微流控装置重新创建一个肿瘤微环境
November 20th, 2011
我们的程序重新异质性肿瘤微环境的微流体装置，制造和操作。肿瘤组织内的凋亡中的变异量化使用荧光染料和化疗药物到肿瘤组织中阿霉素的有效扩散系数进行了评价。
该程序的总体目标是演示微流体装置的制造和作，该装置可在体外重建肿瘤微环境并可用于测试化疗药物。这就是微流体装置。该设备可用于以下领域，易于体外化疗药物的测试。
它为测试三维肿瘤组织提供了一致和准确的结果，并且该设备提供了非常准确的体内肿瘤表示。微环境 肿瘤存在于 3D 微环境中，在 3D 微环境中进行测试的能力非常重要。该程序的第一步是组装设备，其中包括使用软光刻技术制造微流体芯片，在入口和出口处打孔，粘合到载玻片上以及用于流体入口和出口的连接管道。
接下来，使用悬滴法生成均匀的多细胞肿瘤类固醇以用于设备。然后将球体引入设备中，然后进行细胞凋亡、检测剂和化疗药物。最后，进行延时显微镜检查，然后对药物扩散系数进行数学估计，以量化化疗剂的渗透能力。
最终，通过使用延时荧光显微镜，可以获得显示组织在设备中生长、组织内形成异质微环境以及药物扩散到组织中的结果。抗癌药物对实体瘤的有限渗透是其失败的重要原因。目前的大多数癌症药物检测模型并不模拟实体瘤的三维性质。
我们开发了一种由连续灌注的三维肿瘤组织组成的微流控装置。该模型更准确地表示药物向实体瘤的递送及其全身清除。多细胞肿瘤类固醇是一种成熟的三维肿瘤组织模型。
在此过程中，悬滴法用于制造用于微流体装置的类固醇。这种方法可以在短时间内形成一致的类固醇。与单层细胞相比，在三维组织中体外测试化疗药物有助于以更有效的方式筛选药物。
将硅弹性体的 PDMS 和固化剂以 9：1 的重量比混合。然后将这种混合物倒在母版上，形成 4 毫米厚的眩光德加。要去除气泡，请在 60 摄氏度下固化 5 小时。
从模具中剥离固化的 PDMS，以在弹性体上获得流动特征的印记。然后使用安装在钻头上的一毫米半活检打孔器，按压入口和出口的打孔。拉出所有碎屑。
将邮票的特征面和干净的载玻片置于氧气等离子体中 8 分钟。在氧气等离子体刻蚀机中，立即使处理过的表面接触，以在它们之间形成键合。将组件放在载玻片加热器上保持 60 摄氏度至少 5 小时。
为了加强粘合，将 0.032 英寸内径的 PTFE 管连接到微流体装置的入口和出口。使用连接到带倒钩的母诱饵锁连接器的公诱饵锁连接器接口，这些特定的连接器用于轻松穿过它们而不会断裂。最后，使用截止阀和 Y 型连接器设置流通组件，将设备安装到显微镜上安装设备后，将管道连接到适当的入口和出口以完成流量设置。
如下图所示，这种配置允许将球体打包到设备中或创建通过设备进行包装的介质流的简便性和多功能性。打开填料入口阀 VPN，填料出口阀 VP 以肿瘤外。然后 OID 可以通过入口流入培养室，该室中的柱子将肿瘤固定在适当的位置以流动介质。
关闭填料阀，打开进流阀 VF in 和出流阀 VF out，以开始形成均匀的 PHE。在培养罩下使用悬滴法胰蛋白酶冰细胞。从离心机中取出所得胰蛋白酶细胞。
参考表 1 将储备液稀释至所需浓度。接下来，取下 48 孔板的盖子并将其倒置。在消毒罩中，用 1 毫升消毒水填充板的每个孔。
为了保持湿度，在盖子上的每个圆形区域滴入 20 微升的稀释细胞溶液滴。使用微量移液器，小心地倒置盖子并将其放在板上，确保液滴不要接触孔的边缘。在 37 摄氏度下孵育板。
请参阅表 1 了解基于使用的特定细胞的孵育持续时间，每个悬滴中都会形成类固醇。首先，通过流路入口用 70% 乙醇冲洗设备，对设备进行消毒。然后冲洗 PBS，然后冲洗 H-E-P-E-S 缓冲细胞培养基。
留下培养基注射器，连接到管路上。接下来，将两到三个类固醇吸入注射器水龙头注射器中。要去除气泡，请将注射器连接到设备的填料入口。
打开入口阀 VPN 并关闭 VFN，打开出口阀 VP out 并关闭 VF out。垂直握住填料注射器，针头朝下。观察类固醇沉降到注射器底部，进入针头的诱饵锁连接器。
推动填料注射器上的柱塞，观察 PHE 进入管道并流入设备，因为只有填料出口阀是打开的。类固醇将进入设备的腔室并被背面的柱子保留。一旦进入腔室，S 球体就会符合腔室的形状并获得矩形几何形状。
关闭入口阀 VPN 和出气阀 VP 出，将流量注射器 SF 安装在注射泵上。该泵由计算机作，使用注射泵 pro 打开入口阀 VFN 和出口阀 VF out。以每分钟 3 微升的速度开始将培养基流入设备。
球状体孵育 24 小时后引入细胞凋亡检测剂。在引入细胞凋亡、检测或治疗剂之前，让球状体平衡长达 24 小时，以建立营养梯度和微环境。然后关闭阀门 VFN。
停止注射泵。从泵中取出注射器，将其更换为含有 0.25 μL/mil CASP 辉光红色活性 Caspase 三标记物的培养基的注射器。通过设备手动冲洗 0.7 毫升溶液，用溶液清洗设备。
然后将注射器安装在泵上。重新启动液流并打开阀门 VFN。在 5 到 8 小时内，木桶手套红色活性 cph 阶段 3 将扩散到组织中，并在凋亡区域发出更亮的荧光 该浓度的细胞凋亡检测剂在所有后续的 Flow 溶液中保持不变。
阿霉素 在引入细胞凋亡检测剂后 5 至 8 小时引入。这种处理通过冲洗从系统中清除。要添加化疗药物，请按照细胞凋亡检测程序引入 10 μmol 盐酸阿霉素。
然后用 0.7 毫升培养基的注射器更换治疗注射器。继续治疗剂的流动一段时间。然后关闭阀门 VFN 并关闭注射泵。
从注射泵中取出治疗注射器，换上含有 0.7 毫升培养基的注射器。让新鲜培养基流动 24 至 36 小时，同时在显微镜下持续监测组织。延时显微镜的整个采集过程在 IP 实验室中使用自定义脚本自动化，每 30 分钟以 10 倍放大倍率采集 PAX Foid 的透射光和荧光图像 对于药物扩散系数的数学估计，第一步是使用图像 J 生成 docs 荧光的平均线性强度分布。 或包含腔室中组织的 ROI。
使用 plot profile 命令生成平均强度的剖面，作为与流道距离的函数关系。重复最多三个不同的时间点。接下来，从获得的强度曲线中减去平均背景荧光强度，并使用相应的最大强度对每个曲线进行归一化，以获得 C 作为 X 和 T 的函数。
下一步是评估肿瘤组织 docs 中 docs 的有效扩散系数。扩散可以用以下方程表示，其中 ERFC 是互补误差函数。X 是从通道进入组织的距离，T 是引入阿霉素后的时间。
在考虑的每个时间点使用以下迭代方案。猜测 D.Calculate 每个位置的方程右侧的值。X.计算两边误差的平方和，修改 D 以最小化残差平均值。
在每个时间点获得的 D 的最佳值，以估计阿霉素在组织中的平均有效扩散系数。微流体设备提供了一个 1 毫米 x 0.3 毫米 x 0.15 毫米的光学可接近的培养室，用于三维肿瘤组织的生长。悬滴法允许从多种细胞系中快速形成大小和形状一致的肿瘤 PHE。
PHE 在设备上成功生长长达三天。腔室中的生长与微环境的可重复修饰有关。在 phe 中，细胞凋亡在靠近流道的细胞中发生得较少，并且在组织中发生得更高、更深。
该装置用于估计阿霉素和肿瘤组织的弥散系数。实验保持值与之前在尝试此程序时在人类乳腺癌中报告的值一致。将 PHE 流入设备时，必须格外小心地保持无菌状态，因为它必须在细胞培养之外进行。
罩内用乙醇大量喷洒注射器和管子末端，以确保无菌。看完这个视频，你应该对药物有限渗透到肿瘤中的作用有所了解。我们已经展示了一种模拟药物在三维肿瘤组织上的递送和全身清除并量化其渗透的技术。
消除渗透性差的药物将显着简化癌症药物的开发过程。
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概述
本文介绍了制造和操作微流控装置的程序，该装置旨在体外重现异质性肿瘤微环境。该装置可用于测试化疗药物，提供更准确的体内肿瘤条件表示。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 肿瘤学
- 药物测试
背景
- 微流控装置可以模拟复杂的生物环境。
- 异质性肿瘤微环境对于准确的药物测试至关重要。
- 了解肿瘤中的药物扩散对于有效治疗至关重要。
- 荧光染色可以定量分析细胞过程，如细胞凋亡。
研究目的
- 展示微流控装置的制造。
- 重建体外测试的肿瘤微环境。
- 评估化疗剂如多柔比星的扩散。
使用的方法
- 使用软光刻术制造微流控芯片。
- 为流体进出口打孔。
- 将芯片与玻璃片结合。
- 连接管道以实现流体流动。
主要结果
- 该装置为药物测试提供了一致和准确的结果。
- 它有效地模拟了肿瘤组织的3D结构。
- 实现了肿瘤组织内细胞凋亡变异性的定量分析。
- 评估了多柔比星的有效扩散系数。
结论
- 微流控装置是癌症研究的有价值工具。
- 它增强了对肿瘤内药物相互作用的理解。
- 这种方法可以导致改进的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Recreating the tumor microenvironment in vitro addresses a critical gap in oncology drug discovery by enabling predictive assessment of drug penetration and efficacy in heterogeneous, three-dimensional tissues. This microfluidic platform supports early de-risking of candidate compounds by modeling nutrient gradients and cellular heterogeneity that drive therapeutic resistance. Integrating such physiologically relevant models into the discovery pipeline enhances translational confidence and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of drug penetration and retention in 3D tumor-like tissues.
- Supports functional validation of targets under physiologically relevant gradients.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling viable, quiescent, and necrotic cell zones.
- Improves predictive confidence for compound triage and prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for quantitative drug diffusion and apoptosis assays.
- Standardizes 3D spheroid formation for consistent assay outputs across cell lines.
- Enables time-lapse microscopy and automated image analysis for high-content screening.
- Supports scalable evaluation of compound efficacy in complex tissue contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response with in vivo tumor heterogeneity for translational continuity.
- Enables estimation of diffusion coefficients relevant to human tumor tissues.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling drug clearance and microenvironmental effects.
- Facilitates biomarker discovery linked to spatial apoptosis patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic model bridges early discovery and preclinical validation by providing a physiologically relevant assay for drug penetration and efficacy. It is positioned for integration from target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Quantifies drug diffusion and apoptosis gradients to clarify mechanistic barriers to efficacy.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound comparison in 3D tissue contexts.
- Analytics: Enables mathematical estimation of diffusion coefficients and spatial intensity profiles.
- Translational Research: Models clinically relevant microenvironments to inform preclinical decisions.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, reusable platform for oncology drug development workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for 3D models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by modeling key resistance mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, 3D cell culture, and quantitative imaging.
- Needs access to soft lithography, time-lapse microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands rigorous sterility and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation across cancer cell lines is supported by the hanging drop spheroid method.
- Practical limitations include device handling outside of sterile hoods and short-term culture duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Introduction
2:52
Microfluidic Device Fabrication
5:45
Formation of Uniform Tumor Spheroids using the Hanging Drop Method
7:04
Introduction of Spheroids into the Microfluidic Device
9:18
Introduction of Apoptosis-detecting Agent into the Microfluidic Device
10:50
Introduction of Therapeutic Agents into the Microfluidic Device
11:59
Time Lapse Microscopy and Estimation of Drug Diffusivity Coefficients
14:25
Representative Results
15:30
Concluding Remarks
