确保无菌。观看本视频后，您应了解药物在肿瘤中渗透受限的作用。我们展示了一种技术，用于模拟药物在三维肿瘤组织中的递送和系统清除过程，并量化其渗透程度。

消除穿透性差的药物将显著简化癌症药物研发过程。