清醒大鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹技术

本实验的总体目标是评估清醒且未束缚大鼠的胰岛素敏感性。首先通过插管左颈动脉实现采血，随后对右颈静脉进行插管，以确保获得最佳实验结果。

导管在术后五天恢复期间每天冲洗，以保持通畅。最终，可通过高胰岛素-正血糖钳夹技术获得显示全身葡萄糖输注速率的结果。该技术的主要优势在于，可在生理性的高胰岛素水平下直接测定全身葡萄糖处置速率。

动脉和静脉导管必须在手术前预先准备好。导管应具有钝端，充满肝素化生理盐水，并用乙醇灭菌，同时分别在距动脉导管和静脉导管一端 2.7 或 3.2 厘米处牢固连接一个限位头。本实验使用约 300 克重的成年雄性喷雾多利大鼠。

记录动物的初始体重，并利用该体重监测术后体重增长情况。在无菌手术区域内操作。将大鼠放入麻醉盒中，使用3%异氟烷进行麻醉。

将动物移离手术区域，并通过去除颈部和肩部周围的毛发来准备切口部位。去除毛发后，将动物置于鼻罩中，以约2%异氟烷维持麻醉。将动物固定在手术台上。

通过检查足部和/或眼部反射来确认大鼠已完全麻醉。用70%乙醇清洁切口部位，随后用碘伏擦拭，再用70%乙醇重复清洁。手术的第一步是在胸骨上方10毫米处作一垂直正中切口。

使用弯头显微解剖镊钝性分离组织，暴露左侧胸锁乳突肌。将该肌肉向一侧牵开，以显露约一厘米长的左侧颈总动脉。将显微解剖镊置于颈总动脉下方，固定血管位置，同时轻柔剥离周围结缔组织。

在不损伤动脉或神经的前提下，必须将迷走神经与动脉分离。使用无菌4-0丝线结扎头端。用带齿显微解剖镊夹住血管。

穿刺结扎的血管。末端连接21号静脉采血多样本采集适配器。移除导管中的不锈钢塞，使用无菌导管引入器引导进入动脉。

使用镊子确保导管固定。部分松开显微解剖镊，夹闭动脉，并继续插入导管直至到达小珠处。此时，导管尖端应位于主动脉弓内。

在珠子下方固定两根缝线，上方固定一根缝线，并用每毫升含10单位肝素的生理盐水冲洗管路。为确认导管功能正常，使用不锈钢塞子重新封闭导管的外端。接着钝性分离组织，暴露右侧颈外静脉，仔细游离该静脉并结扎头静脉。

用丝线缝合结束。用21号静脉穿刺针穿刺静脉。推出多样本诱捕适配器。

移除导管上的不锈钢塞，使用无菌导管引入器将导管插入至珠段位置。在珠段下方固定两根缝线，上方固定一根缝线，并用每毫升含10单位肝素的冰盐水冲洗导管。

为确认导管能够采样，使用14号钝针将导管的外端经皮下穿至背部肩胛骨之间，并在此处做切口。接着，将导管通过钝针穿出，使其从大鼠背部露出。每根导管应有约4厘米长度外露。

剪取0.5厘米长的Tigon S 50 HL医用导管，套在两根外置的导管上。静脉端用蓝色胶带固定，动脉端用红色胶带固定。重新测试导管以确保通畅，然后用每毫升含150单位肝素的生理盐水冲洗并充满导管，以防止凝血。

使用3-0丝线缝合所有切口。将大鼠置于预热的清洁笼子中，呈俯卧位，并确保食物易于获取。待大鼠完全恢复自主活动能力及清醒状态后，将其放回饲养笼中。

让大鼠恢复三到五天，每天监测感染、疼痛及体重变化。在整个研究过程中，必须保持导管通畅。术后每天用150单位/毫升的肝素化生理盐水填充1毫升无针式注射器，并用22号钝头针头盖住针尖。

将钝针插入一段长20厘米的PE 50导管中，导管另一端连接23号不锈钢管接头。务必从管路中彻底排除所有气泡。用止血钳夹闭从大鼠体内引出的动脉导管，夹闭位置位于塞子正下方。

使用另一把止血钳取下钢制导管塞。将连接注射器的管路接头插入动脉管路中，并松开夹闭外置动脉导管的止血钳。接着，用注射器抽吸导管内的动脉血。

如果导管抽吸不畅，可能需要非常轻柔地通过导管推入少量溶液，以使导管尖端松动。导管视为已通畅。当血液到达注射器时，夹闭靠近1毫升注射器的P 50管路，并丢弃该注射器。

更换为装有新鲜肝素冰盐水的新注射器。松开管路夹，同时将新注射器保持直立，轻弹注射器，使气泡向上移动并远离管路。注入肝素化生理盐水，直至导管管路清晰且无血液残留。

夹闭动脉管路位于管路耦合器下方的位置。将动脉导管管路上的注射器接头取下，并替换为不锈钢管塞。松开夹闭外置动脉导管的止血钳。

对静脉管路重复此操作。由于静脉压力较低，可能无法完成采样。通常情况下，如果肝素化生理盐水能够以极小的阻力注入，则表明导管在静脉内的位置良好。

开始实验操作前，必须称量动物体重、配制溶液并组装夹具装置。在称量动物体重并确认导管通畅后，将其放入带有垫料的小容器中，垫料应限制但不完全限制其活动。本研究所用大鼠需禁食至少五小时，并已达到术后体重增长要求。大鼠的体重决定了此处所需胰岛素的剂量。

以每分钟 2 微升的速度给予每千克每分钟 4 毫单位的药物。配制 50% 葡萄糖溶液，并确保两种溶液的量均足以维持约两个小时，此处使用 3 毫升注射器。现在可以准备组装夹具装置了。

按照此处所示设置管路和输液泵。将葡萄糖和胰岛素注射器放置在注射泵上。夹闭管路，让大鼠在开始实验前休息 30 分钟。

开始实验操作时，采集基础胰岛素和血细胞比容样本；血细胞比容采样可确保实验过程中血容量维持稳定。通常，血细胞比容水平下降不应超过初始值的10%。采集基础血糖样本，并测定待钳夹的血糖水平。

此处我们将血糖水平钳制在5毫摩尔/升。每次采集血样后，用少量每毫升含10单位肝素的生理盐水冲洗动脉导管，以防止凝血。在确定需钳制的葡萄糖水平后，开始输注胰岛素溶液。

每5到10分钟记录一次血糖，并根据需要调整葡萄糖输注速率，直至达到稳态。该过程通常需要通过反复试验进行，可能耗时从30分钟到两小时以上不等。维持血糖水平所需的葡萄糖量取决于具体的实验方案。

要被视为达到稳态，需满足特定物种和条件，即连续三次读数均落在预设范围内。若三次读数彼此相差约一毫摩尔，则表明葡萄糖水平已达到稳态记录。为维持血糖水平在30分钟内稳定所需的葡萄糖输注速率，在此期间至少还需采集额外的血液样本。

在钳夹过程结束后，应采集第二份血浆胰岛素和血细胞比容样本。动物可继续用于后续实验，或实施安乐死后采集组织以进行进一步分析。如果操作得当，根据动物情况，导管可保持通畅五至七天。

钳夹法可测量稳态胰岛素敏感性。必须记录胰岛素和葡萄糖水平，以及葡萄糖输注速率和血细胞比容值。当葡萄糖水平在30分钟内保持在相差1毫摩尔以内的范围内时，即达到稳态。

葡萄糖输注速率反映了在可能的情况下维持目标血糖水平所需的外源性葡萄糖量，该速率应随时间绘制曲线，而非仅取单个时间点的平均值。应同时报告空腹状态和胰岛素钳夹期间的胰岛素水平。这些指标可证实胰岛素已成功递送，并能检测不同处理组之间胰岛素反应的差异。在实验开始前测量血细胞比容水平，并在操作后再次测量，以确保在整个实验过程中血细胞比容水平下降未超过基线值的5%。遵循此操作流程。

其他方法，如使用同位素示踪剂，可用于评估整体及特定组织的葡萄糖利用情况。