Name: 在自觉大鼠高胰岛素 - 正常血糖钳 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学习高胰岛素-正常血糖钳夹技术评估清醒大鼠胰岛素敏感性。该方法通过颈动脉和颈静脉插管直接测量全身葡萄糖处置率，为代谢疾病研究提供可靠的体内评估手段。

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本研究由加拿大卫生研究院和基因组加拿大提供资助。JS 获得阿尔伯塔医学研究遗产基金会、加拿大心脏与中风基金会以及加拿大糖尿病协会的薪金支持奖项。特别感谢 David Wasserman 博士和 Bingle Bracy 向 Shearer 实验室传授该实验技术。

A：动脉和静脉循环的外科插管
第一部分：动脉和静脉导管准备
<ol>
	<li>截取15厘米长的PE-50管（内径0.58 mm (0.023")，外径0.965 mm (0.038")）。另截取一段1毫米长的硅胶管（内径0.76 mm (0.030")，外径1.65 mm (0.065")）作为固定珠。固定珠的作用是防止大鼠在置管后将导管拉出。</li>
	<li>将显微解剖镊的尖端插入固定珠的管腔内，轻轻撑开镊尖以扩大开口。用另一对显微解剖镊将硅胶管沿固定珠的管腔推入。使用强效粘合胶（Loctite超级胶水）固定。固定珠必须平整地贴合在导管周围。将导管放置24小时使其完全干燥。</li>
	<li>对于体重300克的大鼠，动脉导管长度约为从固定珠起2.7厘米，颈静脉导管长度约为3.2厘米。当大鼠体重每增加100克，导管长度需相应增加0.5厘米。切勿将导管末端削成斜面，以免插入时刺穿血管。</li>
	<li>手术前立即用肝素化生理盐水（10 U/mL）充满导管管路，两端用不锈钢管塞密封，并置于70%乙醇中进行消毒。插入前需空气干燥。</li>
</ol>
第2部分：手术准备
<ol>
	<li>实验方案已获卡尔加里大学动物护理与使用委员会批准，并遵循加拿大实验动物科学协会的实验指南。以下所述操作均在成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300 g）上进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，尽管也可使用注射类麻醉剂。所有外科手术均需确保无菌技术操作。手术器械、烧杯和肝素化生理盐水均经高压灭菌处理。外科手套、注射器和棉签由供应商提供无菌包装。</li>
	<li>称量大鼠并记录结果。体重数据在术后动物监测中至关重要。只有体重恢复至术前水平的动物方可用于后续实验。将大鼠置于麻醉箱中进行麻醉（3%异氟烷），术中通过鼻罩维持约2%异氟烷麻醉。手术必须在已消毒的环境中进行，以保障无菌条件。</li>
	<li>通过去除手术区域（颈部和肩胛骨区域）的毛发来准备动物。可使用小型电动剪毛器或化学脱毛剂。该操作应在与手术区域分离的空间中进行。</li>
	<li>将动物固定于手术台上。通过检查足部/眼部反射确认动物已完全麻醉。使用适当的皮肤消毒剂对手术部位进行消毒处理（70%乙醇→聚维酮碘擦洗→70%乙醇）。</li>
</ol>
第3部分：手术
<ol>
	<li>在胸骨上方1 cm处沿中线做一小的纵行切口（用镊子沿中线纵向提起皮肤，用剪刀或手术刀切开）。</li>
	<li>使用显微解剖镊钝性分离，暴露左侧胸锁乳突肌。将该肌肉牵开，以暴露约1 cm长的左侧颈总动脉。将显微解剖镊置于颈总动脉下方，固定动脉位置。轻柔剥离颈总动脉周围的结缔组织。重要的是在不损伤动脉或神经的前提下，将迷走神经与动脉分离。分离动脉后，用4-0丝线结扎近心端（该结扎线将在手术过程中用于操控颈总动脉）。注意：4-0缝线在使用前应以70%乙醇灭菌。</li>
	<li>用带齿的显微解剖镊夹闭血管。用21号VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter穿刺已结扎的远端。取出不锈钢管塞，借助无菌导管导入器小心插入导管，使其进入动脉。确认导管被镊子固定后，部分松开夹闭动脉的显微解剖镊，继续将导管推进至导管头端的珠状标记处。此时，导管尖端应位于主动脉弓。注意切勿松开导管，否则血管压力会将其推出。</li>
	<li>在珠状标记下方牢固结扎两道4-0丝线，上方结扎一道，确认导管可正常采样。用含10 U/mL肝素的生理盐水冲洗导管通路。用不锈钢管塞重新封闭导管外端。</li>
	<li>利用同一切口，钝性分离暴露右侧颈外静脉。仔细分离并用丝线结扎其近心端。用21号VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter穿刺静脉。取出不锈钢管塞，借助无菌导管导入器将导管插入至珠状标记处，并在珠状标记下方结扎两道缝线。在珠状标记上方再结扎第三道缝线，确认导管可正常采样。用含10 U/mL肝素的生理盐水冲洗静脉通路。用不锈钢管塞重新封闭导管外端。</li>
	<li>将14号钝头针在皮下穿行，于肩胛骨之间背部皮肤做一新切口。将导管经钝头针引导，从背部穿出体外，使约4 cm导管外露。剪取一段长约0.5 cm的Tygon S-50-HL医用管，套在两根外露导管上，并根据需要以胶带固定（静脉用蓝色，动脉用红色）。重新测试导管通畅性，用含150 U/mL肝素的生理盐水冲洗并充满导管，以防凝血。</li>
	<li>用3-0丝线缝合所有切口。将大鼠俯卧位置于预热的清洁笼内，食物放置于笼底。</li>
</ol>
B：术后护理
第1部分：术后即刻护理与监测
<ol>
	<li>当大鼠恢复完全的行走能力并恢复清醒后，将其送回动物饲养环境。</li>
	<li>让大鼠恢复 3 至 5 天。</li>
	<li>每天监测是否出现感染、疼痛及体重变化。如果观察到切口部位有分泌物、整体精神萎靡和/或疼痛表现，则可能存在感染风险。疼痛的表现包括蜷缩姿势、背部毛发竖立以及缺乏行走和/或进食行为。术后立即至术后三天内可能出现体重下降，但在 5 天内体重应趋于稳定和/或恢复至术前体重的 10% 范围内。严重的体重减轻可能提示感染、中风和/或疼痛。</li>
	<li>每天重新测试导管以确保其通畅性。</li>
</ol>
第二部分：维持导管通畅性
<ol>
	<li>术后恢复期间每天，用 150U/ml 肝素化生理盐水填充 1ml Slip Tip 注射器，并以 22 号钝头针封口。钝头针插入一段长 20cm 的 PE-50 管，PE-50 管另一端连接 23 号不锈钢管接头。</li>
	<li>将连接管接头的一端抬高至高于 1ml 注射器其余部分的位置，排出管路中的气泡。</li>
	<li>用止血钳在大鼠体外化的动脉导管塞下方夹闭导管。</li>
	<li>使用另一把止血钳取下钢制导管塞。</li>
	<li>将连接注射器的管接头插入动脉导管，松开夹闭体外化动脉导管的止血钳。</li>
	<li>将导管内的动脉血抽吸至注射器中。若导管不易抽吸，可非常轻柔地向导管内推注少量冲洗液，以解除导管尖端可能嵌入血管壁的情况。当血液到达注射器时，表明导管已完全通畅。</li>
	<li>在靠近 1ml 注射器处夹闭 PE-50 管，弃去该注射器。更换为装有新鲜 150U/ml 肝素化生理盐水的新注射器。松开管夹，将新注射器竖直持握，用手指轻弹注射器，使可能出现的新气泡向上移动并远离管路。注意：必须格外小心，因气泡可能导致中风。</li>
	<li>注入 150U/ml 肝素化生理盐水，直至导管内无血液残留，保持通畅。</li>
	<li>用止血钳在大鼠体外化的动脉导管上、管接头下方夹闭导管。将注射器连接头从动脉导管上取下，更换为不锈钢管塞。</li>
	<li>松开夹闭体外化动脉导管的止血钳。</li>
	<li>对静脉导管重复上述操作。但由于静脉压力较低，常难以完成采样。若 150U/ml 肝素化生理盐水能够以最小阻力注入，则表明导管在静脉内位置良好。</li>
</ol>
C：高胰岛素-正常血糖钳夹技术
第一部分：夹具的设置与准备
<ol>
	<li>称取大鼠体重并记录。该数据将用于确定胰岛素和葡萄糖输注速率。实验前至少禁食5小时，以确保动物处于餐后状态，并最大限度减少来自饮食的葡萄糖干扰。将大鼠置于带有垫料的小型容器或笼子中，限制其过度活动，但应保证动物能够自由转身和理毛。</li>
	<li>按照图1所示设置管路和输注泵。P50连接管的长度如下：注射器至Y型接头为8 cm，Y型接头至大鼠为15 cm，动脉管路为20 cm，静脉管路为10 cm。移除不锈钢管塞，用含10 U/ml肝素的生理盐水冲洗颈静脉和动脉管路，分别确保采样和输注通畅。</li>
	<li>确定所需胰岛素体积。该体积因大鼠体重和所需胰岛素水平而异。本实验中，以2 µL/min的速度给予4 mU/kg/min的胰岛素，属于高生理剂量。应尽可能减少输注体积。胰岛素应适当稀释，并在血浆存在条件下给药。本实验室使用含3%大鼠血浆的生理盐水溶液稀释胰岛素。胰岛素为HumulinR 100 U/mL（Eli Lilly），也可使用其他速效胰岛素。在将稀释后的胰岛素装入输注注射器前，需充分混匀。</li>
	<li>配制50%葡萄糖溶液。可直接将该溶液装入输注泵的注射器中，并在泵上标记“葡萄糖”以避免后续混淆。请确保胰岛素和葡萄糖的储备量充足。通常钳夹实验可持续约2小时。本方案中使用3 mL注射器。</li>
	<li>将葡萄糖和胰岛素注射器安装至Harvard Apparatus Model 11 Plus注射泵上。推动葡萄糖至Y型接头处，用止血钳夹闭管路；推动胰岛素至接近动物端，同样用止血钳夹闭管路。夹闭所有管路，使大鼠在实验开始前静息30分钟。注意：建议使用带尖端保护的止血钳，以避免管路被永久压扁。</li>
	<li>准备离心机及EDTA涂层试管用于血浆采集。在本研究中，将在动物达到钳夹状态后额外采集血液样本。</li>
</ol>
第2部分：实验方案
<ol>
	<li>应采集基础胰岛素样本和血细胞比容样本。血细胞比容检测可确保实验过程中血容量维持稳定。通常，血细胞比容水平下降不应超过初始值的10%。 </li>
	<li>获取基线葡萄糖样本（One Touch Ultra，LifeScan, Inc.），测定需维持恒定的全血葡萄糖水平。本实验中设定为维持正常血糖，即 5.0–5.5 mM（图2）。每次采集血样后，用少量含10U/ml肝素的生理盐水冲洗动脉管路，以防凝血。注意：输注前务必确保管路中无血凝块或气泡，否则可能导致动物发生中风。 </li>
	<li>开始胰岛素输注。每5-10分钟采集一次血糖，每次均监测血糖水平。根据需要调整葡萄糖输注速率，直至达到稳态。该过程通常为试错过程，可能需要30分钟至 &gt;2h. 维持血糖水平所需的葡萄糖量取决于实验方案、物种及所处条件（图2).</li>
	<li>稳态葡萄糖水平是指在规定范围内连续三次的血糖读数。此处，将三次读数在约1 mM范围内的结果视为达到稳态（例如4.8、5.2、5.6 mM）。一旦达到稳态，记录为维持该血糖水平在30分钟内所需的葡萄糖输注速率。在此期间可额外采集血样。至少应再采集一份血浆胰岛素样本和一份 hematocrit 样本。</li>
	<li>夹闭完成后，动物可用于进一步实验，或实施安乐死后采集组织以供进一步分析。根据动物个体情况，导管可保持通畅5-7天。</li>
</ol>
D：高胰岛素-正常血糖（胰岛素）钳夹实验结果
若操作正确，夹闭实验可评估大鼠的稳态胰岛素敏感性。在展示夹闭实验所得数据时，必须记录葡萄糖水平和葡萄糖输注速率。在至少30分钟的时间过程中，葡萄糖水平保持稳定（图3）表明已达到稳态。只有当全血葡萄糖浓度维持在约1 mM范围内时，才认为葡萄糖水平稳定。葡萄糖输注速率反映了为维持血糖稳定所需的外源性葡萄糖量。在可能的情况下，这些数据应以时间过程曲线的形式展示，而非单一的平均值（图4）。
建议报告的其他指标包括血浆胰岛素和血细胞比容。测定空腹和钳夹状态下的胰岛素水平，可确认胰岛素已成功给予，并能检测不同处理组之间胰岛素水平的差异（图5）。建议在胰岛素钳夹实验开始前和结束时均获取血细胞比容的测量值（图6）。这是为了确保实验过程中血细胞比容下降不超过5%，并避免由此引起的血容量和血流变化对葡萄糖代谢产生影响。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig1.jpg" alt="胰岛素-D50输注装置示意图；小鼠模型；通过Y型连接器进行动静脉输注以采集血液。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 实验装置。图1显示了在夹钳实验过程中未受束缚且清醒的大鼠。通过导管可在不接触动物的情况下进行血液采样和药物输注。左侧的泵分别用于输注胰岛素和葡萄糖。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig2.jpg" alt="血糖调节图；胰岛素-葡萄糖钳夹法；血糖随时间变化曲线。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 钳夹实验过程中预期的数据。为维持基础水平的血糖稳态（正常血糖，5 mM），需通过调节外源性葡萄糖（D50）的输注速率，直至达到基础水平或“钳夹”状态。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig3.jpg" alt="血糖水平图表；普通饲料组与高脂饮食组对比，折线图，营养学研究结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. 夹闭实验中预期的血浆葡萄糖结果。当动物处于“夹闭”状态时，血糖水平在不同时间和实验组之间相对稳定。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig4.jpg" alt="葡萄糖输注速率曲线图；普通饲料与高脂饲料；时间依赖性代谢反应分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 4. 夹钳实验中代表性的葡萄糖输注速率。维持血糖正常所需的外源性葡萄糖量存在差异。图中展示了对照组（普通饲料喂养）与高脂饲料喂养（胰岛素抵抗）动物的情况。高脂饲料喂养的动物需要输注更少的葡萄糖即可维持血糖稳定，这主要是由于其对输注的胰岛素不敏感。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig5.jpg" alt="饲料喂养与高脂喂养受试者中基础状态与实验状态下血浆胰岛素水平对比图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 大鼠代表性血浆胰岛素水平。在胰岛素钳夹过程中，血浆胰岛素水平应高于禁食状态下的基础水平，以确保在胰岛素钳夹期间胰岛素已正确给予动物。
<img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig6.jpg" alt="红细胞压积水平比较图表：普通饲料组 vs. 高脂饮食组；基线数据 vs. 实验数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 图 6. 红细胞压积的报告。必须获取并报告实验前基线红细胞压积以及实验后的红细胞压积。这可确保因过度动脉采血导致的红细胞压积下降不超过基线水平的 5%。

<ol><li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+basal+and+insulin-stimulated+skeletal+muscle+glucose+uptake+in+the+high-fat-fed+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+muscle+glucose+uptake+due+to+high+fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding.</a> Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo%3A+advantages%2C+limitations%2C+and+appropriate+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).</li>
<li>Cho, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+a+diabetes+mellitus-like+syndrome+in+mice+lacking+the+protein+kinase+Akt2+%28PKB+beta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta).</a> Science. 292, 1728-1731 (2001).</li>
<li>Dubois, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SHP-1+protein+tyrosine+phosphatase+negatively+modulates+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis.</a> Nat Med. 12, 549-556 (2006).</li>
<li>Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+to+glucose+tolerance+of+insulin-independent+vs.+insulin-dependent+mechanisms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).</li>
<li>Herbach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant-negative+effects+of+a+novel+mutated+Ins2+allele+causes+early-onset+diabetes+and+severe+beta-cell+loss+in+Munich+Ins2C95S+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice.</a> Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+insulin+resistance+in+mice+lacking+adiponectin%2FACRP30%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30.</a> Nat Med. 8, 731-737 (2002).</li>
<li>Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+spontaneously+hypertensive+rats+with+rosiglitazone+and%2For+enalapril+restores+balance+between+vasodilator+and+vasoconstrictor+actions+of+insulin+with+simultaneous+improvement+in+hypertension+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance.</a> Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lost in translation.</a> Diabetes. 58, 1947-1950 (2009).</li>
</ol>

实验程序已获卡尔加里大学动物护理与使用委员会批准，并遵守加拿大实验动物科学协会的实验指南。作者无任何利益冲突或披露事项。

最初为研究人类胰岛素敏感性而开发的钳夹技术，现已适用于其他物种，包括实验大鼠和小鼠。研究胰岛素抵抗的动物模型，对于理解胰岛素敏感性的病理生理机制及相关疾病，以及发现具有临床价值的治疗干预手段具有重要意义1,2。已有多种方法被用于评估动物的胰岛素敏感性3，包括葡萄糖耐量试验（GTTs）和胰岛素耐量试验（ITTs）的不同变体4-6，以及基于空腹稳态条件推导出的胰岛素敏感性/抵抗性指数7-9。然而，当胰岛素敏感性是主要实验目标且技术可行性不受限制时，胰岛素钳夹法仍是金标准。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中实施的最基本的钳夹操作。胰岛素以恒定速率输注，同时根据需要调整外源性葡萄糖的输注速率，以维持血糖水平稳定。通过植入动脉和颈静脉导管实现对动物循环系统的通路。由于动物应激（操作）和麻醉会影响葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，因此本操作采用并推荐使用能最大程度减少这些因素影响的模型。
胰岛素钳夹技术常用于糖尿病、心血管及药物研究。该操作的改进方法包括添加同位素示踪剂（放射性或稳定同位素），这些示踪剂具有强大功能...

<table><tbody><tr><td>管内聚乙烯导管（PE-50）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12B</td><td>内径0.58 mm（0.023&quot;）× 外径0.965 mm（0.038&quot;）</td></tr><tr><td>道康宁Silastic实验室导管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15C</td><td>内径0.76 mm（0.030&quot;）× 外径1.65 mm（0.065&quot;）</td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL医用导管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-1251</td><td>内径3.2 mm（0.125&quot;）× 外径4.7 mm（0.1875&quot;）</td></tr><tr><td>乐泰超级胶水</td><td>Grand Toy</td><td>32237</td><td>凝胶控制型</td></tr><tr><td>无菌外科刀片</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>弯头显微解剖镊</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-20</td><td>× 2</td></tr><tr><td>直头显微解剖镊</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-15</td><td>× 2</td></tr><tr><td>弯头止血钳</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-1135</td><td>× 2</td></tr><tr><td>直头止血钳</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-1130</td><td>× 2</td></tr><tr><td>止血钳尖端保护套</td><td>Robbins Instruments, Inc.</td><td>15.09-2-004</td><td></td></tr><tr><td>直头手术剪</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>VENOJECT多采样Luer接头</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>810127A</td><td>21号，1英寸</td></tr><tr><td>无菌导管导入器</td><td>BD Biosciences</td><td>406999</td><td></td></tr><tr><td>14号钝头针</td><td>BD Biosciences</td><td>511310</td><td>14号，2英寸</td></tr><tr><td>无菌外科缝合线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>1679H</td><td>丝线，3-0号</td></tr><tr><td>非无菌外科缝合线</td><td>Angiotech Pharmaceuticals, Inc.</td><td>SP116</td><td>丝线，4-0号</td></tr><tr><td>棉签</td><td>VWR international</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>四层纱布垫</td><td>VWR international</td><td>CA43845-062</td><td></td></tr><tr><td>小型动物无线剪毛器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>729063</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>IPN-45</td><td></td></tr><tr><td>麻醉车</td><td>Benson Medical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒液</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>Model 11 Plus注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702208</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢导管连接器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4434</td><td>23号，0.3英寸</td></tr><tr><td>不锈钢导管堵头</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4436</td><td>23号，0.5英寸</td></tr><tr><td>不锈钢钝头针</td><td>Instech Laboratories, Inc</td><td>LS22</td><td>22号</td></tr><tr><td>60度Y型连接器</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>STCY-22-05</td><td>22号</td></tr><tr><td>CritSpin微型毛细管离心机</td><td>Iris Sample Processing</td><td>CS12</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>VWR international</td><td>53550-778</td><td></td></tr><tr><td>50 ml聚丙烯离心管</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>1 ml塑料滑动接头注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3 ml塑料鲁尔锁接头注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>肝素抗凝注射液</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>102824</td><td>制造商：LEO Pharma Inc. 浓度：1000 IU</td></tr><tr><td>EDTA溶液</td><td>Promega Corp.</td><td>V4231</td><td>0.5 M，pH 8.0</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>ABB7983154</td><td>制造商：Hospira 0.9%氯化钠</td></tr><tr><td>50%葡萄糖</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td>8DEX012D</td><td></td></tr><tr><td>Humulin-R</td><td>Eli Lilly</td><td>HI-210</td><td>100 U/ml</td></tr><tr><td>1 ml胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand* Hemato-Seal密封剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-678</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand*微量毛细管离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>One Touch Ultra测试条</td><td>LifeScan, Inc.</td><td>AW 085-314H</td><td></td></tr><tr><td>One Touch Ultra血糖仪</td><td>LifeScan, Inc.</td><td>AW 085-314B</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>浓度：54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>红色实验室标签胶带</td><td>VWR international</td><td>89097-932</td><td></td></tr><tr><td>蓝色实验室标签胶带</td><td>VWR international</td><td>89097-936</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-913-88</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR international</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>VWR international</td><td>62344-641</td><td></td></tr></tbody></table>

清醒大鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹技术

Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

2型糖尿病（T2D）的患病率正在迅速上升。该病以胰岛素分泌不足或无法有效利用所分泌的胰岛素为特征，导致血糖水平升高。评估胰岛素敏感性的“金标准”是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，又称胰岛素钳夹法。在此操作中，以恒定速率输注胰岛素，导致血糖下降。为了维持血糖水平稳定，需向静脉循环输注外源性葡萄糖（D50）。维持稳态所需的葡萄糖输注量可反映胰岛素敏感性。本文展示了在长期置管、无束缚且清醒的大鼠中实施的基本钳夹操作。该模型可在对动物造成最小应激的情况下采集血液样本。在麻醉诱导后，沿中线做切口，对左侧颈总动脉和右侧颈外静脉进行插管。插入的导管用肝素化生理盐水冲洗后引出体外并固定。动物在实验前需恢复4至5天，并每日监测体重变化。仅选用体重恢复至术前水平的动物进行实验。实验当天，大鼠禁食后连接至含有胰岛素和D50的输液泵。通过动脉导管测定基础血糖水平，并作为整个实验过程中的参考基准（正血糖状态）。随后，以恒定速率向静脉循环输注胰岛素。为抵消血糖的下降，开始输注D50。若D50输注速率高于机体葡萄糖摄取速率，则血糖将上升；反之，若输注速率不足以匹配全身葡萄糖摄取，则血糖将下降。通过持续调节葡萄糖输注速率，直至获得稳定的血糖读数。记录并报告此稳定期间的血糖水平和葡萄糖输注速率。所得结果可作为全身胰岛素敏感性的指标。该技术可根据特定实验需求进一步优化。结合使用放射性示踪剂，可进一步增强该方法的应用，以测定组织特异性的胰岛素刺激葡萄糖摄取以及全身葡萄糖转化速率。

高胰岛素-正常血糖钳夹技术是评估胰岛素作用的“金标准”。通过以恒定速率输注胰岛素，促进葡萄糖的摄取。为抵消由此引起的血糖下降而输注的外源性葡萄糖量，可反映胰岛素敏感性。本文介绍在清醒、自由活动的大鼠中进行该操作的过程。

2型糖尿病（T2D）的患病率正在迅速上升。该病的特征是胰岛素分泌不足或无法有效利用体内产生的胰岛素，……

本实验的总体目标是评估清醒且未束缚大鼠的胰岛素敏感性。首先通过插管左颈动脉实现采血，随后对右颈静脉进行插管，以确保获得最佳实验结果。导管在术后五天恢复期间每天冲洗，以保持通畅。最终，可通过高胰岛素-正血糖钳夹技术获得显示全身葡萄糖输注速率的结果。该技术的主要优势在于，可在生理性的高胰岛素水平下直接测定全身葡萄糖处置速率。动脉和静脉导管必须在手术前预先准备好。导管应具有钝端，充满肝素化生理盐水，并用乙醇灭菌，同时分别在距动脉导管和静脉导管一端 2.7 或 3.2 厘米处牢固连接一个限位头。本实验使用约 300 克重的成年雄性喷雾多利大鼠。记录动物的初始体重，并利用该体重监测术后体重增长情况。在无菌手术区域内操作。将大鼠放入麻醉盒中，使用3%异氟烷进行麻醉。将动物移离手术区域，并通过去除颈部和肩部周围的毛发来准备切口部位。去除毛发后，将动物置于鼻罩中，以约2%异氟烷维持麻醉。将动物固定在手术台上。通过检查足部和/或眼部反射来确认大鼠已完全麻醉。用70%乙醇清洁切口部位，随后用碘伏擦拭，再用70%乙醇重复清洁。手术的第一步是在胸骨上方10毫米处作一垂直正中切口。使用弯头显微解剖镊钝性分离组织，暴露左侧胸锁乳突肌。将该肌肉向一侧牵开，以显露约一厘米长的左侧颈总动脉。将显微解剖镊置于颈总动脉下方，固定血管位置，同时轻柔剥离周围结缔组织。在不损伤动脉或神经的前提下，必须将迷走神经与动脉分离。使用无菌4-0丝线结扎头端。用带齿显微解剖镊夹住血管。穿刺结扎的血管。末端连接21号静脉采血多样本采集适配器。移除导管中的不锈钢塞，使用无菌导管引入器引导进入动脉。使用镊子确保导管固定。部分松开显微解剖镊，夹闭动脉，并继续插入导管直至到达小珠处。此时，导管尖端应位于主动脉弓内。在珠子下方固定两根缝线，上方固定一根缝线，并用每毫升含10单位肝素的生理盐水冲洗管路。为确认导管功能正常，使用不锈钢塞子重新封闭导管的外端。接着钝性分离组织，暴露右侧颈外静脉，仔细游离该静脉并结扎头静脉。用丝线缝合结束。用21号静脉穿刺针穿刺静脉。推出多样本诱捕适配器。移除导管上的不锈钢塞，使用无菌导管引入器将导管插入至珠段位置。在珠段下方固定两根缝线，上方固定一根缝线，并用每毫升含10单位肝素的冰盐水冲洗导管。为确认导管能够采样，使用14号钝针将导管的外端经皮下穿至背部肩胛骨之间，并在此处做切口。接着，将导管通过钝针穿出，使其从大鼠背部露出。每根导管应有约4厘米长度外露。剪取0.5厘米长的Tigon S 50 HL医用导管，套在两根外置的导管上。静脉端用蓝色胶带固定，动脉端用红色胶带固定。重新测试导管以确保通畅，然后用每毫升含150单位肝素的生理盐水冲洗并充满导管，以防止凝血。使用3-0丝线缝合所有切口。将大鼠置于预热的清洁笼子中，呈俯卧位，并确保食物易于获取。待大鼠完全恢复自主活动能力及清醒状态后，将其放回饲养笼中。让大鼠恢复三到五天，每天监测感染、疼痛及体重变化。在整个研究过程中，必须保持导管通畅。术后每天用150单位/毫升的肝素化生理盐水填充1毫升无针式注射器，并用22号钝头针头盖住针尖。将钝针插入一段长20厘米的PE 50导管中，导管另一端连接23号不锈钢管接头。务必从管路中彻底排除所有气泡。用止血钳夹闭从大鼠体内引出的动脉导管，夹闭位置位于塞子正下方。使用另一把止血钳取下钢制导管塞。将连接注射器的管路接头插入动脉管路中，并松开夹闭外置动脉导管的止血钳。接着，用注射器抽吸导管内的动脉血。 如果导管抽吸不畅，可能需要非常轻柔地通过导管推入少量溶液，以使导管尖端松动。导管视为已通畅。当血液到达注射器时，夹闭靠近1毫升注射器的P 50管路，并丢弃该注射器。更换为装有新鲜肝素冰盐水的新注射器。松开管路夹，同时将新注射器保持直立，轻弹注射器，使气泡向上移动并远离管路。注入肝素化生理盐水，直至导管管路清晰且无血液残留。夹闭动脉管路位于管路耦合器下方的位置。将动脉导管管路上的注射器接头取下，并替换为不锈钢管塞。松开夹闭外置动脉导管的止血钳。对静脉管路重复此操作。由于静脉压力较低，可能无法完成采样。通常情况下，如果肝素化生理盐水能够以极小的阻力注入，则表明导管在静脉内的位置良好。开始实验操作前，必须称量动物体重、配制溶液并组装夹具装置。在称量动物体重并确认导管通畅后，将其放入带有垫料的小容器中，垫料应限制但不完全限制其活动。本研究所用大鼠需禁食至少五小时，并已达到术后体重增长要求。大鼠的体重决定了此处所需胰岛素的剂量。以每分钟 2 微升的速度给予每千克每分钟 4 毫单位的药物。配制 50% 葡萄糖溶液，并确保两种溶液的量均足以维持约两个小时，此处使用 3 毫升注射器。现在可以准备组装夹具装置了。按照此处所示设置管路和输液泵。将葡萄糖和胰岛素注射器放置在注射泵上。夹闭管路，让大鼠在开始实验前休息 30 分钟。开始实验操作时，采集基础胰岛素和血细胞比容样本；血细胞比容采样可确保实验过程中血容量维持稳定。通常，血细胞比容水平下降不应超过初始值的10%。采集基础血糖样本，并测定待钳夹的血糖水平。此处我们将血糖水平钳制在5毫摩尔/升。每次采集血样后，用少量每毫升含10单位肝素的生理盐水冲洗动脉导管，以防止凝血。在确定需钳制的葡萄糖水平后，开始输注胰岛素溶液。每5到10分钟记录一次血糖，并根据需要调整葡萄糖输注速率，直至达到稳态。该过程通常需要通过反复试验进行，可能耗时从30分钟到两小时以上不等。维持血糖水平所需的葡萄糖量取决于具体的实验方案。要被视为达到稳态，需满足特定物种和条件，即连续三次读数均落在预设范围内。若三次读数彼此相差约一毫摩尔，则表明葡萄糖水平已达到稳态记录。为维持血糖水平在30分钟内稳定所需的葡萄糖输注速率，在此期间至少还需采集额外的血液样本。在钳夹过程结束后，应采集第二份血浆胰岛素和血细胞比容样本。动物可继续用于后续实验，或实施安乐死后采集组织以进行进一步分析。如果操作得当，根据动物情况，导管可保持通畅五至七天。钳夹法可测量稳态胰岛素敏感性。必须记录胰岛素和葡萄糖水平，以及葡萄糖输注速率和血细胞比容值。当葡萄糖水平在30分钟内保持在相差1毫摩尔以内的范围内时，即达到稳态。葡萄糖输注速率反映了在可能的情况下维持目标血糖水平所需的外源性葡萄糖量，该速率应随时间绘制曲线，而非仅取单个时间点的平均值。应同时报告空腹状态和胰岛素钳夹期间的胰岛素水平。这些指标可证实胰岛素已成功递送，并能检测不同处理组之间胰岛素反应的差异。在实验开始前测量血细胞比容水平，并在操作后再次测量，以确保在整个实验过程中血细胞比容水平下降未超过基线值的5%。遵循此操作流程。其他方法，如使用同位素示踪剂，可用于评估整体及特定组织的葡萄糖利用情况。

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