Name: 酶标菜生物膜形成实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-30T18:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: 学习使用酶标板快速检测细菌和真菌早期生物膜形成的方法。通过结晶紫染色实现定性定量分析，适用于高通量筛选和抗生物膜药物研究。

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感谢 Sherry Kuchma、Pete Newell 和 Robert Shanks 提供图 1 中的图像。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01AI083256 支持，项目负责人为 G.A.O。

1. 生物膜的培养
<ol>
<li>在丰富培养基（如 LB 培养基）中过夜培养野生型 Pseudomonas aeruginosa 或突变株。</li>
<li>将过夜培养物按 1:100 的比例稀释至新鲜培养基中用于生物膜检测。一种用于 P. aeruginosa 的标准生物膜检测培养基是 M63 最小培养基，添加硫酸镁、葡萄糖和酪蛋白氨基酸（见表格）。作为另一种促进生物膜形成的替代培养基，可仅以精氨酸作为唯一碳源和能源，以减少浮游生长并形成更牢固的生物膜。</li>
<li>在 96 孔板中每孔加入 100 μL 稀释液。进行定量检测时，每个处理组通常设置 4–8 个重复孔。</li>
<li>将微孔板在 37°C 下孵育 4–24 小时。</li>
</ol>
2. 生物膜染色
<ol>
<li>孵育结束后，将培养板倒置并倾出液体，弃去细胞。</li>
<li>将培养板轻轻浸入盛有水的小容器中（例如，可使用 P1000 移液枪吸头盒的底部作为容器），摇晃去除水分。重复此过程一次。该步骤有助于去除未贴壁的细胞及培养基成分，避免在后续染色步骤中产生非特异性染色，显著降低背景染色。</li>
<li>向微孔板的每个孔中加入 125 μL 的 0.1% 结晶紫水溶液。配制溶液时需佩戴手套和实验服。称量结晶紫粉末时应小心，因其具有吸湿性，且易染色衣物、皮肤等。</li>
<li>将微孔板在室温下孵育 10–15 分钟。</li>
<li>按照上述方法，将培养板浸入水中清洗 3–4 次，摇去水分后用力在纸巾堆上拍干，以彻底去除多余的细胞和染料。</li>
<li>将微孔板倒置，干燥数小时或过夜。</li>
<li>对于定性检测，可在干燥后对孔板进行拍照记录。</li>
</ol>
3. 生物膜的定量分析
<ol>
<li>向微孔板的每个孔中加入 125 μL 水中 30% 的乙酸溶液，以溶解结晶紫。</li>
<li>将微孔板在室温下孵育 10–15 分钟。</li>
<li>将 125 μL 溶解后的结晶紫转移至新的平底微孔板中。</li>
<li>使用水中 30% 乙酸作为空白对照，在 550 nm 波长下用酶标仪测定吸光度。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2437/2437fig1.jpg" alt="蛋白质纯化实验结果，包括试管和微孔板中的样品；光谱学比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 展示了所进行的生物膜形成实验的代表性结果 铜绿假单胞菌, Pseudomonas fluorescens 和 金黄色葡萄球菌. (A) 带有铜绿假单胞菌生物膜的孔的侧面示意图 aeruginosa （8 小时， 37°C）。(B) 带有生物膜的孔的侧面视图 P. fluorescens （6 小时， 30°C）。(C) 生物膜形成的俯视图 S. aureus 在平底微量滴定板中（两孔，24 小时， 37°C). P. aeruginosa 和 P. fluorescens 均为可运动生物，并在气-液界面形成生物膜。S. aureus 无运动性，在孔板底部形成生物膜。

<ol><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signalling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Toole%2C+GA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).</li>
<li>Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadB+is+required+for+the+transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).</li>
<li>Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+lock+solutions+influence+staphylococcal+biofilm+formation+on+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces.</a> Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).</li>
<li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).</li>
<li>Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+requires+an+ABC+transporter+and+a+large+secreted+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein.</a> Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).</li>
<li>Mack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transposon+mutants+of+biofilm-producing+Staphylococcus+epidermidis+impaired+in+the+accumulative+phase+of+biofilm+production%3A+genetic+identification+of+a+hexosamine-containing+polysaccharide+intracellular+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin.</a> Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该方法可经修改后用于多种微生物。运动型微生物通常附着在孔壁和/或孔底，而非运动型微生物通常仅附着在孔底。每种微生物形成生物膜的最佳条件（即培养基、温度、培养时间）需通过实验确定。建议每种菌株或条件进行多次重复（4–8 次），并在每块板上设置阳性对照，若可能，同时设置阴性对照。

<table><tbody><tr><td>1 X M63</td><td></td><td></td><td>按以下方法配制5X M63浓缩液：溶解15 g KH₂PO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，35克 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和10 g (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 在 1 L 水中。此储备液 d&amp;#8211;无需高压灭菌，可于室温保存。将5倍浓度储备液按1:5稀释，高压灭菌后冷却，再加入所需组分。</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>加入至终浓度为 1 mM。用纯水配制成 1 M 储存液，并进行高压灭菌。</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>加入至终浓度为0.2%。用去离子水配制成20%的储存液，并经高压灭菌。</td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>BD 生物科学</td><td>223050</td><td>加入至终浓度为0.5%。用纯水配制成20%的储存液，并进行高压灭菌。</td></tr><tr><td>精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131</td><td>加入至终浓度为0.4%。用纯水配制成20%的储存液，并经滤膜除菌。该替代性碳源/能源可替代葡萄糖和酪蛋白氨基酸</td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>BD 生物科学</td><td>353911</td><td>Falcon 3911，Microtest III，可拆卸酶标板，96孔，U型底，非无菌，非组织培养处理</td></tr><tr><td>微量滴定板盖</td><td>BD 生物科学</td><td>353913</td><td>盖子可用95%乙醇水溶液清洗后重复使用。</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229641000</td><td>配制成水中0.1%的溶液。</td></tr></tbody></table>

微量滴定板生物膜形成实验

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

生物膜是附着在表面的微生物群落，可在医疗、工业和自然环境中发现。事实上，在大多数环境中，微生物以生物膜形式生长可能是其主要的生长模式。成熟的生物膜具有一些明显特征：生物膜中的微生物通常被包裹在一种细胞外基质中，该基质为群落提供结构支持和保护；在生物膜中生长的微生物还具有特定的结构特征，通常由包含数千个细胞的巨集落组成，巨集落周围分布着充满液体的通道；此外，生物膜中的微生物还以对多种抗菌剂（包括临床上重要的抗生素）具有强耐受性而著称。
微量滴定板实验是研究生物膜形成早期阶段的重要工具，主要用于细菌生物膜的研究，尽管该实验也已被用于研究真菌生物膜的形成。由于该实验采用静态、分批培养条件，无法形成通常与流动腔系统相关的成熟生物膜。然而，该实验已成功鉴定出许多生物膜形成起始所必需的因素，例如鞭毛、菌毛、黏附素以及参与环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）结合与代谢的酶，同时也鉴定了参与胞外多糖合成的相关基因。此外，已有发表的研究表明，在微量滴定板中生长的生物膜确实会发展出某些成熟生物膜的特性，例如对抗生素的耐受性以及对免疫系统效应分子的抗性。
这种简单的微量滴定板检测法可使生物膜在微量滴定板的壁面和/或底部形成。该检测方法通量高，适用于遗传筛选，以及在不同生长条件下对多种菌株的生物膜形成能力进行测试。该检测方法的多种改良版本已被用于评估多种微生物的早期生物膜形成，包括但不限于假单胞菌、Vibrio cholerae、Escherichia coli、staphylocci、enterococci、mycobacteria 和真菌。
在本方案中，我们将重点介绍利用该检测方法研究模式生物Pseudomonas aeruginosa的生物膜形成。该检测通过结晶紫染料（CV）来测定生物膜形成的程度。然而，已有多种其他比色法和代谢染色法被报道用于微孔板检测中生物膜形成的定量分析。微孔板检测操作简便、成本低廉且具有高度灵活性，已成为生物膜研究中的关键工具。

该实验方法描述了一种快速检测细菌和真菌早期生物膜形成的手段。该方法以微量滴定板作为微生物形成生物膜的基质，并利用结晶紫染色对生物膜进行可视化观察。该实验可提供针对早期生物膜形成的定性或定量分析。

生物膜是附着在表面的微生物群落，广泛存在于医疗、工业和自然环境中。事实上，微生物在生物膜中的生活……

本实验的总体目标是在微孔板中建立并研究生物膜。首先将细菌培养物加入96孔板中，然后根据微生物种类选择适宜的温度和时间进行培养，以对生物膜进行染色。向每孔细菌中加入结晶紫，随后对细菌进行洗涤。最后对各孔进行拍照，并对细菌进行定量。最终，可通过测定结晶紫的含量，获得随时间推移生物膜积累与形成情况的结果。该方法的主要优势在于，它能够使研究人员快速评估细菌和真菌生物膜的形成情况。该方法还可用于高通量遗传筛选，或用于鉴定抑制生物膜形成的新型治疗化合物。准备5 mL野生型铜绿假单胞菌、产气肠杆菌或突变株的过夜培养物。在LB培养基中，将10微升菌液稀释至1毫升新鲜M63培养基中，该培养基为添加了镁、硫酸盐、葡萄糖和酪蛋白氨基酸的最低培养基。接着，用移液器将100微升稀释后的菌液分别转移至96孔圆底板的不同孔中。将该板在37摄氏度下孵育4至24小时，以促进生物膜的形成。生物膜形成后，将培养板从培养箱中取出，通过倒置培养板并摇出液体的方式弃去培养上清液。然后将培养板轻轻浸入盛有少量水的小容器中，以洗去可能引起背景染色的未结合细胞或培养基成分。摇去水分，用吸水纸轻拍培养板，重复洗涤一次。待培养板清洁后，每孔加入125微升0.1%结晶紫溶液。为染色细胞，将培养板在室温下孵育10至15分钟。然后按照之前的方法清洗平板三到四次。最后一次清洗后，将平板在一堆纸巾上用力拍干，以去除多余的液体，随后将平板倒置，继续倒置干燥数小时。平板干燥后，可使用数码相机拍摄各孔，以评估生物膜的质量。如图所示，运动型细菌（如左侧的产气假单胞菌和右侧的荧光假单胞菌）在生物膜生长过程中倾向于在气液界面处形成生物膜。相比之下，非运动型的口腔葡萄球菌则在孔板底部形成生物膜。为了定量分析生物膜，首先向每个孔中加入125 µL的30%乙酸，包括一个仅含乙酸的空白孔，然后将孔板在室温下孵育10至15分钟，使生物膜保留的结晶紫溶解。接下来，将每个孔中溶解的染料各125微升转移至新的平底96孔微孔板中。使用酶标仪在550纳米波长下测定每个孔的吸光度。每个孔中结晶紫的浓度与生物膜中的细胞数量成正比。该图展示了荧光假单胞菌在37摄氏度培养过程中随时间推移的生物膜形成与积累的定量结果。观看本视频后，您应能充分掌握如何开展96孔板生物膜实验，并了解其与其他方法（如显微镜观察）联用的技术要点。该方法可显著促进我们对生物膜形成过程的理解。

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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