Name: Respirometric皂甙通透心脏纤维的氧化磷酸化的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学习使用皂甙通透心脏纤维结合高分辨率呼吸测量法评估线粒体氧化磷酸化功能。该方法通过监测氧消耗精确测量心肌生物能量学特性，适用于小鼠心脏组织及多种动物模型。

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本研究由加拿大卫生研究院和基因组加拿大提供资助。JS 获得了阿尔伯塔医学研究遗产基金会、加拿大心脏与中风基金会以及加拿大糖尿病协会的薪金支持奖励。实验室感谢 Oroboros Instruments 在获取皂苷透化纤维技术过程中提供的技术支持。

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无利益冲突声明。

皂苷透化心肌纤维技术在 体外 和 体内 线粒体OXPHOS耗氧量的评估。该技术的优势在于相较于分离的线粒体，其具有更高的生理相关性，因为细胞结构得以保留。尽管质膜被降解，但包括线粒体在内的细胞内膜结构仍保持完整。12, 14，肌浆网14，肌丝和细胞骨架 1, 17 保持完整。此外，线粒体与细胞骨架之间的相互作用1, 17 也保持不变。在透化的肌纤维中，线粒体表现出更高的稳定性。啮齿类动物的肌纤维样本可在冰冻保存液中保存6小时，而人类肌纤维样本的稳定性可达24小时。18,2线粒体与孵育溶液之间会发生快速平衡，从而可直接通过添加底物、抑制剂和解偶联剂来调控电子传递链的特定位点并进行分析。1, 5此外，这一点 原位 该技术仅需几毫克组织。
皂苷透化纤维技术的局限性不容忽视。心肌线粒体具有异质性，由两种亚群组成：肌膜下线粒体和肌原纤维间线粒体。原位线粒体呼吸测定法能够评估总体线粒体群体，...

<table><tbody><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;#8242;二磷酸腺苷单钾盐二水合物（ADP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，基本不含脂肪酸&amp;#8211;自由</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5&amp;#8242;三磷酸腺苷二钠盐水合物（ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>羰基氰化对-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基&amp;#8211;thylether)-N,N,N&amp;#8242;，N&amp;#8242;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>辉瑞制药有限公司</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>乳糖酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;，N&amp;rsquo;四甲基对苯二胺二盐酸盐（TMPD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>氰化钾</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>浓度 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>拜耳集团</td><td></td><td>隆朋</td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR国际</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯离心管</td><td>VWR国际</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯离心管</td><td>VWR 国际公司</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>直头珠宝镊</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>弯头珠宝镊</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>直型手术剪</td><td>George Tiemann &amp;amp; 公司</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>VWR 国际公司</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m 注射器滤器</td><td>VWR 国际公司</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>VWR国际</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>VWR 国际公司</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>12孔聚苯乙烯组织培养板</td><td>VWR 国际公司</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>平板搅拌器</td><td>VWR国际</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 微量移液条</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>VWR 国际公司</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton 微量注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton 微量注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;l Hamilton 微量注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 挤压瓶</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯称量皿</td><td>VWR 国际公司</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

皂素透化心肌纤维中呼吸测定法评估氧化磷酸化

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

线粒体功能的研究是心脏生理学的重要参数，因为线粒体参与能量代谢、氧化应激、细胞凋亡、衰老、线粒体脑肌病以及药物毒性等过程。鉴于此，测量心脏线粒体功能的技术备受关注。其中一种采用整合方法来测定线粒体功能的技术是呼吸测定法中的氧化磷酸化（OXPHOS）分析。
呼吸测定法评估氧化磷酸化（OXPHOS）的原理基于利用克拉克电极测量氧浓度。当透化的肌纤维束消耗氧气时，密闭腔室中的氧浓度下降。通过选用特定的底物-抑制剂-解偶联剂滴定方案，可将电子供给电子传递链的特定位点，从而评估线粒体功能。在进行线粒体功能的呼吸测定分析之前，需采用机械和化学预处理技术使肌纤维的肌膜透化。化学透化法利用皂苷选择性地穿孔细胞膜，同时保持细胞结构的完整性。
本文详细描述了制备皂苷透化心肌纤维以进行耗氧量测量、从而评估线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能的各个步骤。此外，还提供了故障排除建议，以及可用于检测电子传递链特定部位线粒体功能的特定底物、抑制剂和解偶联剂。重要的是，该实验方案可轻松应用于多种动物模型及人类样本的心肌和骨骼肌组织。

皂苷透化纤维制备结合呼吸测定法分析氧化磷酸化，可对线粒体功能进行整体性评估。生理和病理状态下的线粒体呼吸可反映多种调控因素的影响，包括线粒体间的相互作用、形态学特征及生物化学特性。

线粒体功能的研究是心脏生理学的重要参数，因为线粒体参与能量代谢，……

本实验的总体目标是制备用于极谱法测量的皂苷透化心肌纤维。首先从鼠类体内取出心脏，完成心脏的摘除。实验的第二步是通过机械方法制备心肌纤维束，每束包含最多六至八根松散连接的纤维。接下来，使用皂苷对心肌束进行化学透化处理。然后用代谢物清洗液彻底洗去心肌束中残留的皂苷。最终可通过极谱法测量获得结果，从而深入了解线粒体氧化磷酸化过程。大家好，我是来自卡尔加里大学生物化学与分子生物学系简·希尔博士实验室的Curtis Huey。今天我们将向您展示一种制备皂苷透化心肌纤维的实验方法。我们实验室利用该方法在原位评估线粒体氧化磷酸化功能。那么我们开始吧。首先，取出海洋生物的心脏，放入含有冰上预冷的RP溶液的培养皿中。在解剖显微镜下，仔细去除所有结缔组织和脂肪。沿室间隔将心脏切成两半，从左心室心内膜表面切取10至25毫克（湿重）的组织。确保切口沿心肌纤维走向进行，以尽量减少对心肌的机械损伤。将分离出的组织小样本放入另一盛有置于冰上的RP溶液的培养皿中。沿心肌纤维走向将心脏切成直径为1至1.5毫米的纵向条状。使用手术刀和极为锋利的镊子小心地将条状组织缩短至2至4毫米长度。机械分离纤维束。最终的纤维束应包含最多六到八根纤维，这些纤维通过小面积的接触连接在一起，湿重在1至3毫克之间。从外观上看，心肌组织应从最初的红色变为浅粉色。开始心肌纤维束制备时，将12孔板置于冰上。用 RP 溶液冲洗各孔，以尽量减少钙污染。向其中一个孔中加入 3 毫升含 50 微克/毫升皂苷的冰冻 RP 溶液。然后将机械制备的肌纤维束转移至该孔中。将纤维束置于冰上，轻轻搅拌孵育20分钟。用镜面五号溶液润洗新孔，移取10毫升预冷的镜面五号溶液至新孔中。将心肌束转移至该孔中，置于冰上轻轻搅拌孵育10分钟。孵育后，重复使用镜面五号溶液。每次用新鲜的镜面五号溶液洗涤两到三次。每次将心脏束转移至10毫升冰冻的镜面五号溶液中。重复洗涤步骤旨在确保在进行呼吸分析前，彻底去除肌纤维束中的皂苷 A-T-P-A-D-P 及任何残留的底物。使用镊子将单个肌纤维束置于吸水表面轻轻按压，保持五秒或直至所有水分被吸干，以获取其湿重。使用另一块吸水表面，将镊子上多余的液体吸除。撕下秤量纸，将纤维束置于塑料称量盘上进行质量测定。将心肌纤维束转移至另一含有冰冻的n-5溶液的新孔中。此时，纤维束已准备好进行耗氧量评估。以下验证滴定使用双室滴定进样XI图进行。这些实验可根据呼吸测压研究的实验和诊断目的，作为独立方案执行，或纳入滴定方案中。此处使用的ERO GRA 2K可测量氧浓度。该设备连接至配备 DAT 实验室软件的计算机，可在整个实验过程中将氧气浓度的变化报告为实时的氧气消耗量测量结果。在将心肌纤维放入 XI 移植腔之前，先向容纳极谱式氧气传感器（POS）的腔室中加入 2.1 毫升的镜面五号溶液。当腔室关闭后，每个 XI 移植腔中将含有 2 毫升的镜面五号溶液。在37摄氏度下，为镜面五提供充足的空气饱和和平衡时间。平衡完成后，将心肌纤维样本放入镜面五中，该镜面五位于由聚碘搅拌的XI移植物腔室内，使用氟化涂层搅拌子。使用充满氧气的注射器将 GRAT 装置中的氧气浓度提高至 250 至 550 微摩尔之间。用 10 微升 Hamilton 注射器加入氧气后，静置 5 至 10 分钟，使氧气浓度达到稳定。向装置中加入 10 微升 2 摩尔的谷氨酸溶液，使其终浓度为 10 毫摩尔。然后使用另一支 Hamilton 注射器加入 5 µL 的 800 mmol/L 苹果酸，使反应室内的终浓度为 2 mmol/L。此滴定用于测定基础状态复合物 I 支持的呼吸。滴定后，氧通量应在约五分钟内趋于稳定，从而可确定状态 II 的耗氧量，即基础耗氧速率。若在持续稳定耗氧 2 至 5 分钟后仍未加入 DP，则使用 25 微升 Hamilton 微量注射器加入 20 微升 500 毫摩尔的 DP，使终浓度达到 5 毫摩尔，实现饱和。该浓度可使饱和度超过 90%，从而测定最大呼吸状态。三、通过复合体 I 的线粒体呼吸允许再持续 2 至 5 分钟的稳定耗氧。然后使用10微升Hamilton微量注射器加入5微升4毫摩尔的细胞色素C，使其终浓度为10微摩尔。此时的氧浓度用于对外膜线粒体完整性进行质量控制分析。在氧消耗稳定持续另外2至5分钟后，加入1微升4毫克/毫升的ACIN以抑制ATP合酶。该滴定步骤用于验证线粒体内膜的完整性。在重复进行氧化磷酸化评估后，取出样品用于干重或线粒体标志物测定。然后从XI Grat的玻璃腔室中取出镜面五。用蒸馏水至少清洗小室三次。随后用100%乙醇再清洗小室至少三次，以去除可溶于乙醇的抑制剂，例如寡霉素。随后用70%乙醇再清洗两次。然后加入70%乙醇，使XI移植物室浸泡30分钟以达到灭菌目的。最后，用双蒸水至少洗涤含有POS的室五次。在正确制备的镜像心肌纤维中，耗氧量通过质量控制方案进行评估，其中呼吸控制比（RCR）反映了透化肌纤维制备物中耗氧量与氧化磷酸化的偶联情况。RCR 是指状态三相对于状态二的呼吸速率，或者 alternatively 为状态三与状态四之比，良好偶联的完整线粒体样本（模拟心脏组织制备物）的 RCR 通常在 3 至 6 之间。细胞色素 C 滴定用于验证组织制备是否得当。细胞色素 C 是一种定位于线粒体内膜间膜间隙的蛋白质。当线粒体外膜完整时，内源性细胞色素 C 保留在膜间隙中，外源性细胞色素 C 的滴定对呼吸作用影响极小。相反，若线粒体外膜受损，内源性细胞色素 C 可从膜间隙释放，导致呼吸抑制，直至添加外源性细胞色素 C，从而可评估病理或实验应激因素对线粒体外膜完整性的影响。添加 CIN 用于评估泄漏呼吸（leak respiration）的变化，即不参与磷酸化作用的耗氧量。磷酸化控制或野生型肌纤维应对 CIN 的添加敏感，并表现出显著的氧通量下降。低RCR值以及对寡霉素的敏感性降低导致相对升高的氧通量，表明在线粒体分离制备过程中内膜受到损伤。如本图所示，底物抑制解偶联滴定缺乏响应，可能提示sasin及去膜肌纤维束在RP和mirror five溶液中孵育时间过长。后续实验应尽量缩短动物处死后至耗氧量测量之间的时间间隔。我们刚刚向您展示了如何制备用于极化图形测量的心肌纤维束。在进行此操作时，必须注意在机械分离心肌纤维的过程中要格外小心。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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生物学

Respirometric皂甙通透心脏纤维的氧化磷酸化的评估

以下方案描述了用于定量测定离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的缓冲液的配制与使用方法。同时讨论了样品分析和数据解读所采用的方法。...

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使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

高分辨率呼吸测定结合荧光传感器可测定线粒体的耗氧量和活性氧（ROS）的生成。本方案描述了一种用于评估通透化坐骨神经中线粒体呼吸速率和ROS产生的技术。...

通过高分辨率呼吸测定法评估坐骨神经中的线粒体功能

马具有卓越的有氧运动能力，因此马的骨骼肌是研究马运动生理学以及哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了对马骨骼肌线粒体功能进行全面评估的技术方法。...

高分辨率荧光-呼吸测定法用于马骨骼肌

通过高分辨率呼吸测定法分析精子线粒体功能，可在封闭式反应室系统中测量自由运动精子的耗氧量。该技术可用于测定人类精子的呼吸作用，从而提供有关精子线粒体特征及其完整性的信息。...

高分辨率呼吸测定法评估人类精子线粒体功能

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

本文中，我们描述了一种用于定量测定氧消耗率和细胞外酸化率的详细方案 离体...

评估完整再生斑马鱼心室的代谢活性 离体 使用细胞外通量分析法

学习使用皂甙通透心脏纤维结合高分辨率呼吸测量法评估线粒体氧化磷酸化功能。该方法通过监测氧消耗精确测量心肌生物能量学特性，适用于小鼠心脏组织及多种动物模型。

皂素透化心肌纤维中呼吸测定法评估氧化磷酸化

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